Abstract

O objetivo foi investigar o significado clínico da expressão de proteínas scaffold CARMA3 romance em não-pequenas células cancro do pulmão (NSCLC) e a função biológica de CARMA3 em linhas celulares de NSCLC. Observou-se coloração moderada a alta CARMA3 em 68,8% dos 141 espécimes NSCLC em comparação com os tecidos normais correspondentes. A sobre-expressão de CARMA3 foi significativamente correlacionado com a fase TNM (P = 0,022) e o estado do tumor (P = 0,013). CARMA3 upregulation também correlacionada com uma menor taxa de sobrevivência de pacientes de estatuto nodal N0 (P = 0,042), bem como a expressão do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) (P = 0,009). Em casos positivos de mutação EGFR, expressão CARMA3 foi muito maior (87,5%) em relação a casos não-mutação (66,1%). Além disso, observou-se que knockdown de CARMA3 inibe a proliferação de células tumorais e invasão, e induz a paragem do ciclo celular na fronteira entre a fase G1 e S. Demonstramos ainda uma ligação directa entre CARMA3 e ativação de NF-kB. A mudança de comportamento biológico em células CARMA3 knockdown pode ser-kB do NF-relacionadas. Os nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, que CARMA3 foi sobre-expresso em NSCLC e correlacionada com a progressão do cancro do pulmão, a expressão do EGFR, e mutação do EGFR. CARMA3 poderia servir como um alvo potencial da droga companheiro, juntamente com NF-kB e EGFR em cancros do pulmão EGFR-mutante

Citation:. Li Z, Qu L, Dong Q, Huang B, Li H, Tang Z, et ai. (2012) sobre-expressão de CARMA3 em Non-Small-Cell Lung Cancer está ligado para a progressão do tumor. PLoS ONE 7 (5): e36903. doi: 10.1371 /journal.pone.0036903

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 15 de novembro de 2011; Aceito: 09 de abril de 2012; Publicado em: 15 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 30.972.967) e Fundo de Investigação para o Programa de Doutorado da Educação Superior da China (No. 20092104110018). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

CARMA3 (também conhecido como CARD10 ou Bimp1) pertence à família CARMA e contém três membros, CARMA1 (também conhecido como CARD11), CARMA2 (CARD14), e CARMA3. Estas três proteínas partilham motivos estruturais semelhantes, contêm um domínio CARD, uma homologia Src 3 (SH3) domínio, os domínios de um ou vários PDZ, e um domínio Guk. No entanto, eles apresentam perfis distintos de expressão; CARMA1 é expresso em células hematopoiéticas, CARMA2 na placenta, e CARMA3 em todas as células não-hematopoiéticas [1] – [4]. Estudos recentes têm demonstrado que CARMA3, como uma proteína de andaime, desempenha um papel crítico na ligandos de GPCR e a activação de PKC induzida por NF-kB [5] – [8]. Foi previamente demonstrado que a activação de NF-kB está envolvida na tumorigénese e no desenvolvimento de neural, coração, e doenças imunológicas [9] – [13]. CARMA3 activa NF-kB através do recrutamento de Bcl10 e MALT1, duas proteínas indispensáveis ​​que são necessários para GPCR e a activação de PKC induzida por NF-kB [6], [14] – [16]. O eixo de sinalização PKCa-CARMA3 desempenha um papel essencial na induzida pelo LPA de células do cancro do ovário na invasão in vitro [17]. Um estudo recente demonstrou que a deficiência CARMA3 auditivos proliferação de células do cancro, in vitro e in vivo, e inibiu a sobrevivência, migração e invasão do cancro da mama em linhas celulares MDA468 e A431 [18] humana. CARMA3 knockdown causou acentuada inibição da SDF-1α invasão mediada de células de carcinoma epidermóide de células TB2-T4 [7]. No entanto, a expressão da proteína de CARMA3 em tecidos de câncer de pulmão e o papel potencial da CARMA3 no comportamento biológico das células de câncer de pulmão não foram exploradas. Assim, examinamos a expressão de CARMA3 em tecidos de câncer de pulmão e sua relação com vários parâmetros clínico. Além disso, avaliou-se a associação de expressão CARMA3 com a proliferação e potencial metastático de várias linhagens de células NSCLC.

