Abstract
A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) ou células iniciadoras de tumores pode levar a recorrência do câncer em uma interação célula-microambiente permissivo, promovendo invasão em glioblastoma (GBM) e neuroblastoma (NB). matriz extracelular (ECM) pequenos proteoglicanos ricos em leucina (SLRPs) desempenham múltiplos papéis na homeostase do tecido pela remodelação da matriz extracelular (ECM) componentes e modulando vias de sinalização intracelular. Devido às suas propriedades inibidoras contra pan-tirosina-quinases receptoras (RTKs), SLRPs são relatadas para exercer efeitos anticancerosos
In vitro
e
In vivo
. No entanto, os seus papéis parece ser específica do tecido e que também estão envolvidos na migração de células de cancro e de resistência às drogas, abrindo o caminho para complexos cenários diferentes. O objetivo deste estudo foi determinar se o decorim SLRPs (DCN) e lumican (LUM) são recrutados na plasticidade celular e adaptação microambiental de células cancerosas diferenciadas induzidas em direção fenótipo tronco-like. neuroesferas flutuantes foram geradas através da aplicação de meio de enriquecimento CSC (meio isento de soro de células estaminais neurais, NSC SFM) com o estabelecido linhas celulares de cancro SK-N-SH e SF-268, modelos celulares de GBM e NB, respectivamente. Em ambos os modelos, observou-se a activação sinérgica dependente do tempo de DCN e LUM. A expressão /proteína DCN e LUM mRNA mais elevada foi detectada após a exposição das células à NSC SFM para 8/12 dias, considerando-se essas células como SLRP expressando (SLRP
+) CSC-like. Ultra-estrutural de imagem mostrou a heterogeneidade celular tanto do GBM e neurospheres NB e identificou as células vivas interiores. linhas celulares parentais de ambos GBM e NB cresceu apenas em agar mole + NSC SFM, enquanto as neuroesferas secundárias (originado de SLRP
+ t
8 CSC-like) mostraram taxas de proliferação mais baixos do que neurospheres primários. Curiosamente, o SLRP
+ CSC-like do GBM e neurospheres NB eram resistentes a temozolomida (TMZ) em concentrações 750? M. Os nossos resultados sugerem que GBM e NB CSC-como promover a activação de enormes quantidades de SLRP em resposta a um enriquecimento CSC, adquirindo simultaneamente resistência TMZ, heterogeneidade celular, e um fenótipo quiescente, sugerindo um papel central novo para SLRP na resistência à droga e plasticidade celular de CSC-like, permitindo a sobrevivência das células e ECM /nicho potencial de modulação
Citation:. Farace C, Oliver JA, Melguizo C, Alvarez P, Bandiera P, Rama AR, et al. (2015) microambiental Modulação da Decorina e lumican em Temozolomida-Resistant Glioblastoma e cancro de Neuroblastoma células-tronco-like. PLoS ONE 10 (7): e0134111. doi: 10.1371 /journal.pone.0134111
editor: Dragana Nikitovic-Tzanakaki, Universidade de Creta, Grécia
Recebido: 28 Abril 2015; Aceito: 06 de julho de 2015; Publicação: 31 de julho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Farace et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundació la Marató TV3, Projeto n ° 111431.
