Sumário

Recentemente, demonstrámos que tricosantina (TCS), um agente promissor para o tratamento de adenocarcinoma cervical, inibiu a proliferação de células HeLa por meio da via de sinalização /MAPK /CREB PKC. Além disso, a TCS regulada negativamente a expressão de Bcl-2 foi anulada por um oligonucleótido decoy (OGN) para o elemento de AMP-cíclico responsivo (CRE). O engodo OGN bloquearam a ligação da proteína de ligação a CRE (CREB) para Bcl-2. Estes resultados sugerem que a expressão do gene mediada por Cre pode desempenhar um papel essencial na proliferação de células HeLa. No entanto, pouco se sabe sobre o efeito da TCS em prisões do ciclo celular, em particular, se os genes envolvidos no ciclo celular foram regulamentados pela CRE. Nosso estudo mostra que a prisão de S, G1 e G2 /M fases foram acompanhadas pela infra-regulação significativa de ciclina A, D1 e CDK 2, 4 em células HeLa, ciclina D1, E e CDK 2, 4 em CaSki e células C33A, e ciclina a, B1, e e CDK 2 em células SW1990. No entanto, as prisões do ciclo celular foram revertidas através da significante sobre-regulação da ciclina A e D1, pelo tratamento combinado de TCS e CRE. Em conclusão, estes dados demonstram pela primeira vez que as detenções específicas do ciclo celular em células cancerosas pode ser induzida pela TCS por inibição da ligação de CREB para CRE em genes relacionados com a proliferação de células

citação:. Wang P, Huang S, Wang M, Ren Y, Hehir M, Wang X, et al. (2013) Detenções ciclo celular AMP cíclico-Response Elemento regulamentados em células cancerosas. PLoS ONE 8 (6): e65661. doi: 10.1371 /journal.pone.0065661

editor: Hong Wanjin, Instituto de Biologia Molecular e Celular, Biopolis, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de novembro de 2012; Aceito: 25 de abril de 2013; Publicação: 28 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios da National Natural Science Foundation da China (81071653), Natural Science Foundation da província de Zhejiang (Y2111136), Advanced Key Científico e programas tecnológicos de Ningbo (2011C51005), Natural Science Foundation da cidade de Ningbo (2011A610050) e KC Fundo Magna Wong na Universidade de Ningbo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tricosantina (TCS), um componente ativo isolado dos tubérculos de raiz da erva medicinal chinesa

Trichosanthes kirilowii

[1], é um agente promissor para o tratamento de câncer [2]. Nossos relatórios anteriores mostraram que a TCS inibiu a proliferação de células HeLa adenocarcinoma cervical [3] através da via de sinal /MAPK /CREB PKC [4]. Além disso, a TCS regulada negativamente de Bcl-2 de expressão [5], que foi anulada por um elemento de AMP-responsivo cíclico (CRE, TGACGTCA) oligonucleótido decoy (OGN), bloqueando a proteína de ligação a CRE (CREB) local de ligação na Bcl-2 [6]. Estes resultados sugerem que a expressão do gene mediada por Cre pode desempenhar um papel essencial na proliferação de células HeLa.

No entanto, pouco se sabe sobre o efeito de TCS em paragem do ciclo celular de células HeLa, carcinoma escamoso cervical (CaSki e C33A celular), e carcinoma pancreático humano (células SW1990), especialmente, se os genes relacionados ao ciclo celular foram regulados pelo OGN CRE engodo.

no presente estudo, nós exploramos ainda mais os efeitos da TCS sobre a proliferação de células cancerosas, prisões ciclo celular no progresso da proliferação celular e o papel da CRE na regulação do ciclo celular.

o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da TCS sobre a proliferação de células de câncer eo efeito da CRE em TCS-induzida prisões do ciclo celular. Uma questão importante era se ciclinas combinada-CRE desempenhou um papel crítico na regulação do ciclo celular nessas células cancerosas.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e cultura

células cervicais (HeLa, Caski, C33A) e células SW1990 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, EUA). HeLa, CaSki, C33A [7] e células SW1990 [8] foram cultivadas em monocamada em meio RPMI 1640 (Gibco, NY, EUA) e meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), contendo 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD, EUA), numa

2 incubadora de CO (Forma Scientific, EUA). O meio foi substituído, duas vezes por semana, e as células foram passadas a cada 4-5 dias numa proporção de 01:03.

tratamento celular

As células foram plaqueadas a 2 x 10

6 células /placa em placas de 100 mm em meio basal. Na confluência, lavaram-se brevemente com PBS e, em seguida, tratada com a TCS (Jinshan empresa farmácia, Xangai, China). As células de controlo foram incubadas em meio TCS-livre.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi avaliada com Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão), utilizando os métodos descritos anteriormente [3 ], [4], [9].