Materiais e Métodos

Pacientes e espécimes

Este estudo foi aprovado pelo Comité da China Medical University de Ética e consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente. 141 casos de amostras de NSCLC foram obtidos a partir do primeiro hospital afiliado da China Medical University, durante o período de 2008 a 2011. O diagnóstico histológico e grau de diferenciação dos tumores foram definidos pela avaliação das secções de tecido hematoxilina e corados-eosina, de acordo com as diretrizes da Organização Mundial de Saúde de classificação. Todos os 141 espécimes foram reavaliados em relação aos seus subtipos histológicos, estado de diferenciação, e os estágios tumorais. Para amostras de NSCLC, a SCC e adenocarcinoma foram identificadas em 65 e 76 dos 141 casos, respectivamente. Metástases linfonodais foram observadas em 68 dos 141 pacientes. O sistema taging p-TNM da União Internacional Contra o Câncer (7th Edition) foi utilizada para classificar as amostras como estágios I (n = 64), II (n = 41), III (n = 30) e IV (n = 6) .

Linhas Celulares

A549, H1299, H460 HBE e foram obtidos de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA), LK2 foi obtido a partir do Cancer Research Resources Banco japonês (Tóquio, Japão), SPC foram obtidos a partir CCTCC (Centro chinês de Cultura Conserve típica, Wuhan, República Popular da China), H157 foi comprado de Cell Bank, da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), o BE1 e LH7 foram presentes de Dr. Jie Zheng (faculdade de Medicina, Universidade de Pequim, China) .As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina (Sigma, St. Louis, MO , EUA), e 100 ug /ml de estreptomicina (Sigma). As células foram cultivadas em placas de cultura de tecidos estéreis e foram passadas a cada 2 dias, utilizando 0,25% de tripsina (Invitrogen).

A imuno-histoquímica

espécimes de tumores excisados ​​cirurgicamente foram fixadas com 10% de formalina neutra, embebidos em parafina e foram preparadas 4 mm de espessura. A imunocoloração foi realizada utilizando o método do complexo avidina-biotina peroxidase (Ultra Sensível TM, Maixin, Fuzhou, China). Os cortes foram desparafinados em xileno, re-hidratadas em série de álcoois graduados e fervidas em tampão de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 2 minutos numa autoclave. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando peróxido de hidrogénio (0,3%), que foi seguido de incubação com soro de cabra normal para reduzir a ligação não específica. As secções de tecido foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho CARMA3 (diluição 1:80) (Sigma). Imunoglobulina de murganho (com a mesma concentração do anticorpo específico de antigénio) (Maixin, Fuzhou, China) foi utilizado como um controlo negativo. Coloração para todos os anticorpos primários foi realizada à temperatura ambiente durante 2 horas. HRP-polímero conjugado anti-rato /IgG de coelho (pronto a utilizar) (Maixin, Fuzhou, China) foi usado como o anticorpo secundário. Após a lavagem, as secções foram incubadas com conjugado de peroxidase de rábano-estreptavidina-biotina, seguido de 3, 3′-tetracloridrato de diaminobenzidina a desenvolver a reacção de peroxidase. Contracoloração das secções foi feito com hematoxilina, que foram então desidratadas em etanol antes mounting.Two investigadores independentes examinaram todos os slides tumorais aleatoriamente. Cinco pontos de vista foram examinados por lâmina, e 100 células foram observadas per view em 400 × ampliação. Normal epitélio brônquico presente nas secções de tumor foi usado como controlo negativo. Imunocoramento CARMA3 foi marcado seguindo uma escala semi-quantitativa, avaliando em áreas tumorais representativas, a intensidade ea porcentagem de células que mostram imunocoloração maior do que as células controle. coloração citoplasmática das células tumorais foi considerado como imunocoloração positiva. A intensidade da coloração citoplasmática CARMA3 foi também pontuada como 0 (sem coloração), 1 (fraca), 2 (marcado). contagens percentuais foram designados como 1- 1-25%, 26-50% 2- e 3- 51-100%. Os escores de cada amostra de tumor foram multiplicados para dar uma pontuação final de 0-6 e a expressão total de CARMA3 foi determinada como qualquer expressão negativa ou baixa (-): pontuação 3 ou expressão positiva ou expressão alta (+): Pontuação ≥3.