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Fundo
o glioblastoma (GBM) e neuroblastoma (NB) são as neoplasias malignas do sistema nervoso mais comuns e letais em pacientes adultos e pediátricos, respectivamente. A Organização Mundial de Saúde considera GBM o astrocitoma mais agressivo, e pode evoluir para GBM secundário de gliomas de baixo grau, ou
de novo
com rápida progressão para a morte [1]. Em contrapartida, a NB surge principalmente a partir de células da crista neural como um cancro neuroendócrino do sistema nervoso simpático, e 60% de doentes pediátricos com doença metastática mostram no diagnóstico [2]. Embora a temozolomida (TMZ) -um agente de alquilação que induz a morte celular por todo o ADN de alquilação /metilação em resíduos guanina-em combinação com outras drogas ou radioterapia representar um tratamento de primeira linha de aumentar a sobrevivência global (OS) de pacientes com GBM ou NB [ ,,,0],3, 4], a resistência aos medicamentos e progressão do câncer são comuns. Porque GBM é altamente invasivo no cérebro e NB tende a invadir outros órgãos, OS paciente permanece pobre ( 1,5 anos em pacientes com GBM e 4 anos em pacientes RN). [5, 6]
A falha terapêutica em pacientes com câncer tenha sido previamente relacionado com células-tronco do câncer subpopulações (CSC), que assegurem a manutenção da heterogeneidade câncer, e estas subpopulações CSC são mais resistentes a fármacos seletivos através de múltiplos passos concertados de auto-renovação e diferenciação [7-9]. Metástase e recorrência do câncer também estão ligados ao comportamento dos CSCs, incluindo o seu fenótipo quiescente, a capacidade migratória, e evasão do sistema imunológico [10]. inúmeras pesquisas sugerem que as células-tronco como células estão equipados com máquinas inata que os protege de radio /quimioterapia [11, 12]. Isto inclui mecanismos relacionados com a haste, tais como nichos protectores celulares e alterações na expressão de genes envolvidos na regulação do ciclo celular, a reparação do ADN, o metabolismo de drogas, e o efluxo de drogas [13]. A resistência aos medicamentos e capacidade de invasão celular de CSCs também aumentam na transição reversível epitelial-a-mesenquimal fenotípica (EMT) [14, 15], que recapitula a EMT na organogénese e desenvolvimento [16, 17] normal.
Vários sinais do microambiente, incluindo a reorganização da matriz extracelular (ECM), hipóxia e fatores autócrinos /parácrinos, pode determinar-tronco e células de câncer Fates [18-25], e desencadear ou inibem processos EMT [26, 27]. Portanto, glicoproteínas e proteoglicanos de ECM que são capazes de modificar o ambiente do ECM e vias de sinalização intracelulares são de extrema importância no microambiente do cancro [28-30]. Os pequenos proteoglicanos ricos em leucina (SLRPs), compartilhando estrategicamente domínios conservados, representam um exemplo claro do conceito acima referido. O núcleo proteico rico em leucina (40-50 kDa) se ligam a um número de factores de crescimento (GF) e receptores de membrana, enquanto ramificação de cadeias laterais glycosaminoglycanic as tarefas de montagem de ECM por colagénio e também na ligação de receptor de membrana. Curiosamente, apesar de suas propriedades pan-inibitória contra receptores tirosina-quinase (RTK) e vias de crescimento do câncer, o “guardião da matriz” decorim (DCN) e lumican (LUM) SLRPs possam exercer efeitos anticancerígenos
In vivo
e
in vitro
[31-33]. No entanto, estudos recentes têm lançar luz sobre propriedades específicas de tecidos recentemente identificados de ambos DCN e LUM em tecidos normais e no microambiente do câncer maligno. Conforme relatado por outros autores, a inibição glioma parcial pela DCN em experiências de terapia genética em ratos traz consigo uma redução acentuada da infiltração de células microgliais [34], o que poderia afeta a inibição do câncer
in vivo
. DCN também aumenta a evasão do sistema imunitário e invasão muscular no cancro da próstata
in vivo
[35], e exerce efeitos protetores e anti-apoptóticos inesperadas em linhas de células de glioma em condições de hipoxia [36]. Em células de carcinoma de células escamosas malignas orais, a localização nuclear de DCN parece aumentar invasão celular
via
o receptor do factor de crescimento epidérmico nuclear (EGFR) via [37, 38], o crescimento enquanto que em células de osteossarcoma, DCN-mediada prisão é evitado
via
a ativação prolongada de membrana EGFR [39]. Clinicamente, a DCN tem sido proposto como regulador do mecanismo resistente à quimioterapia no cancro oral [40] e relacionado com a resistência às drogas e redução da sobrevida em pacientes com GBM [41]. Da mesma forma para DCN, LUM é relatado para mediar a supressão do tumor. No entanto, LUM é expresso em cancros pancreáticos de alta qualidade com um baixo grau de diferenciação [42] e em pacientes GBM, bem. LUM também inibe a adesão celular e promove a migração de células de osteossarcoma, regulando a β2 factor de crescimento de transformação (TGF-β2) /Smad2 via de [43], e um proteoglicano de 70 kDa LUM parece aumentar a proliferação de células cancerosas e inibe a migração do pâncreas células cancerosas. Além disso, juntamente com DCN, LUM foi regulada em células de câncer de cabeça e pescoço resistentes à cisplatina [44].