O tratamento de células com Cre-OGNs

CRE chamariz OGN (5′-TGACGTCAGAGAGCGCTCTCTGACGTCA-3 ‘) e OGN controle (5’TGACGTCATGACGTCATGACGTCA- 3 ‘) foram convertidos para fosforotioato OGNs (Invitrogen Carlsbad, CA, EUA) como descrito anterior [5], [6], [10].

Preparação de citosólica e nucleares proteínas

a preparações de proteínas citosólicas e nucleares foram realizados como previamente descrito [6], [11], [12]. Resumidamente, no final de cada tratamento designado, as células foram lavadas rapidamente com PBS frio e lisadas por serem enviados para abate em 0,5 ml de tampão hipotónico frio (HEPES 10 mM, KCl 40 mM, MgCl 3 mM de

2, 1 mM de ditiotreitol, 0,2 % de NP-40, 1 ug /mL de aprotinina, leupeptina 2 uM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, fosfato de p-nitrofenilo a 40 mM, ortovanadato de sódio 1 mM e glicerol a 50%). Os lisados ​​foram recolhidos e incubados em gelo durante 5 min, depois centrifugado a 15000 × g durante 20 s. O sobrenadante foi recolhido e guardado como as fracções citosólicas. O sedimento (isto é, núcleos de células) foi ressuspenso em tampão hipertónico (HEPES 20 mM, KCl 420 mM, MgCl 1,5 mM

2, EDTA 0,2 mM, ditiotreitol 0,5 mM, 0,2% de NP-40, 1 ug /mL de aprotinina, 2 uM de leupeptina, 0,5 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, fosfato de p-nitrofenilo a 40 mM, ortovanadato de sódio 1 mM e glicerol a 25%). Após incubação em gelo durante 60 min, as amostras foram centrifugadas a 15000 × g durante 20 min e os sobrenadantes foram recolhidos e guardados como extractos nucleares. As fracções citosólicas e extractos nucleares foram fervidas durante 10 minutos e dissolvido em 8% SDS-PAGE.

ciclo celular análise

para citometria de fluxo de análise de ciclo celular, 1 × 10

6 células foram colhidas por centrifugação, lavadas com PBS e fixadas durante a noite com etanol gelado a 70%. As células fixadas foram tratadas com 25 ug /ml de ARNase A a 37 ° C durante 30 min e em seguida coradas com iodeto de propídio (PI) (50 ug /ml, Sigma) durante 30 min no escuro. A intensidade de fluorescência de células individuais foi medida por um citómetro de fluxo (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, EUA). Pelo menos 10.000 células foram contadas [13].

análise Western blot

lisados ​​celulares totais foram preparado por lise das células com tampão de ensaio de radioimunoprecipitação e concentração de proteína foi determinada utilizando o kit de ensaio de proteína (Bio -Rad). Para a análise de Western blot, 50 ug de cada amostra foi processada como descrito [14]. Foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-ciclina A, B1, D1, E, anti-CDK2, 4 e anti-actina (Cell signaling Thehnology, Inc., Beverly, MA). Os anticorpos secundários foram ligados a peroxidase de rábano e detecção por quimioluminescência (Bio-Rad, Hercules, CA). As quantidades relativas de proteína imunorreactiva em cada banda foi determinada por varrimento a análise densitométrica das películas de raios-X.

A análise estatística

Todas as experiências foram repetidas três vezes. Os dados foram expressos como média ± SD. ANOVA foi utilizado para avaliar as diferenças entre os grupos. Dados apresentados como média ± DP de três experiências independentes. As diferenças foram consideradas significativas se

p

. 0,05

Resultados

Efeitos da TCS sobre a proliferação de células cancerosas

TCS de 20-100 mg /ml inibiu a proliferação de células de 3% a 70% após o tratamento durante 24 h (Fig. 1). A concentração inibidora de 50% (IC

50) de TCS em células Caski C33A e verificou-se ser de 60 ug /ml, mais baixa do que em células HeLa e SW1990 (100 ug /ml) (Tabela 1).

TCS inibiu a proliferação celular de um modo dependente da dose. Os dados representam médias ± DP de três experiências independentes (*

p Art 0,05 comparado com o controle).