(a) expressão CARMA3 forte no adenocarcinoma de pulmão (400 ×). (B) a expressão CARMA3 fraco no adenocarcinoma de pulmão (400 ×). (C) a expressão CARMA3 forte no carcinoma de células escamosas de pulmão (400 ×). (D) a expressão CARMA3 fraco no carcinoma epidermóide de pulmão (400 ×). (E) epitélio brônquico normal mostrando coloração fraca para CARMA3 (400 ×). (F) Os controlos negativos para coloração CARMA3 com anticorpo IgG de rato não imune (400 ×).

coloração imuno-histoquímica para CARMA3 e EGFR em amostras de NSCLC 2 representativos. Uma mostraram forte expressão de CARMA3 (A) e forte expressão de EGFR (400 ×) (B). O outro estudo mostrou fraca expressão de CARMA3 (400 ×) (C) e fraca expressão de EGFR (400 ×) (D). (E, F) Correlação de CARMA3 e expressão EGFR em amostras de NSCLC com mutação EGFR (400 ×).

Análise do EGFR mutação

As secções de parafina de espécimes 75 NSCLC para mutação EGFR análise foram obtidos a partir de primeiro Hospital Afiliado da China Medical University, entre 2009 e 2011. Resumidamente, o DNA foi extraído de cortes de tecido embebidos em parafina usando TaKaRa DEXPAT Easy Kit (Takara Biotecnologia, Dalian, China) de acordo com o protocolo do fabricante. mutações EGFR foram detectados utilizando o kit de detecção de mutações EGFR (GP Medical Technologies, Beijing, China) em 7900HT rápido Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia).

Quantitative PCR em tempo real (SYBR Green método)

quantitativa PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) num volume total de 20 uL em 7900HT rápido real-Time PCR System (Applied Biosystems) como se segue: 95 ° C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 30 segundos. Um passo de dissociação foi realizada para gerar uma curva de fusão para confirmar a especificidade da amplificação. β-actina foi utilizado como o gene de referência. Os níveis relativos de expressão de genes foram representados como referência -Ct gene ΔCt = Ct, e a mudança de dobragem da expressão do gene foi calculada pelo método 2-ΔΔCt. O iniciador sequências são fornecidos na Tabela S1, as experiências foram repetidas em triplicado.

Análise Western Blot

Total de proteínas a partir de tecidos e linhas de células primárias foram extraídas em tampão de lise (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) e quantificada através do método de Bradford. Cinquenta microgramas de proteína foram separadas por SDS-PAGE (12%). Após a transferência, o fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EUA) foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos seguintes CARMA3 (1:200; Sigma), Bcl-10 e β-actina (1:500 ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-IKK, anti-fosfo-IkB, anti-fosfo-Rb, anti-P27 e anti-Ciclina A, anti-Ciclina D1, anti -Cyclin D3, anti-CDK4 e anti-CDC6 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Após incubação com acoplado com peroxidase anti-rato ou IgG de coelho (Santa Cruz Biotechnology) a 37 ° C durante 2 horas, as proteínas ligadas foram visualizadas utilizando ECL (Thermo Fisher Scientific) e detectados utilizando sistemas bioimaging (UVP Inc., Upland, CA, EUA). Os níveis de proteína relativos foram calculados com base em β-actina como o controle de carregamento.

pequeno RNA de interferência Tratamento

Dharmacon siGENOME SmartPool siRNA para CARMA3, Bcl10 e Dharmacon siGENOME Non-targeting siRNA # 1 foram comprado de Dharmacon (ThermoFisher Scientific). Para transf ecções, as células foram semeadas numa placa de 24 poços 24 h antes do experimento. As células foram transfectadas com ARNsi utilizando o DharmaFECT 4 (0,20 uL /​​poço; ThermoFisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. A seguir à transfecção, o ARNm e os níveis de proteína foram avaliadas 48 horas mais tarde.

A proliferação da célula de ensaio

ensaio de proliferação celular foi realizada por meio de contagem celular Kit-8® solução (Dojindo, Gaithersburg, MD) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas a uma concentração de 5 × 10

3 células /100 uL /​​poço em placas de cultura de 96 poços e tratadas com 10 ul /poço de solução de contagem celular Kit-8® durante as últimas 4 horas da cultura. A densidade óptica dos poços foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.

Colony Formation Ensaio

Para os ensaios de formação de colónias, as células foram cultivadas em 6 pratos cm a uma densidade de 5000 células /prato , e transfectadas com CARMA3, Bcl10, ou ARNsi de controlo negativo. As colónias foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas e coradas com violeta de cristal-formaldeído 13-15 dias após a transfecção. Todas as experiências foram repetidas, independentemente, um mínimo de três vezes sob condições idênticas.

