Abstract

microRNAs desregulamentados desempenhar um papel no desenvolvimento e progressão do cancro do cólon, mas pouco se sabe sobre a sua distribuição de tecidos e células no contínuo da mucosa normal através do adenoma pré-maligna de adenocarcinoma invasivo. O objectivo deste estudo foi examinar o padrão do conjunto de miR-17-92 expressão (miR-17, o miR-18, o miR-19, o miR-20 e miR-92), bem como o miR-21, 31-miR , miR-135b, e miR-145 no início clinicamente diagnosticado cancro do cólon. Os microRNAs foram analisados ​​por cromogénico

in situ

hibridação na sequência de adenoma-adenocarcinoma normal dos nove adenocarcinomas desenvolvidos em pólipos na mucosa do cólon. Posteriormente, a expressão de microRNAs selecionados foi validado em 24 de mucosas pólipos cancro do cólon. Expressão de miR-17 foi confinada às células epiteliais, e os níveis de expressão aumentado na zona de transição do normal para o tecido adenomatoso. Os membros do cluster miR-17-92, miR-19b, miR-20a e miR-92a, seguiu o mesmo padrão de expressão, mas miR-17 foi o mais predominante. Um aumento da expressão de miR-21 foi encontrada no estroma associado ao tumor com o aumento mais dramático a partir de adenoma ao adenocarcinoma, enquanto o número de miR-145 células positivas de tipo fibroblasto na lâmina normal (estroma) diminuiu de uma maneira gradual em toda a sequência de adenoma-adenocarcinoma normal. Concluiu-se que a expressão de miR-17, o miR-21, e miR-145 mudanças nas fases iniciais da sequência de adenoma-adenocarcinoma normal. Assim, esses microRNAs podem desempenhar um papel no desenvolvimento de cancro do cólon

Citation:. Knudsen KN, Nielsen BS, Lindebjerg J, Hansen TF, Holst R, Sørensen FB (2015) microRNA-17 é o mais Up Membro -Regulated do Cluster miR-17-92 durante o início do cancro do cólon Evolution. PLoS ONE 10 (10): e0140503. doi: 10.1371 /journal.pone.0140503

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, United States |

Recebido: 11 de junho de 2015; Aceito: 24 de setembro de 2015; Publicação: 14 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Knudsen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o estudo foi financiado pela Região do Fundo das Southern Denmark PhD (número de concessão 12/6786, https://www.regionsyddanmark.dk/wm325002), The University of Southern Denmark (www.sdu.dk), Conselho de Investigação da Lillebaelt Hospital (https://www.sygehuslillebaelt.dk/wm223295), king Christian X Foundation (https://kongehuset.dk/Menu/Fonde–legater/Kong-Christian-den-Tiendes-Fond/kong-christian-den-tiendesfond), A Fundação Família Spogaard (https://www.cancer.dk/forskning/stoette-til-forskning/familien-spogaards-fond/), Aase e Fundação Danielsen Ejnar (número de concessão 10-000789, http: //www.danielsensfond .dk /Default.aspx) e membro do Parlamento J. Christensen e mulher K. Christensen Foundation. Todas as concessões mencionadas acima foram dadas ao KNK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. BSN é empregado por uma empresa comercial (Bioneer A /S, Dinamarca). O financiador forneceu apoio na forma de salário, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. BSN é utilizado por um empresa comercial (Bioneer A /S, Dinamarca). Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer colorretal é entre um dos cânceres mais comuns em todo o mundo [1]. Uma parte considerável destes cancros são acreditados para desenvolver-se de forma gradual a partir de mucosa do cólon normal, utilizando um adenoma pré-malignas para o adenocarcinoma invasivo, como resultado de alterações genéticas complexas e epigenética [2-4]. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de ARN mediar regulação pós-transcricional que têm sido implicados na carcinogénese colorrectal e progressão tumoral, agindo como oncogenes e supressores de tumor [5-7] não codificante. Os miRNAs, que geralmente contêm ~ 22 nucleotídeos, como alvo mais de 60% de todos os genes codificadores de proteínas [8], e cada miRNA pode potencialmente reprimir centenas de genes-alvo [9].