Efeitos da TCS sobre o progresso do ciclo celular e ciclo celular proteínas reguladoras

células cancerosas tratadas com a TCS

foram analisadas por citometria de fluxo. Um número de células dependentes da dose aumenta de S, G1, G2 fase /M foram mostrados em células HeLa, CaSki, e células SW1990, respectivamente, depois de terem sido tratados durante 24 horas, (Tabela 2). Os níveis de proteínas relacionadas com o ciclo celular foram determinadas por ensaio de mancha de Western. TCS diminuição da abundância de ciclina A, D1 e CDK 2, 4, ao mesmo tempo que não teve nenhum efeito significativo sobre a expressão de ciclina B1 e E em células HeLa (Fig. 2). Em células CaSki, ciclina D1, E e CDK 2, 4 foram significativamente diminuída, enquanto que não há alterações marcantes foram mostradas na expressão de ciclina A e B1 (Fig. 3). Resultados semelhantes foram observados em células C33A (dados não mostrados). Em células SW1990, ciclina A, B1, E e CDK 2 foram significativamente regulada para baixo, não foram observados efeitos distintos na expressão de ciclina D1 e CDK4 (Fig. 4).

células HeLa foram tratados com indicada doses de TCS durante 24 h. O número de células da fase S aumentou significativamente (A) e expressões de ciclina A, D1 e CDK2, 4 diminuiu significativamente (B). Os dados representam médias ± DP de três experiências independentes (*

p Art 0,05 comparado com o controle)

células Caski foram tratados com doses indicadas de TCS para 24 h.. o número de células em fase G1 aumentou significativamente (A) e expressões de ciclina D1, E e CDK2, 4 diminuiu significativamente (B). Os dados representam médias ± DP de três experiências independentes (*

p Art 0,05 comparado com o controle).

células SW1990 foram tratados com doses indicadas de TCS para 24 h. Os números de células em fase G2 /M aumentou significativamente (A), as expressões de ciclina A, B1, E e CDK2 diminuiu significativamente (B). Os dados representam médias ± DP de três experiências independentes (*

p Art 0,05 comparado com o controle).

Efeitos da CRE-chamariz sobre o progresso do ciclo celular e regulamentar proteínas

as prisões de S, G1 e G2 /M fases induzida pela TCS em HeLa (Fig. 5), CaSki (Fig. 6) e SW1990 (Fig. 7) células, foram significativamente atenuada pelo combinados tratamento de TCS e CRE (A, B). Verificou-se que as reduções induzidas pelo TCS de ciclina A e D1 foram acentuadamente invertida pela adição de CRE, em células HeLa (. 5, C, D FIG), células Caski (. 6 C, D FIG) e SW1990 células ( a Fig. 7 C, D).

aumento induzido pelo TCS

do número de células em fase S foi significativamente atenuada pelo tratamento combinado de TCS + CRE (a, B). A expressão regulada por baixo da ciclina A e D1 foi revertida pela TCS + CRE. Não se observou qualquer efeito sobre outras proteínas (C, D). Os dados representam médias ± DP de três experiências independentes (*

p Art 0,05 comparado com o controle,

#

p Art 0,05 comparado com TCS).

aumento do número de células

TCS-induzida em fase G1 foi significativamente atenuada pela TCS + CRE (a, B). A expressão regulada por baixo da ciclina D1 foi revertido por tratamento dos TCS + CRE. Não se observou qualquer efeito sobre outras proteínas (C, D). Os dados representam médias ± DP de três experiências independentes (*

p Art 0,05 comparado com o controle,

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p Art 0,05 comparado com TCS).

aumento do número de células em G2

TCS-induzido /fase M foi significativamente atenuada pelo tratamento de TCS + CRE (a, B). expressão regulada de ciclina A foi revertida pelo tratamento de TCS + CRE. Não houve efeito sobre outras proteínas (C, D). Os dados representam médias ± DP de três experiências independentes (*

p Art 0,05 comparado com o controle,

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p Art 0,05 comparado com TCS).

Discussão

Este estudo demonstrou, pela primeira vez, que a TCS exerceu efeitos citotóxicos sobre a viabilidade das células do cancro de um modo dependente da dose (Fig. 1). células Caski e C33A foram sensíveis ao seu efeito inibidor sobre a proliferação celular (Tabela 1). Os resultados dos mecanismos é anticancerígenos mostram claramente que o aumento da fase S em células HeLa acompanhou a diminuição de L

1 células em fase, enquanto que o número de G

2 células em fase não se alterou. Em células Caski e C33A, aumento significativo da G

1 fase e diminuição de S e G foram observados

2 células de fase. Em células SW1990, um aumento de L

2 /M células em fase foi acompanhada por uma diminuição de L

1 células de fase, sem qualquer alteração encontrada no número de células em fase S (Tabela 2).

Investigar as alterações em várias moléculas reguladoras envolvidas no ciclo celular mostraram que as expressões de ciclina a, D1 e CDK 2, 4 em células HeLa (Fig. 2), ciclina D1, e e CDK 2, 4 em CaSki e C33A células (Fig. 3), ciclina a, B1, e e CDK 2 em células SW1990 (Fig. 4) foram significativamente regulada negativamente. Bloqueando o sítio de ligação de genes do ciclo celular para CREB por OGN, um chamariz CRE, impediu a TCS-preso S, G1 e G2 /ciclos celulares M em células HeLa (Fig. 5 A, B), CaSki (Fig. 6 A, B células) e SW1990 (Fig. 7 A, B), respectivamente. O TCS mediada por sub-regulação da ciclina A, D1 em células HeLa (Fig. 5 C, D), ciclina D1 em células Caski (Fig. 6 C, D) e ciclina A em células SW1990 (Fig. 7 C, D) foram revertidos pela combinação de CRE e TCS.