(A) análise de transferência de Western de expressão CARMA3 em células de cancro do pulmão transfectadas com ARNsi. (B) perfil de expressão CARMA3 relativa num painel de linhas celulares derivadas das vias respiratórias humanas avaliada por PCR em tempo real.

Taxa de (A) o crescimento celular foi determinada pelo ensaio de CCK-8, tal como descrito em Secção 2. Os dados são média ± SD de três experiências independentes. células (painel superior) e A549 H1299 (B) transduzidas com ARNsi de controlo, CARMA3, ou Bcl10 foram submetidos a ensaio de formação de colónia. (Painel inferior) quantificação Histograma. As barras de erro indicam ± SD (* p 0,05, ** p 0,01)

(superior) e CARMA3 tratamento Bcl10 siARN inibiu a invasão de células mensurável em ambas as linhas celulares (200 ×).. (Inferior) O gráfico de barras indica a média e a diferença no número de células entre as fotografias, e o desvio-padrão foi calculado a partir da média de células nos 10 campos (**, P 0,01)

Matrigel invasão ensaio

ensaio de invasão celular foi realizada usando uma câmara de 24 poços Transwell com um tamanho de poro de 8 um (Costar, Cambridge, MA). As pastilhas foram revestidas com 20 ul de Matrigel (01:03 diluição, BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas e 3 × 10

5 células em 100 ul de meio isento de soro foi transferido para a câmara de Matrigel superior e incubou-se durante 16 horas. Após a incubação, as células não invadidos na superfície superior da membrana foram removidos com uma ponta de algodão, e as células que passaram através do filtro foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com hematoxilina. O número de células foi contado invadidas em 10 campos de alta potência seleccionados aleatoriamente sob o microscópio. Esta experiência foi realizada em triplicado.

celular Cycle Analysis

As células (500.000) foram semeadas em 6 cm placas de cultura de tecidos. Após 12 h de incubação, as células foram transfectadas com quantidades indicadas de siRNA. As células foram fixadas com etanol a 75% 48 h após a transfecção, lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e coradas em 5 mg /ml de iodeto de propidio em PBS suplementado com ARNase A (Roche, Indianapolis, IN) durante 30 minutos à temperatura ambiente . Os dados foram coletados por meio de sistemas de BD

Luciferase Assay

As células foram inicialmente transfectadas com CARMA3, Bcl10, ou siRNAs de controlo negativo para 24 h.; As células foram depois co-transfectadas com 500 ng de plasmídeo repórter PNF-kB-Luc, e 100 ng de luciferase de Renilla plasmídeo durante 24 h. As células foram tratadas durante 30 min com ou sem EGF (100 ng /ml), e, em seguida, lisadas; a actividade da luciferase foi determinada com um sistema de ensaio de luciferase dupla repórter (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. atividade de NF-kB foi avaliada mediante a normalização da actividade da luciferase de vaga-lume de Renilla atividade luciferase. As experiências foram realizadas em triplicado em três experimentos independentes.

Análise Estatística

SPSS versão 16.0 para Windows foi utilizado para todas as análises. O teste do qui-quadrado foi usado para examinar possíveis correlações entre a expressão CARMA3 e fatores clínico-patológicas. As curvas de Kaplan-Meier foram utilizadas para análise de sobrevivência, e log-rank foi determinada com base nas diferenças. O teste t de Student foi utilizado para comparar outros dados. Os valores de p foram com base na análise estatística de dois lados, e p . 0,05 foi considerado como indicativo de significância estatística

células H1299 e A549 (superior) (A) foram tratadas com siRNA específico-CARMA3 durante 48 h . Em seguida, as células foram colhidas e tratadas com RNase, e coradas com PI. A distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. (Inferior) A percentagem de células em G1, S, G2 em fase de histogramas. (* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001) comparativamente ao grupo de controlo. Os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes. células H1299 e A549 (B) foram tratadas com siRNA específico-CARMA3 durante 48 h. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de imunotransferência utilizando anticorpos indicados.

células H1299 e A549 (A) foram transfectadas com o controlo ou específico de CARMA3 ARNsi durante 24 h, em seguida, tratados com NF-kB-luciferase e controle

Renilla

plasmídeos repórter durante 24 h. As células foram tratadas com ou sem EGF (100 ng /ml) antes da colheita, e a indução de NF-kB resultante foi medido através do cálculo da razão de luciferase /

Renilla. Dados (mean_S.E.) São de pelo menos três determinações separadas. (** P 0,01) (B) células H1299 e A549 foram transfectadas com uma piscina de siRNA alvejando CARMA3 durante 48 h, depois tratou-se com EGF (100 ng /ml) durante os períodos de tempo indicados. lisados ​​celulares totais foram preparados a partir destas células e então submetido a immunoblotting análise com os anticorpos indicados.