Os microRNAs são expressos como transcrições contendo um único miRNA como miR-21 ou um número de miRNAs maduros (polycistrons), como os cachos miR-143/145 e miR-17-92. O cluster de miR-17-92 contém seis miRNAs diferentes: miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a e miR-92a, com uma sequência muito semelhante entre miR-19a e miR-19b , e entre o miR-17 e miR-20a [10]. Todos os membros do cluster foram encontrados elevados no tecido canceroso colorrectal em comparação com o tecido normal, embora com diferentes expressão de cada componente individual [11-13]. Outros frequentemente descritos miRNAs regulados positivamente em cancro colorectal são miR-21 e miR-31 [14-16], enquanto que miR-145 está entre os miRNAs mais consistentemente down-regulamentado [15-18]. Além disso, o miR-135b tem sido relatada a ser envolvido em tumourogenesis precoce [19,20].

Apesar da investigação em curso enorme sobre miRNA no cancro colorectal, poucos estudos investigaram as mudanças miRNA ao longo de todo o normal- adenoma-adenocarcinoma (NA-AC) seqüência [20-24]. Bartley

et ai, achou um total de 230 miARNs expressos diferencialmente no modelo evolutiva NA-AC incluindo miR-17, o miR-19, o miR-92a, e miR-21 [21], enquanto que outros investigadores relataram miR-31 e miR-135b para estar entre os miRNAs mais frequentemente alteradas [20,22,25]. Também tem sido mostrado que o miR-21 sobre-regulação de adenoma ao adenocarcinoma é um resultado de um aumento da expressão em fibroblastos do estroma associadas a cancro, no micro-ambiente do tumor [26]. No entanto, as informações sobre a distribuição de tecidos e células de miRNAs no continuum da sequência N-A-AC ainda é escassa. Conhecimento de miRNA localização e expressão é de fundamental importância na compreensão do seu papel exato na iniciação, desenvolvimento e progressão do câncer de cólon.

Os adenocarcinomas em desenvolvimento em pólipos mucosas (ACP) oferecem a oportunidade única de estudar o início desenvolvimento sequencial de adenocarcinoma no mesmo paciente. Usando o ACP do cólon como um modelo da sequência NA-AC, o objetivo deste estudo foi descrever os padrões dos membros do cluster miR-17-92 de expressão, bem como miR-21, miR-31, miR-135b e miR-145 no desenvolvimento do cancro do cólon com foco em sua prevalência, distribuição de tecidos e origem celular.

Materiais e Métodos

o tecido investigado no presente estudo consistiu de dois conjuntos independentes de amostras clínicas, de diagnóstico: um conjunto de teste de nove, ACPs fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) e um conjunto de validação de 24 FFPE ACPs do cólon. Todos os blocos de tecido foram obtidos a partir do arquivo de diagnóstico da patologia do Departamento de Patologia Clínica, Vejle Hospital. Os espécimes para o estudo de teste foram inicialmente diagnosticados durante um estudo de viabilidade de rastreio do cancro do cólon conduzido de 2005 a 2006, no Condado de Vejle, Dinamarca, enquanto o conjunto de validação provenientes de pacientes encaminhados diagnosticados em Vejle Hospital de 2005 a 2009. Os adenocarcinomas Só convencionais foram foram excluídos os pólipos incluídos, e das mucosas contendo adenomas serrilhadas. A confirmação do diagnóstico e re-classificação dos componentes adenomatosos nos pólipos foram realizadas por um patologista gastrointestinal experiente. Informação detalhada do paciente é mostrada na Tabela 1.

No início do estudo, cada secção histológica continha todos os três componentes das ACPs,

i

.

e

. mucosa normal, tecido adenomatoso, e adenocarcinoma invasivo. No entanto, à medida que mais secções foram cortadas a partir dos blocos de tecido algumas áreas de interesse foram ausentes, e, portanto, duas amostras do conjunto de teste e até seis a partir do conjunto de validação falhou para dar os dados completos de todos os três compartimentos da sequência de NA-AC.

O estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética Regional científicos para a Southern Denmark (ID # S-20120075) e concedeu uma renúncia de consentimento informado. O estudo foi registrado na Agência de Protecção de Dados dinamarquesa, eo registro dinamarquesa de Utilização Human Tissue foi consultado antes foram utilizados quaisquer amostras de tecido.

Na análise de hibridação in situ

In situ

hibridação (HIS) para miR-17, miR-21, miR-145, miR-126, miR-31, miR-125b, miR-135b, miR-200b, miR-18a, miR19b , miR-20a, 92a e miR-foi essencialmente realizada como descrito anteriormente [27]. As sequências de sondas e de miARN detalhes experimentais são apresentados na Tabela S1. Em resumo, a análise ISH foi realizada com 6 mm de espessura, utilizando um instrumento Tecan Evo (Männedorf, Suíça). optimização Ensaio para determinar as concentrações óptima e temperaturas de hibridação da sonda foi realizada antes da análise. As secções foram pré-digeridas com proteinase-K (15 ug /ml) a 37 ° C durante 8 minutos, pré-hibridado a 57 ° C durante 15 minutos, e hibridado com dupla-carboxifluoresceína (FAM) marcado Locked Nucleic Acid (LNA) sondas (Exiqon A /S, Dinamarca). Após lavagens rigorosas em tampão de citrato de sódio salino-, as sondas foram detectados com conjugado com fosfatase de ovelha anti-FAM fragmentos Fab alcalina seguida por incubação no substrato contendo tetrazólio nitroazul-4 e 5-bromo-4-cloro-3′-indolilfosfato (Roche , Dinamarca), resultando em uma coloração azul-escuro, e, finalmente, contrastadas com vermelho nuclear rápido (Vector Laboratories, CA):

avaliação morfológica de expressão miRNA e β-catenina

Todas as lâminas foram avaliadas subjectivamente e teve semi-quantitativamente de acordo com a intensidade de miARN (0 = negativo, 1 = fraco, 2 = forte) e a proporção de células coradas (0 = 50%, 1 = 50%), excepto para o miR-21. A pontuação total foi determinado pela soma das pontuações de intensidade e proporção e dichotomising a soma em “baixa” (escore 0-1) ou “alta” (escore 2-3) expressão. Devido a uma ampla gama de miR-21 células positivas nas amostras, a proporção de miR-21 células coradas foi classificado como 0 = 1%, 1 = 1% -50% e 2 = 50%, eo pontuação intensidade foi empregue como descrito acima. A pontuação total miR-21 foi dividida em três categorias: 0-1 = baixa; 2-3 = moderado; 4 = elevada expressão.

Expressão

β-catenina foi avaliada para membranosa, citoplasmática, e coloração nuclear. Uma vez que a reacção citoplasmática foi homogeneamente distribuída pelos compartimentos tumorais, apenas a intensidade foi marcado (fraca, moderada e forte). Porque a coloração citoplasmática obscurecido a imunorreacção membranoso em muitas áreas adenomatosos e invasivos, a coloração das membranas não foi marcado nestes compartimentos. coloração nuclear foi dividida em dois grupos: = nenhuma reação nuclear negativa observada e positivo = variando de poucos espalhados células positivas, reação focal ou difusa reacção

Imagem análise

A avaliação morfológica documentado. um pronunciado aumento da regulação do miR-17 nas células epiteliais, que apelou à análise utilizando a seguinte abordagem objetiva: imagens de diapositivos inteiras digitais foram obtidos com um objetivo x20 usando um brilhante scanner de campo Axio digitalização Z1 (Carl Zeiss, Alemanha). A análise das imagens digitais das lâminas foi realizada usando software de VisiomorphDP (Visiopharm, Dinamarca). Nos 16 casos, estimativas quantitativas do sinal ISH miR-17 foram obtidos em regiões com mucosa normal do cólon (N), de baixo adenoma grau (OPL), adenoma alto grau (HGA), e adenocarcinoma, onde tais componentes de tecido homogéneas foram evidentes . As regiões identificadas por um patologista experimentado gastrointestinal e rodeado como regiões de interesse (ROI) nas lâminas integrais digitais. Oito casos foram analisadas em duplicado e os dados das duas lâminas foram reunidas. As áreas médias avaliadas (de ROIs) foram: N: 5.2 mm