Estes resultados confirmaram e ampliaram nossos relatórios anteriores mostrando que a TCS tem um efeito citotóxico sobre as células cancerosas [3], [4], e, em parte, os mecanismos subjacentes a activação de proteína CREB [5], [6]. No entanto, não foi previamente relatado se a paragem do ciclo celular mediada por TCS ocorre através da combinação de genes CRE e de destino. O presente estudo mostra que a CRE chamariz OGN atenuou a diminuição das expressões da ciclina A e D1 resultante do tratamento do TCS, e reverteu as detenções ciclo celular.

O ciclo celular é fortemente mediada através de uma complexa rede de positivo e moléculas reguladoras do ciclo celular negativa como CDKs, CKIs e ciclinas [15], [16]. Tem sido relatado que a formação de complexos de D /CDK4 e ciclina E /CDK2 ciclina activa controla a progressão através da fase G1 (transição G1 /S). Além disso, a ciclina A se liga e activa CDK2, promovendo G1 /S e G2 /M do ciclo celular transições. No final G2, a ciclina B /CDK2 é activado, permitindo a entrada em mitose [17]. No presente estudo, verificou-se que as expressões diminuídos de ciclina A, D1 e CDK2, 4 foram associadas a prisão fase S em células HeLa (Fig. 2). Os diminuiu-expressões de ciclina D, E e CDK2, 4 estavam relacionados com fase G1 em células Caski e C33A (Fig. 3). As expressões de ciclina A, B1 e CDK2 foram significativamente regulada em células SW1990, preso em fase G2 /M (Fig. 4). Nós também descobrimos que CDK2 foi significativamente diminuído em linhas celulares. Este resultado está de acordo com a noção de que CDK2 tem uma função distinta e essencial no ciclo celular de mamífero, e a sua mutação ou inibição provoca um bloco de fase G1 [18].

A activação de genes que ostentam CRE é relatado ocorrer por fosforilação de CREB em Ser 133 e se ligar a sequências de consenso de CRE na região promotora de genes [19], [20]. picos de fosforilação de CREB durante a transição G1-S e, em seguida, diminui gradualmente a partir da fase S a fase M [21]. Combinado com nossos resultados reportados anteriormente [4] – [6], [9], é lógico supor que genes de proliferação celular, tendo o site CRE, se ligam a CREB e afetar seu nível de fosforilação, interferindo assim com a divisão celular

CRE localiza a montante do mRNA começar locais. Tem um papel chave no ciclina A [22], [23] e D1 [24], [25] expressão através da activação da CREB [26] – [28]. Um estudo anterior mostrou que a associação de CREB com quinase relacionadas com vaccinia 1 (VRK1) ocorreu de uma forma de células de ciclo dependente do final de G1 para a fase S. Além disso, VRK1 especificamente aumentou a actividade do promotor CRE na ciclina D1, facilitando o recrutamento de CREB fosforilado para esse locus [29]. Giampuzzi et ai, também descobriram que uma diminuição significativa da proteína CREB de ligação ao promotor de ciclina D1 levou a uma inibição dramática da expressão da proteína ciclina D1 na lisil-oxidase (LOX) células -up-regulados [30]. Este fenómeno também foi confirmado nas células de fibroblastos [31], de células do endométrio [32], de células INS [33], de células de hepatócitos [34] e outras linhas de células [21], [35], [36]. Além disso, um certo número de observações sugeriram ciclina A desempenha um papel crucial em S e G2 /M de transição em células de mamífero e este papel é consistente com a sua associação preferencial com CDK2, em vez de CDC2, durante a fase S [37], [38] . CRE foi confirmado para ser necessário para a activação eficiente do promotor de ciclina A em células do músculo liso da aorta [39], as células de fibroblastos [40] e células de carcinoma embrionário humano [22]. O presente estudo mostra claramente que o tratamento combinado da TCS e CRE atenuou a diminuição da ciclina A e expressão D1, invertendo assim o efeito da TCS na parada do ciclo celular. Portanto, sugerimos que fator de transcrição CREB é um dos reguladores a montante de parada do ciclo celular induzida pelo TCS em células cancerosas.

Conclusão

Nossos resultados mostram, pela primeira vez, que induz a TCS prisões específicas do ciclo celular em células cancerosas por inibição da ligação de CREB para CRE em genes relacionados com a proliferação celular.