Resultados

Significado Clínico da CARMA3 expressão da proteína no NSCLC tecidos

analisaram os níveis de expressão de proteína de CARMA3 usando imuno-histoquímica de 91 espécimes NSCLC e os seus correspondentes tecidos normais. CARMA3 verificou-se ser predominantemente expressa no compartimento citoplasmático. epitélios brônquica normal exibiram coloração CARMA3 negativo ou fraca (Fig. 1E), enquanto CARMA3 coloração foi significativamente mais forte em tecidos de câncer de pulmão. Encontrámos coloração moderada a alta CARMA3 em 69% dos espécimes de cancro do pulmão (Fig. 1A e C). Nós também usamos western-blotting para analisar a expressão de CARMA3 em 18 resultados casos.A mostram que 56% das amostras de câncer de pulmão mostram moderada a alta expressão CARMA3 (Figura S2, S3).

A correlação entre CARMA3 expressão e os clinicopathologicfactors de NSCLC é mostrada na Tabela 1. superexpressão CARMA3 exibiu uma correlação significativa com estágio TNM (P = 0,022) e do estado do tumor (P = 0,013), mas nenhuma correlação foi observada quanto à idade, sexo, diferenciação de metástases linfáticas e histologia do tumor. Para melhor reivindicar a correlação de CARMA3 com a progressão do cancro do pulmão, foi avaliada a relação entre a expressão de CARMA3 e sobrevida global dos pacientes com NSCLC fase N0 (38 CAMRA3 + e 16 CAMRA3 -). Após análise de sobrevivência de Kaplan-Meier, descobrimos que os pacientes com baixa expressão de CARMA3 teve uma maior sobrevida estatisticamente significativa (sobrevivência mediana = 32 ± 3,80 meses; 95% intervalo de confiança 24.56-39.44 meses) do que aqueles com alta expressão de CARMA3 (sobrevivência mediana = 20 ± 3,91 meses; 95% intervalo de confiança 12,33-27,67 meses, p = 0,042;. Figura S4)

Um estudo relatado recentemente demonstraram que a expressão CARMA3 é necessário para a activação de NF-kB induzida EGFR [15]. a sobre-expressão de EGFR tem sido demonstrada em muitos cancros humanos, incluindo os de pulmão, cólon, pâncreas, mama, ovário, bexiga, rim, e o sistema nervoso [19], [20]. Assim, foi examinada a relação entre a expressão CARMA3 e estado EGFR em NSCLC. Descobrimos que o EGFR foi expresso na membrana celular e citoplasmático. Uma correlação significativa entre a expressão CARMA3 e expressão do EGFR foi observada (P = 0,009) nas amostras de NSCLC (Tabela 1 e Fig. 2A-D). Para determinar se a mutação do EGFR está correlacionada com a expressão elevada CARMA3, foi investigada a relação entre a expressão e mutação do EGFR CARMA3. Foi utilizado um kit de detecção de mutações EGFR, e encontraram 16 de 75 amostras tumorais foram positivas para a mutação EGFR (Tabela S2). Entre os 16 casos, 87,5% apresentaram expressão CARMA3 positiva, uma taxa muito mais elevada em comparação com os casos não-mutação (66,1%). Descobrimos que casos 86,67% EGFR positivo de mutação também exibiu expressão CARMA3 positiva (Fig. 2E e F).

CARMA3 contribui para o câncer de pulmão de células Crescimento e invasão

Em primeiro lugar, examinou a expressão de CARMA3 em várias linhas celulares de cancro de pulmão, como mostrado na Fig. 3B, H1299, A549, BE1 exibiram níveis de expressão elevados de CARMA3 enquanto que as células normais do epitélio brônquico (HBE), LK2, e LH7 exibiram níveis inferiores de expressão CARMA3. SPC, H157 e H460 apresentaram níveis moderados de expressão CARMA3.