2 (n = 24); LGA: 6,1 milímetros

2 (n = 9); HGA: 7,4 mm

2 (n = 21), e adenocarcinoma: 8.2 mm

2 (n = 24), onde n é o número de ROIs representativa. Um classificador de pixels foi treinado para discriminar o sinal ISH azul do counterstain vermelho, o tecido não corado e fracamente manchado, e as áreas livres de tecido, e com um limiar de intensidade discriminar azul médio de azul intenso. Os seguintes parâmetros foram obtidos durante o processamento de imagem a partir de cada ROI: área de azul médio, área de azul intensa, e a área total das ROIs indivíduo. As frações área relativa, áreas de azul intenso dividido com a área total (unidade arbitrária) médio +, foram consideradas representativas para miR-17 níveis de expressão relativa.

imuno-histoquímica (IHQ)

IHC foi realizado em 4 uM secções de tecido a partir dos mesmos blocos utilizados para análise ISH. EnVision FLEX +, Mouse, pH alto, (Link) (Dako, Glostrup, Dinamarca código K8002) foi usado para a recuperação de epitopo e coloração IHC.

Para a análise da fosfatase e homólogo angiotensina (PTEN), as lâminas foram incubadas com anticorpo PTEN (1: 200, Dako, Dinamarca, código M3627) durante 30 minutos, com o anticorpo amplificados ligação rato durante 20 minutos, seguido de detecção de peroxidase de rábano-polímero durante 30 minutos. coloração com anticorpo foi realizada num Dako Autostainer Plus (Dako, Dinamarca), utilizando 3,3′-diaminobenzidina como cromogénio e hematoxilina Mayers como contrastante. reação IHC completa negativo foi considerado como perda de PTEN.

Estado da proteína de reparação de incompatibilidade tinha sido realizada rotineiramente usando IHC em aproximadamente metade dos espécimes durante o procedimento de diagnóstico pato-anatômica primária. Os casos restantes foram coradas com anticorpos contra MLH1 (1: 100, Novocastra, UK, código NCL-L-MLH1), MSH2 (1: 100, Novocastra, UK, código NCL-MSH2), MSH6 (BD Transduction Laboratories, EUA, código 610919) e PMS2 (1: 500, BD Pharmingen, EUA, código 556415). As células não neoplásicas dentro e à volta do tumor serviu como controlo positivo interno, e para os controlos negativos foi omitido o anticorpo primário

analisa IHC para a actina do músculo liso (1: 1000, Dako, Dinamarca, M0851)., desmina (1: 400, Dako, Dinamarca, M0760) e h-caldesmona (1: 200, Dako, Dinamarca, M3557) foram realizados em amostras do conjunto de teste, enquanto que a análise por β-catenina (1: 2000, BD Biosciences, EUA , código 610153) foi realizada no conjunto de validação.

a análise estatística

contínuas de miR-17 os dados obtidos a partir da análise da imagem foram log-transformados para se obter uma distribuição normal dos resíduos. Para ajustar a variabilidade intra-sujeito, um modelo de regressão linear de efeitos mistos multivariada com efeitos aleatórios para ID espécime foi utilizada para examinar as correlações entre log-miR-17 e as co-variáveis ​​fixos: Tipo de tecido, idade, sexo, e histologia do adenoma. Depois, combinações lineares de estimadores foram usados ​​para comparar os níveis de expressão de miR-17 entre os grupos. Os valores de p inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises foram realizadas no STATA versão 13 (StataCorp, TX, EUA)

Resultados

Os casos de teste:. Avaliação morfológica

Com base em revisões da literatura [5-7,21 , 22,28-30], escolhemos examinar a expressão de miR-17, o miR-21, o miR-31, o miR-125b, o miR-126, miR-135b, o miR-145 e miR-200b no teste grupo de nove países ACP.