É importante salientar que SLRPs são expressos em nichos de células-tronco do embrião de galinha [45], em endotelial cerebral células [46], em progenitores de vários tipos de células [47], e numa subpopulação de células NB sem resposta para o crescimento de neurites-nervo-fator de crescimento-mediada [48]. DCN derivado de astrócitos também inibe a diferenciação de células neurais de células estaminais /progenitoras no sentido de uma estrutura celular dos neurônios-like [49]. Alterando as características mecânicas de três dimensões matrizes de colágeno (3D), SLRPs são recrutados durante o ontogênico (desenvolvimento) EMT [50], a migração precursor e diferenciação celular [51], e cicatrização de feridas /reparação de tecidos em resposta à lesão do sistema nervoso central e inflamação [52]. Neste contexto, é concebível que os pequenos proteoglicanos e DCN LUM desempenham um papel na biologia das CSCs de origem no sistema nervoso. Para este fim, nós investigamos o envolvimento de DCN e LUM em GBM e NB CSC-como modelos, simulando os fenómenos de perda de ancoragem e o desprendimento de células tumorais diferenciadas que estão subjacentes ao processo de EMT, e sua relação com o comportamento CSC-like eo resposta celular ao TMZ. Neste estudo, relatamos pela primeira vez a expressão sinérgica maciça de DCN e LUM SLRPs em GBM e linhas de células NB submetido a flutuar baseado no neurosphere 3D enriquecimento CSC-like. micrografias neurosphere destacar a heterogeneidade e célula de polarização estaminais-como dos modelos NB 3D e GBM. Além disso, SLRP
+ NB e GBM CSC-like isolada das neurospheres apresentaram menores taxas de proliferação, menos apoptose e maior resistência às drogas do que as linhas celulares parentais, sugerindo um papel central e sinérgicos para DCN e LUM na resistência TMZ, a sobrevivência e manutenção de repouso, slow-ciclismo, subpopulações CSC-like.
Métodos
As linhas celulares e CSC enriquecimento
neste estudo, dois GBM estabelecida e linhas de células NB foram inscritos. A linha de células SK-N-SH é uma linha celular epitelial comercial originalmente derivado de metástases da medula óssea de um 4 anos de idade do sexo feminino sofrendo Caucasiano com NB, e foi previamente enriquecido em CSC-like. Em contraste, SF-268 é uma linha celular não epitelial derivada de um astrocitoma anaplásico de de grau elevado, que nunca foi utilizado para o enriquecimento CSC-like. A SK-N-SH fixada (a partir dos Type Culture Colecção Americana) linhas celulares de cancro e SF-268 (gentilmente fornecida pelo Centro Científico Instrumentação, Universidade de Granada) foram rotineiramente mantidas como culturas aderentes (monocamadas) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM ) suplementado com soro de bovino fetal a 10% e 1% de penicilina /estreptomicina, numa atmosfera humidificada a 37 ° C com 5% de CO
2. As células confluentes foram separadas em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) de ácido -ethylenediaminetetraacetic (EDTA) a 37 ° C durante 10 min, lavadas duas vezes em PBS, e subcultivadas como monocamadas. CSC enriquecimento das linhas celulares de cancro foi realizada através da geração de neuroesferas num meio isento de soro de células estaminais neurais (NSC SFM) [53, 54], contendo Knockout DMEM /F12 mais factor de crescimento de fibroblastos básico de 20 ug /ml (bFGF), 20 ug /ml de factor de crescimento epidérmico, 1 × StemPro Neural Suplemento (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), 1% de L-glutamina, e 1% de penicilina /estreptomicina. NSC SFM foi substituído a cada 2 dias após a centrifugação leve dos neurospheres.