A seguir, empregou uma abordagem interferência de RNA para determinar se CARMA3 e CBM complexo (CARMA3-Bcl10-MALT1) desempenha um papel no crescimento de células cancerígenas. Os níveis de expressão e CARMA3 Bcl10 permaneceram inalterados após transfecção transitória com o ARNsi de controlo negativo, enquanto que CARMA3- ou ARNsi específicos de Bcl10 suprimiu significativamente tanto ARNm, bem como os níveis de expressão da proteína no H1299 e linhas de células A549 (Fig. 3A e a Fig. S1 ). Em seguida, foi examinada a taxa de crescimento celular. Com CARMA3 ou Bcl10 siRNA, H1299 células exibidas reduziu as taxas de crescimento em comparação com o controlo negativo (Fig. 4A). Semelhante a células H1299, descobrimos que knockdown de CARMA3 ou Bcl10 também reduziu a taxa de crescimento das células A549 (Fig. 4a). Utilizou-se um método independente, ensaios de formação de colónias, para validar os efeitos anti-proliferativos de CARMA3 ou inibição Bcl10 em células de cancro de pulmão. CARMA3- ou Bcl10-alvo ARNsi levou a uma redução clara da capacidade de formação de colónias de duas linhas celulares de cancro de pulmão testadas em comparação com células de controlo tratadas com siRNA (Fig. 4B). Estes estudos de perda de função demonstrado que a CARMA3 e CBM siRNAs poderia inibir a proliferação de células tumorais em relação a Sinc irrelevante. Para analisar se CARMA3 e Bcl10 contribuir para a capacidade invasiva de células não-pequenas de câncer de pulmão de células, realizamos ensaios de invasão de Matrigel. Os nossos resultados demonstraram que as capacidades invasivas das células cancerosas e CARMA3- H1299 Bcl10-knockdown foram reduzidas em comparação com as células de controlo negativo (Fig. 5). Da mesma forma, o knockdown de CARMA3 Bcl10 ou em células A549 também reduzidas as capacidades invasivas destas células (Fig. 5). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que CARMA3 e complexo CBM são a invasão de células reguladores positivo.

CARMA3 de exclusão resulta em paragem G1 ea inibição do crescimento de células de câncer de pulmão

ciclo celular análises de células activadas por fluorescência (FACS) foram realizadas em células de cancro, com ou sem CARMA3-knockdown, e verificou-se que a percentagem de células na fase G1 foi aumentada e as células na fase S foi diminuída em células com CARMA3-knockdown em comparação com células de controlo (Fig. 6 A). Estes resultados sugerem que CARMA3 eliminação induz a paragem do ciclo celular em G1 /S limite. Para investigar o mecanismo subjacente a indução da paragem do ciclo celular, testou-se o efeito do knockdown em CARMA3-ciclina A, ciclina D1, ciclina D3, CDK4, CDK6, P27, e os níveis de P-RB. Tal como mostrado na (figura 6 B), análise por Western blot revelou que o knockdown de CARMA3 diminuiu os níveis de proteína da ciclina D1, CDK4, CDK6, e P-RB, mas aumentou os níveis de p27. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a inibição da expressão CARMA3 induz a paragem do ciclo celular na fase G1 e suprime o crescimento de células de cancro de pulmão.

Supressão de CARMA3 Inibe p-IkB e NF-kB Activação

para determinar se CARMA3 medeia EGF-estimulado a activação de NF-kB em células de câncer de pulmão, foi utilizado H1299 e A549 células. As células que tinham sido submetidos a tratamento CARMA3 siARN exibiram inibição de NF-kB na presença ou na ausência de EGF. Da mesma forma, os nossos resultados demonstraram que mediada por siARN Bcl10-knockdown inibiram a expressão da luciferase de NF-kB (Fig.7 A). Os resultados do estudo demonstram claramente o papel essencial da CARMA3-Bcl10-MALT1 complexo de sinalização induzida por EGF na activação do NF-kB em células de cancro de pulmão. Para verificar ainda mais o papel da expressão CARMA3 em induzida por EGF da activação de NF-kB em células cancerosas, células H1299 e células A549 transduzidas com CARMA3 siRNA foram estimuladas com EGF. Observou-se um bloqueio na capacidade de EGF para induzir p-IkB concomitante com knockdown de CARMA3, mas a fosforilação induzida por EGF de IKK não foi afectada em células CARMA3-deficiente. Além disso, o knockdown CARMA3 não prejudicou a fosforilação induzida por EGF de ERK (Fig.7 B). Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstram que CARMA3, via IkB fosforilação, medeia induzida por EGF activação de NF-kB em células de câncer de pulmão.