dos oito miRNAs testados, miR-17, miR-21 e miR-145 apresentaram expressão diferencial na sequência nA-AC (Fig 1A-1F). Em sete dos nove casos, um aumento da expressão de miR-17 nas células epiteliais foi visto na zona de transição do normal para o tecido adenomatoso. A expressão foi mantida nas células epiteliais cancerígenas. Em todas as amostras, miR-21 expressão foi predominantemente encontrada nas células do estroma fibroblasto das regiões displásicas e invasivos das ACPs com única reação esparsa e focal nas células epiteliais cancerosas. O padrão de expressão parece aumentar de um modo gradual ao longo da sequência N-A-C. Todos os casos mostraram forte expressão de miR-145 visto nas células de músculo liso (SMC) e células do músculo liso vascular (VSMC), bem como em células do estroma de tipo fibroblasto. As últimas células foram localizadas na proximidade das criptas epiteliais e pareceu diminuir no tecido canceroso e adenomatosa em seis dos sete casos disponíveis. IHC nas mesmas amostras revelou uma reacção positiva para o músculo liso α-actina e desmina, enquanto H-caldesmona foi negativo, o que sugere que estas células de miR-145-positivos são de origem miofibroblástica

(A . B ) miR-17 em condições normais (N) e adenomatosa (a) do tecido e no adenocarcinoma (AC); (C D) de miR-21 de expressão no estroma do adenoma em comparação com o tecido normal e nas células do estroma associadas a cancro (*). Um pequeno grupo de células epiteliais tumorais positiva também está presente (seta branca); (E) o miR-145 é vista nas células de músculo liso (setas) e células do músculo liso vascular (seta); na ampliação (F) uma redução do número de células semelhantes a fibroblastos positivos miR-145 são encontrados no adenoma (seta) em comparação com o tecido normal (ponta de seta); do sinal (L) Fraco miR-125b foi observada na mucosa muscularis (milímetros); (H) o miR-200B foi observada nas células epiteliais na base das criptas, mas neste caso também nas células cancerosas epiteliais; (I) o miR-126 é visto exclusivamente em células endoteliais; (J) A sonda corrida mostrou apenas discreta coloração de fundo.

Um sinal positivo para miR-125b, miR-126 e miR-200b estava presente nas amostras, no entanto, nenhuma expressão diferencial para qualquer destes três miRs foi observada quando se comparam os três compartimentos (Figura 1G-1-I). Um sinal de miR-125b fraco foi visto nos fibroblastos na mucosa normal e SMC em cinco de nove casos. Todas as amostras apresentaram células epiteliais positivas miR-200b, especialmente na base das criptas do cólon normais, bem como um sinal positivo no epitélio adenomatosa e canceroso. expressão de miR-126 foi confinada às células endoteliais e estava presente em todos os três compartimentos.

No expressão de miR-31 e miR-135b foi detectada nas amostras de teste nove.

Estudo de validação : avaliação morfológica de miR-17, o miR-21, e miR-145

expressão

com base nos resultados obtidos a partir do conjunto de teste, análise de miR-17, o miR-21, e miR-145 foram prosseguidas no conjunto de validação de 24 ACPs. O sinal de miR-17 foi encontrada exclusivamente nas células epiteliais. Baixa expressão foi observada nas células epiteliais normais na base das criptas, enquanto que uma expressão elevada foi observada na zona de transição do normal para o tecido adenomatoso em 96% (23/24) dos casos (Tabela 2). A expressão foi mantida no adenocarcinoma em 96% (22/23) dos casos, enquanto que o sinal diminuiu em um processo (4%). Apenas um exemplar mostraram um aumento da expressão de adenoma a um adenocarcinoma. Esses dois casos não diferiu clinicamente dos outros casos do conjunto de validação.

Em correspondência com as conclusões do conjunto de teste, miR-21 expressão foi predominantemente encontrada nas células do estroma em torno da displásicas e canceroso glândulas. Um caso, no entanto, mostrou expressão de miR-21 nas células epiteliais cancerígenas, e em três outros espécimes também foi observada expressão focal nas células tumorais epiteliais. Não há diferenças histopatológicas e clínicas foram documentadas entre esses quatro casos, em comparação com os outros 20 casos. expressão moderada de miR-21 apareceu na zona de transição do normal para o adenoma das células estromais em 71% (17/24) dos casos. Os casos restantes mostraram a expressão aumentada do adenoma a um adenocarcinoma (Tabela 2). Em 41% (9/22) dos casos, a sobre-regulação foi intensificada ao longo da sequência de NA-AC com uma expressão moderada de miR-21 no adenoma e alta expressão nos focos invasiva.