extração de RNA e quantitativa de transcrição reversa (qRT)-PCR
A expressão de DCN e LUM mRNAs foi avaliada em t
0 células e neurospheres após 4 (t
4), 8 (t
8), e 12 dias (t
12) do enriquecimento CSC. As linhas celulares parentais em DMEM foram utilizados como controlo (T
0). O ARN foi extraído com o RNeasy Mini Kit (Qiagen, MD, EUA) e quantificadas com um espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific, DE, EUA). O ARN (1 ug) de cada amostra foi revertida transcrito com M-MLV de transcriptase inversa (Sigma, Itália), de acordo com as instruções do fabricante, e amplificação à base de SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi realizada com o CFX96 real -tempo de PCR Detection System (Bio-Rad, Itália), como relatado anteriormente [55]. O programa de ciclos de PCR foi: 50 ° C (2 min), 95 ° C (2 min), 42 ciclos de: desnaturação a 95 ° C (30 s), emparelhamento a 56 ° C (30 s) e extensão a 72 ° C (40 s), seguido por uma análise de curva de fusão (intervalo de 56-95 ° C) com incrementos de 0,5 ° C /5 s para avaliar a especificidade do iniciador. As sequências dos iniciadores foram: para a frente 5′-GGA CCG TTT CAA CAG AGA GG-3 ‘, reverso 5′-GAC CAC TCG AAG ATG GCA TT-3′ (DCN); frente 5’-TGG AGG TCA ATC AAC TTG AGA A-3 ‘, reverso 5′-CAA ACG CAA ATG CTT GAT CTT-3′ (LUM); directo 5’-CAA GGA GTA AGA CCC CTG GAC-3 ‘, reverso 5′-TCT ACA CAA TGG CTG TGA GGA G-3′ (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, GAPDH); directo 5’-GGC ATC CTC CTG ACC AAT GA-3 ‘, reverso 5′-AGG TGT GGT GCC AGA TTT CT-3’ (β-actina, ACTB). Os transcritos alvo foram normalizadas para GAPDH independentemente e ACTB (genes housekeeping) e o ARN dos t
0 células foi utilizado como o controlo de calibração. Os resultados foram expressos em uma escala logarítmica como mudanças de dobra (FCS), com o 2
-ΔΔCt método.
Western blot
extractos de proteínas inteiras foram obtidos com a sonicação pulsada de celular pelotas em 200 jul de tampão de extracção contendo mM de Trizma base 50, sacarose 0,25 mM, EDTA 5 mM (pH 7,4), 0,5% de Triton X-100 de cocktail inibidor de protease e 1%. As concentrações de proteína foram determinadas pelo método de Bradford. As proteínas (50 ug) foram misturados 1: 1 com tampão 2 × Laemmli, aquecida a 95 ° C durante 5 min, e carregado num gel de SDS-PAGE desnaturante de 12% com o caleidoscópio prestained padrões. As proteínas foram separadas por electroforese a uma voltagem constante (90 V) durante 90 minutos e transferidas para uma membrana de 0,45 mm de nitrocelulose em condições de semi-secos com a Trans-Blot SD semi-seco celular transferência electroforética (Bio-Rad, Espanha) durante 25 min a 200 mA. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado em PBS, incubada a 4 ° C durante a noite com o anticorpo anti-LUM policlonal de coelho (diluído a 1: 100; SC-33785, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou anticorpo monoclonal de ratinho anti-DCN anticorpo (01:50; SC-73896, Santa Cruz Biotechnology) em tampão de bloqueio, lavou-se 4 vezes em solução de lavagem (0,1% de Tween em PBS), incubou-se à temperatura ambiente durante 1 h com o anticorpo secundário adequado monoclonal de peroxidase de rábano conjugada (1: 5000; Sigma Aldrich), e lavou-se outra vez em solução de lavagem. As manchas foram detectadas com ECL Western Blotting reagentes de detecção (Amersham; UK). O sistema Molecular Imager VersaDoc MP 4000 (Bio-Rad, Hercules, CA) foi usado para visualização de quimioluminescência. As manchas foram despojados e incubadas com o mouse monoclonal anti-β actina anticorpo. (1: 30000; Sigma Aldrich) como o controle de carregamento
culturas de agar mole