Discussão

Neste estudo, foi avaliado o padrão de expressão e biológica papel do CARMA3 proteínas scaffold romance em NSCLC humano. Nossos resultados demonstraram que a expressão da proteína CARMA3 em tecidos de cancro do pulmão é superior em comparação com correspondentes tecidos pulmonares normais. Ao nível da proteína, a expressão CARMA3 foi restringida para o citoplasma em todas as amostras. Encontramos uma correlação significativa entre CARMA3 aumento da regulação e ambos estágio TNM e estado tumor. Além disso, demonstramos que CARMA3-regulação também se correlacionou com uma taxa de sobrevivência mais curto de pacientes de N0 estatuto nodal bem como o estado EGFR. CARMA3 foi anteriormente demonstrado desempenhar um papel central na activação do EGFR induzida de NF-kB [18]. mutação do EGFR é significativamente correlacionada com a expressão elevada de EGFR, a sua sinalização a jusante, e a resposta clínica ao tratamento com gefitinib [21]. Assim, examinamos ainda mais a relação entre a expressão CARMA3 e mutação EGFR. Descobrimos que a expressão de CARMA3 é significativamente maior nos casos de mutação do EGFR em comparação com casos não-mutação. Estes resultados sugeriram que CARMA3 pode desempenhar um papel importante no cancro do pulmão EGFR mutante. Um relatório recente demonstrou que knockdown de vários componentes do NF-kB via de morte celular induzida especificamente aumentada pela TKI de EGFR erlotinib em células de cancro de pulmão de EGFR mutante [22]. Como a sobre-expressão de proteínas induz CARMA3 robusta activação do NF-KB [3], [4], CARMA3 e NF-kB podem servir como potenciais alvos companheiro de droga, juntamente com o EGFR no cancro do pulmão EGFR mutante.

tem sido CARMA3 relatado para promover a progressão de células de cancro do ovário [17], para aumentar o crescimento de células de câncer de mama humano e invasão [18], induzir a invasão do carcinoma de células escamosas oral (CCEO) [23]; CARMA3 também desempenha um papel importante na aterogénese [24] e da activação de NF-kB em células epiteliais das vias aéreas [25]. No entanto, o papel funcional permanece pouco claro. Para elucidar a função biológica de CARMA3 no cancro do pulmão, foram empregados siRNA para knockdown expressão CARMA3 em ambos A549 e linhas de células H1299, que expressam elevados níveis de CARMA3. Observou-se a capacidade de proliferação diminuída em ambos A549 e células H1299 após CARMA3 knockdown. Knockdown de Bcl10, que é outro componente do complexo de CBM, a proliferação celular também prejudicada. Assim, CARMA3 siRNA knockdown potencialmente prejudica a proliferação de células malignas através da destruição do complexo CARMA3-Bcl10-MALT1. A maioria dos factores de crescimento de células proliferativas influenciar por acção sobre a progressão do ciclo celular. Neste estudo, ciclo celular análises revelaram que a percentagem de células na fase G1 foi aumentada, enquanto que a percentagem de células na fase S foi diminuída em células knockdown-CARMA3 em comparação com células de controlo. Knockdown de CARMA3 inibiu a transição G1 para S no ciclo celular, o que sugere o papel desempenhado por CARMA3 na proliferação de células do cancro do pulmão. a progressão do ciclo celular é modulada por um certo número de moléculas. Para determinar o mecanismo potencial de CARMA3 relativa regulação do ciclo celular, examinámos o efeito do knockdown CARMA3 em moléculas relacionadas com o ciclo celular. Analisou-se os níveis de ciclina A, ciclina D1, ciclina D3, CDK4, CDK6, p-Rb, e P27 e descobriram que knockdown de CARMA3 diminuiu os níveis de proteína da ciclina D1, CDK4, CDK6, e P-RB, mas aumentou os níveis de p27. A ciclina D1, que conduz a progressão de células proliferativas em estágios do ciclo celular, desempenha um importante papel na tumorigénese. A ciclina-D /CDK4, 6 /pRB via tem sido anteriormente demonstrado para ser alterado em mais de 80% dos tumores humanos [26], [27]. É um regulador chave de G1 para S crítico de transição de fase do ciclo celular. Durante a fase G1, pRB é inactivado por eventos de fosforilação sequenciais mediadas por várias quinases dependentes de ciclina (CDKs), levando à libertação dos factores de transcrição E2F, a activação de muitos genes, e a progressão do ciclo celular [28]. A p27 inibidor de quinase dependente de ciclina (também chamado KIP1) é uma proteína inibidora do crescimento que a progressão do ciclo celular em blocos da transição G1 /S [29]. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que CARMA3 controla o ciclo celular através da regulação da ciclina D1, CDK4, CDK6, p-Rb, e p27.