A análise de miR-145 mostrou células estromais de tipo fibroblasto pericryptal positivos na própria lâmina normais para além do SMC de artérias e camadas musculares na parede do cólon. Em metade dos casos, o número de pericryptal miR-145 positivo, as células semelhantes a fibroblastos diminuída na zona de transição do normal para o tecido adenomatoso. Esta diminuição foi ainda mais evidente quando comparando o normal para o tecido canceroso com uma redução observada em 86% (19/22) dos casos (Tabela 2). O sinal positivo no SMC e VSMC permaneceram inalterados em todos os três compartimentos.

Análise para miR-135b foi repetido em todos os espécimes de validação 24, mas nenhum sinal ISH foi encontrado. O caso com deficiência de proteína de reparo incompatível não exibir um perfil de expressão miRNA diferente dos casos proficientes, nem os três casos com metástase.

A expressão de β-catenina na sequência NA-AC

coloração membranoso e fraco predominante distinto citoplasmática de β-catenina estava presente em todos os 24 casos (100%) do epitélio não-neoplásica, enquanto nenhuma acumulação nuclear foi visto (S2 mesa e uma em S1 Fig). Nos componentes adenomatosos, expressão citoplasmática foi aumentada em 95% (20/21) dos casos (S2 tabela). 62% (13/21) dos adenomas também exibida coloração nuclear positiva, enquanto que isto foi visto em 95% (20/21) dos adenocarcinomas, na maioria das vezes na frente invasiva e /ou em células de tumor de brotamento (B + C em Fig S1). reação citoplasmática aumentada foi observada em todos os adenocarcinomas 21 (100%) (S2 tabela).

análise

Imagem de miR-17

Um subconjunto de 16 amostras escolhidas aleatoriamente a partir do conjunto de validação foi ainda examinado por análise de imagem para obter miR-17 estimativas quantitativas de expressão em áreas com tecido normal, LGA, HGA e adenocarcinoma. Estimativas da expressão de miR-17 foram obtidos como frações da área (

i

.

e

. Área manchada dividida com a área total) e as análises estatísticas foram realizadas em dados de log transformado. Os resultados da regressão linear misto multivariada são mostrados na Tabela 3. Log-miR-17 aumentou a partir de tecido normal de tecido adenomatoso baixo e alto grau e também para o cancro invasivo (p = 0,03, p 0,001 e p 0,001, respectivamente; intra coeficiente de correlação class = 0,19). A Fig 2 mostra um aumento total de 10% (da unidade arbitrária) ao longo da sequência de NA-AC, e que a sobre-regulação ocorreu de um modo passo a passo começando com um aumento de 2,4% do normal para LGA (p = 0,03) e uma aumento adicional de 6,9% de baixo grau para HGA (p 0,001). Não houve diferença no log-miR-17 de expressão foi observada na progressão de HGA para o adenocarcinoma (p = 0,84). O tipo histológico do adenoma, tubular, vilosidades ou túbulo-viloso, não foi associada ao log-miR-17 expressão, no entanto, uma associação com a idade dos pacientes do sexo masculino foi visto (p 0,001). (Tabela 3)

o aumento da expressão de miR-17 em adenoma de baixo grau (LGA), adenoma alto grau (HGA) e adenocarcinoma (AC) do cólon em comparação com o tecido normal