As linhas de células foram cultivadas em soft agar para avaliar a sua colónia ou neurosphere formação em condições independente de ancoragem, em DMEM ou NSC SFM. Para explorar a proliferação do SLRP
+ CSC-like após enriquecimento CSC para (t
8 CSC-like), neurospheres secundários foram gerados a partir de t
8 CSC-like 8 dias. Resumidamente, StemPro Accutase celular dissociação Reagente (Invitrogen) foi usado para dissociar as t
8 neurospheres. Um teste de exclusão de azul tripano foi realizado e 5 × 10
3 /ml células foram coletadas em 2 × DMEM ou NSC SFM. As células foram misturadas 1: 1 com uma solução pré-aquecida contendo 0,6% de agarose ultra-pura em PBS (0,3% de concentração de agar final), semeadas em triplicado em placas de seis poços em 2 ml de agar solidificado inferior a 0,6%, e incubadas numa atmosfera humidif içada a 37 ° C com 5% de CO
2. As culturas de agar mole foram fotografados diariamente sob um microscópio de contraste de fase invertido (Nikon Eclipse TE 2000-S).
Transmissão e eletrônica de varredura de imagem microscópica
Oito dias (t
8 ) neuroesferas foram recolhidas, lavadas em PBS e fixadas em glutaraldeído a 2,5% em PBS 0,1 M (pH 7,4) durante 2 h a 4 ° C. As neuroesferas foram fixos cuidadosamente lavadas quatro vezes em PBS, fixadas posteriormente em 1% de tetróxido de ósmio (OsO
4) em 0,1 M PBS durante 1 h a 4 ° C, e armazenada em PBS a 4 ° C até à incorporação. As amostras utilizadas para a microscopia electrónica de transmissão (TEM) foram desidratadas em séries de concentrações crescentes de acetona e embebidos em resina epoxi para ultrafinos corte a 60 ° C durante a noite. As fatias ultrafinas cortadas com um 8800 Ultratome (LKB, Bromma, Suécia) foram coradas com 4% de acetato de uranilo e citrato de chumbo e visualizado em um Zeiss EM 109-902 microscopia eletrônica de transmissão (Zeiss, Oberchochen Alemanha). Por microscopia de varrimento electrónico (SEM), as neuroesferas postfixed foram incubadas em hexametildissilazano puro durante 1 h a 4 ° C, seca-se num secador de ponto crítico (Polaron, Watford, Reino Unido), e metalizado numa S150A Sputter Coater (Edwards, Crawley, UK) para a digitalização no Quanta 200 (FEI, Eindhoven, Holanda) ou DSM 962 instrumentos de SEM (Zeiss, Oberchochen, Alemanha).
tratamento TMZ e MTT ensaio
células individuais das monocamadas e t
8 neuroesferas de ambas as linhas de células foram recolhidas como descrito acima. A viabilidade celular foi testada com exclusão de azul de tripano e 5 × 10
3 células /poço foram semeadas em placas de microtitulação de 96 poços, em DMEM ou NSC SFM. No dia seguinte, o meio foi substituído com meio fresco com ou sem diferentes concentrações de TMZ (25-1500 ug /mL; Sigma, Madrid, Espanha). DMSO foi incluída como controlo de veículo. Cada condição foi testado em seis poços. Três dias mais tarde, o meio foi substituído com meio fresco para preservar a actividade TMZ. O ponto final do tratamento TMZ foi estabelecido no dia 6. Finalmente, um ensaio colorimétrico de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi realizada (Sigma). Resumidamente, foram adicionados 20 ul de MTT /poço e as placas foram incubadas a 37 ° C. Após 4 h, o meio foi cuidadosamente removido e foi adicionado DMSO para dissolver os sais de formazano. As reacções foram medidos com um fotómetro de microplacas Multiskan EX (Thermo Scientific, Madrid, Espanha) a 570 nm. A dose-resposta TMZ foi expressa como a percentagem de inibição (%) da actividade metabólica da célula em relação à de células não tratadas e ajustada para o controlo do veículo. A inibição do crescimento celular por TMZ foi avaliada em experiências em quadruplicado.