Tornou-se cada vez mais claro que a sinalização de NF-kB desempenha um papel crítico no cancro desenvolvimento e progressão [30] – [34]. Nossos resultados demonstram ainda uma ligação directa entre CARMA3 e ativação de NF-kB. A mudança de progressão do ciclo celular após CARMA3 knockdown é potencialmente relacionados com a NF-kB. NF-kB é objecto de numerosos estudos de pesquisa farmacêuticas como um alvo para terapia anti-cancro. Bloqueio de NF-kB prende potencialmente a proliferação de células tumorais e provoca a apoptose, ou aumenta a sensibilidade à acção de agentes anti-tumorais. O presente estudo demonstrou que CARMA3 knockdown inibe a activação de NF-kB, bloqueando assim a progressão do câncer de pulmão e sugerindo a importância potencial desta descoberta para novas terapias contra o câncer.

Câncer

pulmão é a principal causa de mortes por câncer nos Estados Unidos e no mundo. A principal forma de cancro do pulmão é NSCLC [35] .Apesar avanços na detecção precoce e tratamento padrão, NSCLC é muitas vezes diagnosticada em fase avançada e tem um prognóstico pobre. Descobrir biomarcador valiosa para a detecção de NSCLC numa fase precoce pode melhorar a sobrevivência substancialmente. Agora, existem diversos biomarcadores potencialmente úteis para o cancro do pulmão foram verificados, como o CEA, CA-125, Cyfra 21-1, TPA [35] – [39]. Mais e mais novos biomarcadores potenciais para o câncer de pulmão foram descobertos, como SAA, DDH, EGFR, Mig-6 [40] – [43]. Nesta pesquisa, encontramos CARMA3 como outro biomarcador potencialmente útil para o cancro do pulmão. Identificações de biomarcadores estão levando a uma maior compreensão das vias moleculares envolvidas no câncer de pulmão e ajuda a reduzir o sofrimento e perda de vidas causada pela doença letal [44].

Em conclusão, nosso estudo demonstrou que CARMA3 é overexpressed em NSCLC e se correlaciona com a progressão do câncer de pulmão. CARMA3 promove a proliferação do cancro do pulmão através da regulação do ciclo celular e regulação de NF-kB.

Informações de Apoio

Figura S1.

CARMA3 mRNA knockdown foi avaliada por RT-PCR quantitativo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0036903.s001

(JPG)

Figura S2. expressão

TheCARMA3 em 1 normal (92 #) e 17 amostras de tecidos NSCLC (400 ×)

DOI: 10.1371. /journal.pone.0036903.s002

(TIF)

Figura S3. a expressão da proteína

CARMA3 em NSCLC. Quantidades iguais de proteína total (60 ug) a partir de tecidos normais (92 #) e NSCLC foram analisados ​​por transferência de Western com um anticorpo anti-CARMA3 ou um anticorpo anti-actina β como controlo de carga. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes, em comparação com o controlo (92 #) amostras utilizadas na experiência foram as mesmas amostras utilizadas na Figura S2

doi:. 10.1371 /journal.pone.0036903.s003

(JPG)

Figura S4.

Sobrevivência do palco pacientes com NSCLC N0 correlaciona-se com a expressão de CARMA3. parcelas de sobrevivência de Kaplan-Meier para pacientes com NSCLC expressão da proteína e CARMA3. A correlação entre a sobrevivência global dos doentes com expressão CARMA3 foram consideradas estatisticamente significativa (P = 0,042). Todos os pacientes vivos ao último follow-up são indicadas por marcas no terreno

doi:. 10.1371 /journal.pone.0036903.s004

(JPG)

Tabela S1. .

As sequências dos iniciadores

doi: 10.1371 /journal.pone.0036903.s005

(DOC)

Tabela S2.

A expressão de CARMA3 e EGFR em 16 tecidos NSCLC com mutação EGFR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0036903.s006

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos Internacional edição Science (Shannon zona franca – West, Shannon, Co. Clare Irlanda) para a revisão crítica do manuscrito

.