a expressão de miR-17-92 membros do cluster

miR-17 é um dos seis miRNAs maduros codificados do cluster policistr�ica miR-17-92. Assim, foram selecionados seis casos de validação definido com o subjectivamente mais forte expressão de miR-17 para uma análise mais aprofundada sobre ISH membros do cluster miR-18a, miR-19b, miR-20a e miR-92a. A sonda de miR-19b foi considerado comum para as duas isoformas de miR-19, como o miR-19a difere do miR-19b por apenas um único nucleótido fazer 100% discriminação improvável de ocorrer no ensaio ISH. A sequência sonda miR-17 difere de miR-20a por três posições de nucleótidos (S1 tabela). Os sinais de miR-19b, o miR-20a, 92a e miR-se, como o miR-17, confinado às células epiteliais, mas a expressão foi mais fraca do que a observada para o miR-17 (Figura 3A e 3C-3E). Um aumento da regulação foi observada na zona de transição do normal para o tecido adenomatoso, e a expressão sobre-regulada foi sustentado no adenocarcinoma. Um sinal de miR-18a muito fraco nas células epiteliais foi observada em quatro dos seis casos na zona de transição do normal para o tecido pré-canceroso (Fig 3B), enquanto o sinal ISH mais intensa foi encontrada em algumas pequenas, arredondadas células linfócitos-like no estroma da lâmina

(a) Expressão de miR-17.; (B) miR-18a; (C) o miR-19b; (D) miR-20a; (E) miR-92a e (F) sonda corrida em condições normais (N) e (A) do tecido adenomatosa. Observe o aumento da intensidade de coloração nas criptas adenomatosos em comparação com a cripta normal.

expressão de PTEN não está relacionado com miR-17 ou miR-21 expressão

Todos os casos de ambos os conjuntos de estudo foram coradas para PTEN, um alvo validada tanto para miR-17 e miR-21 [31,32]. No conjunto de validação, 21% (24/05) dos ACPs mostrou uma completa perda de PTEN, mas apenas dentro de focalmente no epitélio da adenomatosa e /ou áreas invasivas. No entanto, não foi observada uma associação inversa de PTEN e miR-17 expressão e miR-21 expressão. Sem perda de PTEN foi vista os casos de teste nove.

Discussão

Neste estudo, utilizou-se amostras clínicas, diagnóstico de lesões no cólon contendo a sequência NA-AC para explorar a expressão de uma série de miARNs conhecidos da literatura [5-7,28] para ser expresso durante o desenvolvimento de cancro do cólon; miR-17, miR-21, miR-31, miR-125b, miR-126, miR-135b, miR-145 e miR-200b. Empregando ISH cromogénico, descobrimos que a expressão de miR-17, miR-21 e miR-145 foi particularmente dinâmico nas primeiras fases de desenvolvimento de câncer de cólon. A análise das imagens das lesões coradas miR-17 indicou que este miARN é induzida no início da transição a partir de N para LGA e ainda mais dramaticamente a HGA. A expressão de miR-17 verificou-se ser de origem epitelial, como também foi o caso para os outros miARNs no cluster de miR-17-92. miR-17 foi encontrado para ser o miRNA mais prevalente do cluster miR-17-92.

Nosso estudo é o primeiro a mostrar que o miR-17

in situ

expressão aumenta início do normal mucosa para LGA e atinge um patamar de expressão no HGA que não está exagerada no adenocarcinoma manifesto. Este resultado é consistente com os achados de Bartley

et al

, que relataram um padrão de expressão semelhante miR-17 utilizando qRT-PCR [21]. Outros estudos descobriram que miR-17 níveis continuaram a subir a partir de adenoma de adenocarcinoma [11,33,34], mas ao contrário do nosso estudo e os achados de Bartley

et al

, estes estudos não compararam tecido obtido a partir dos mesmos indivíduos, e pode, assim, ser associado com o aumento da variação inter-individual.

Baseado na comparação simples, morfológica das intensidades de coloração sinal de ISH, encontramos o miR-17 a ser o mais regulada para cima no membro de cluster tanto adenomatosa e canceroso de tecido, seguido de miR-92a, miR-20a, miR-19b, e miR-18a. Humphreys

et ai

, utilizando a técnica de qRT-PCR, também encontrado miR-17 a ser o mais elevado miR expressa no cluster de miR-17-92 em Dukes A e C cancros colorrectais [13], enquanto que qRT-PCR os resultados de outros estudos encontraram miR-92a para ser a miARN mais profundamente expressa em adenomatosa e /ou tecido canceroso colorrectal [11,12,33]. Todos estes três estudos, entretanto, corroboram a nossa conclusão de que o miR-18a é o membro do cluster menos expressa, e que miR-19a /b e expressão de miR-20a são consistentemente mais elevada do que o miR-18a [11-13,33]. Não se pode excluir que a afinidade de ligação (temperaturas de fusão) das sondas LNA empregados podem ter contribuído para as diferentes intensidades de coloração observada.