A análise estatística do
Student bicaudal
t
teste foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças nas os resultados do tratamento de TMZ para o SLRP
+ CSC-like e as linhas celulares parentais. As diferenças na expressão dos genes qPCR foram avaliadas com análise de uma via da variância (ANOVA). A significância estatística foi estabelecido em p . 0,05
Resultados
expressão DCN e LUM durante baseada neurosphere CSC enriquecimento
neuroesferas de ambos SF-268 e SK-N-SH linhas celulares adquirida 3D conformações normais resultantes da proliferação sustentada radial da maioria das células, atingindo 50 mm após 4 dias (Figura 1A). Uma análise de qRT-PCR mostraram que a expressão DCN e LUM ARNm, com a excepção de LUM em SF-268 t
12, aumentou sob condições de enriquecimento CSC em ambas as linhas celulares, que mostra os valores mais elevados de expressão de DCN e LUM ARNm após 8 dias (t
8). Em comparação com as linhas celulares parentais (t
0), e considerando ACTB como gene housekeeping, GBM CSC-like eram mais enriquecido em mRNA LUM (FC
Lum
= t
0: 1; t
4: 11,00; t
8: 21,70; t
12: 9,51) do que no mRNA DCN (FC
DCN
= t
0: 1 ; t
4: 6,32; t
8: 17,87; t
12: 11,08) (p 0,01). mostraram níveis mesma forma, a NB CSC-como mais elevados de mRNA LUM (FC
Lum
= t
0: 1; t
4: 29,04; t
8: 105,78; t
12: 60,12) do que os níveis de mRNA DCN (FC
DCN
= t
0: 1; t
4: 23,02; t
8: 80,44; t
12: 40,22) (p 0,01; Figura 1B)
(A) Neurosphere geração de linhas de células SK-N-SH e SF-268.. Bar, a 50 uM. (B) Expressão de DCN e LUM ARNm em culturas de enriquecimento CSC. Resultados qRT-PCR foram normalizados para ACTB e representada graficamente como mudanças relativas de dobragem (FCS) entre neuroesferas em diferentes pontos de tempo (T4, T8 e T12) e aderente t
0 sub células com o 2
-ΔΔCt método. Todos os valores DCN e LUM FC para as neuroesferas foram estatisticamente significativos (* p 0,01). (C) Análise Western blot da DCN e LUM. p-actina foi utilizado como controlo de carga. Os níveis totais de DCN e LUM foram maiores nas neuroesferas do que nas células aderentes de ambas as linhas celulares. Uma isoforma de 70 kDa LUM foi regulada positivamente nas neuroesferas de ambas as linhas celulares, com a maior expressão nas neuroesferas T8. As células aderentes SF-268 mostraram expressão basal da proteína do núcleo 37-kDa LUM.
A análise de proteínas mostraram um claro aumento em proteínas LUM (70-kDa) durante o enriquecimento CSC. A expressão mais elevada LUM foi detectado em ambos SF-268 e SK-N-SH t
8 neuroesferas (Fig 1C). Por contraste, a proteína de 40 kDa foi detectada com LUM muito menos que a expressão de 70-kDa em ambos LUM SF-268 e SK-N-SH, e, especialmente, em t
12 (Fig 1C). Por outro lado, se detectou um aumento significativo no DCN ( 150 kDa) a expressão da proteína em ambos SF-268 e SK-N-SH t
12 neuroesferas enquanto a proteína de 40-kDa DCN foi detectada muito fracamente, com uma avaliação da expressão difícil. De acordo com resultados de mRNA, 8 dias SLRP
+ CSC-like (T8 CSC-like) derivada de ambos GBM e linhas de células NB foram incluídos em uma análise mais aprofundada.