Nós encontramos a expressão de todos os membros do cluster miR-17-92 estudado para ser confinada às células epiteliais. Descobertas similares de miR-17 e expressão de miR-92a foram relatadas por outros investigadores [31,33-35], embora um grupo também observados alguns miR-17 positivos células estromais [35]. Curiosamente, observou-se um sinal de miR-18a intensa em algumas pequenas, arredondadas células estromais de linfócitos-como na lâmina própria em quatro das seis amostras. No entanto, uma vez que nenhum outro membro do conjunto foi expressa, o sinal é mais provável para representar a hibridação cruzada com um outro alvo de ARN.

O papel de miR-17 em células epiteliais de cólon no desenvolvimento do cancro é ainda pouco claro. Uma função possível poderia ser a inibição do factor de transcrição E2F 1,

E2F1

, um gene supressor tumoral putativo. A expressão aumentada de E2F1 tem sido associada com a proliferação diminuída e aumento da apoptose no cancro colo-rectal [36,37]. Curiosamente, uma relação inversa entre E2F1 e miR-17 foi demonstrada em tecido de cancro do cólon [35,38]. Monzo

et ai mostraram que a transfecção de anti-miR-17 resultou num aumento da expressão E2F1 e diminuição da proliferação de células [35], e Kanaan

et ai mostraram que a transfecção de miR-17 para dentro HT-29, células de adenocarcinoma colorectal levar à diminuição da expressão E2F1 [39]. Em um estudo sobre a diferenciação neuronal linhagem de células-tronco somáticas sem restrições, uma interação direta entre o miR-17 e E2F1 tem sido documentado [40]. Assim, o aumento da expressão de miR-17 em células epiteliais de cólon poderia contribuir para tumourogenesis, promovendo a proliferação celular. Estudos adicionais são, de facto necessários para avaliar a relação entre o miR-17 e E2F1 em câncer colorretal e vai exigir um exame cuidadoso da respectiva expressão em regiões morfologicamente características suficientes presentes em tais amostras únicas. Os conjuntos de estudo empregadas neste estudo não permitem a análise adicional uma vez que as regiões representativas, não está mais disponível estavam em uma fração substancial do material.

O putativo onco-miR, miR-21, foi encontrada principalmente em células estromais em torno das displásicas, células epiteliais adenomatosos e cancerosos. A intensidade de expressão de miR-21 aumentou ao longo da sequência N-A-AC com a expressão mais elevada visto no estroma associado a um cancro. Nossos resultados confirmam os achados de Yamamichi

et al

[26]. Com exceção de um caso com miR-21 epitélio tumoral positiva apenas, um predominantemente estromal miR-21 expressão foi exibido nos restantes 23 + 9 espécimes. Considerando o pequeno tamanho da amostra usada no estudo de Yamamichi

et al

, bem como este atual, não se pode excluir totalmente a possibilidade de que mais cedo expressão de miR-21 poderia ser um fenômeno epitelial. No entanto, grandes estudos sobre o miR-21 em cancros colorrectais mais avançados demonstram claramente o miR-21 a ser localizada no compartimento estromal [27,41,42].

Observou-se que o número de miR-145 positivo, células de fibroblastos-like pericryptal foi reduzida gradualmente na sequência nA-AC. Diminuição dos níveis de miR-145 em comparação com cancro colo-rectal cólon normal, tal como medido por qPCR, têm sido encontrados em numerosos estudos, e miR-145 tem sido considerada um possível supressor de tumor. No entanto, recentemente esta teoria foi contestada [43]. Usando ISH, Chivukula

et al, achou que o miR-145 é expressa apenas em células mesenquimais e células não epiteliais do cólon do rato, enquanto que miR-145 era quase indetectável por qRT-PCR em rato purificada e epitélio intestinal humana [ ,,,0],44].