culturas de agar mole de SLRP
+ linhas de células-como CSC e parentais
Para avaliar as diferenças no crescimento celular entre as linhas celulares CSC-like e parentais, as neuroesferas secundárias de SLRP
+ t
8 CSC-like foram gerados em agar mole e comparados com as neuroesferas primárias derivadas de células parentais. As culturas de agar mole independente de ancoragem mostrou colônias neuroesferas no NSC SFM, enquanto há ou baixas colônias de células parentais tinha crescido no ensaio de agar mole baseado em DMEM após 22 dias (Fig 2A). As neuroesferas SK-N-SH primários foram maiores do que as SF-268 neuroesferas, atingindo 200 um após 3 semanas, e tinha mostrado um núcleo escuro claramente visível dentro da estrutura 3D. As culturas de agar mole de t
8 GBM e NB CSC-like (SLRP
+) cresceu como pequenas neurospheres secundárias no NSC SFM, e curiosamente também como pequenas colónias em DMEM após 30 dias (Fig 2B). As neuroesferas secundárias foram menores do que as neuroesferas primárias e intrasphere sublinhou células (núcleos escuros) foram detectados somente no secundário SF-268 neurospheres após 2 semanas, enquanto os neurospheres SK-N-SH secundárias manteve uma aparência translúcida.
(a) neuroesferas primária de agar mole a partir das linhas celulares parentais. Ausência de formação de colónias em DMEM semi-sólido (22 dias) e formação de neurosphere em semi-sólido NSC SFM (14 e 22 dias). (B) neurospheres agar mole secundários de SLRP
+ CSC-like isolado de t
8 neurospheres. Neuroesferas foram gerados em ambos os semi-sólido DMEM e semi-sólido NSC SFM (14 e 22 dias), o que sugere o comportamento de ciclismo lento da atividade de evasão morte CSC-like e residual nos neurospheres secundárias DMEM-crescidos. Bar, 50 mm.
ultraestruturas Heterogeneic de GBM e imagem NB neurospheres
ultra-estrutural com TEM e SEM mostrou ampla heterogeneidade celular nas t
8 neurospheres de ambas as linhas celulares. SEM imagens das superfícies neuroesferas mostrou células mais embalados nas neuroesferas NB do que nas neuroesferas GBM, enquanto que as células periféricas dos neuroesferas GBM tinha extroflections de membrana mais finas do que as neuroesferas SK-N-SH (Figuras 3A, 3B, 4A e 4B ). células elétron-densas e electron-Lucent adjacentes e células em apoptose esporádicos foram observados nas periferias neuroesferas GBM (Fig 3C-3E). As células periféricas das neuroesferas foram NB polarizado, com mais OsO
4 coloração no citoplasma do que as células interiores, e continha grânulos densos, as vesículas endocíticas, e alguns extroflections de membrana (Fig 4C-4E). amplas áreas de morte celular, caracterizada pela formação de bolhas de membrana, enrugamento célula, corpos apoptóticos, e largo heterocromatina compactado nucleares, não foram observadas no meio das neuroesferas de ambas as linhas celulares (Fig 3G, 3H, 4g e 4h). No entanto, também foram observados a mitose activa e células vivas próximos aos locais estressados internas, tanto no GBM e neurospheres NB (Figuras 3G, 3I, 3J, 4F e 4J). Curiosamente, essas células do microambiente resistentes no núcleo neurosphere hipóxico mostrou núcleos ondulado, grandes quantidades de eucromatina e aparelhos mitocondrial claramente visível.
imagem (A) SEM de um todo SF-268 neurosphere (1000 ×). (B) Imagem SEM da superfície da neuroesfera (2200 ×). (C-J), as imagens de TEM de neuroesferas interiores e periféricas. Detalhes de extroflection fina membrana (C-D), as interações entre células elétron-densas e de elétrons-Lucent (E), os detalhes da adesão célula-célula (F), sofrendo locais nas esferas internas, com necrótica (G) e apoptose ( células) H, células vivas, e pormenores do aparelho mitocondrial nas esferas interiores (i, j). Observe as células em apoptose na periferia de uma neurosphere (D) e as células que vivem perto dos locais de sofrimento (I). Barra: (C-E) e (G-I), 5 uM; Imagem SEM de toda SK-N-SH neuroesfera (950 ×) (F e J), 1