Abstract

O câncer de pâncreas (PDAC) é uma doença letal com uma sobrevida de 3- cinco anos 5%. Mutações em K-Ras são encontrados em quase todos os casos, mas K-ras só por si não é suficiente para o desenvolvimento de PDAC. Os factores adicionais contribuem para a activação da sinalização de Ras e levar à formação de tumores. A galectina-3 (Gl-3), uma proteína β-galactósido de ligação multifuncional, é altamente expresso em PDAC. Por isso, investigamos o papel funcional da Gal-3 na progressão do cancro pancreático e sua relação com a sinalização Ras. Expressão de Gal-3 foi determinada por imuno-histoquímica, Q-PCR e imunotransferência. Estudos funcionais foram realizados utilizando linhas de células pancreáticas geneticamente manipuladas para expressar níveis elevados ou baixos de Gal-3. atividade Ras foi analisada por ensaios de pull-down Raf. Co-imunoprecipitação e imunofluorescência foram utilizados para avaliar as interacções proteína-proteína. No presente estudo, nós demonstramos que a Gal-3 era altamente regulados positivamente em tumores humanos e em um modelo de rato mutante K-Ras de PDAC. A regulação negativa da Gal-3 por lentivírus shRNA diminuição da proliferação de células PDAC e invasão in vitro e reduzido volume e tamanho do tumor num modelo ortotópico de rato. Gal-3 ligado Ras e mantida atividade Ras; a sub-regulação de Gal-3 diminuiu a actividade de Ras, bem como a sinalização de Ras a jusante, incluindo a fosforilação de ERK e AKT e Ral Uma actividade. Transfecção de cDNA Gal-3 em células PDAC com baixo nível Gal-3 aumentada atividade Ras e sua sinalização a jusante. Estes resultados sugerem que a Gal-3 contribui para a progressão do cancro do pâncreas, em parte, através da ligação de Ras e activação de sinalização de Ras. Gal-3 pode, portanto, ser um novo alvo potencial para esta doença mortal

Citation:. Canção S, Ji B, Ramachandran V, Wang H, Hafley M, Logsdon C, et al. (2012) overexpressed galectina-3 no cancro do pâncreas induz a proliferação celular e invasão por ligação Ras e ativar Ras sinalização. PLoS ONE 7 (8): e42699. doi: 10.1371 /journal.pone.0042699

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de fevereiro de 2012; Aceite: 10 de julho de 2012; Publicação: 10 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Song et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi financiado pelo National Institutes of Health /National Cancer Institute conceder R01CA69480 (RSB), American Award Gastroenterological Association Research Scholar (S. Song) e Serviço de Saúde Pública Grant DF56338, que suporta as Doenças Texas Medical Center digestivos Center (S. Song) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas ductal adenocarcinoma (PDAC) é atualmente a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer, com uma estimativa de 43.140 novos casos e 36.800 mortes nos Estados Unidos [1]. Devido ao seu crescimento agressivo, com disseminação metastática precoce ea falta de terapias eficazes, a taxa de sobrevivência de cinco anos para esta doença permanece em 3-5% [2]. Um esforço considerável foi, portanto, feito para compreender os eventos moleculares que podem conduzir a patogênese da PDAC. Entre as numerosas alterações moleculares identificados em PDAC, mutações no pró-oncogene K-Ras são encontrados em quase todos os casos, [3] e é um evento precoce para o desenvolvimento de PDAC [4]. K-ras só por si não é suficiente para o desenvolvimento de PDAC. mutações de K-Ras são frequentemente encontradas na pancreatite crónica e pode até ser encontrado em indivíduos normais [5]. Além disso, a mutação K-ras em um modelo de rato com baixa actividade de Ras não espontaneamente levar ao desenvolvimento de [6] PDAC, enquanto mutação K-ras em um modelo de rato com um nível elevado de actividade de Ras está associada com desenvolvimento rápido de PB com fibrose abundante e progressão para PDAC que imita a doença humana [3]. Por conseguinte, foi proposto que a é a actividade de K-Ras, em vez de a presença da mutação per se, que é o parâmetro de interesse biológico associado com a patogénese do cancro pancreático [2]. Factores adicionais que são necessários para a actividade do RAS contribuir; No entanto, os mecanismos através dos quais a actividade do RAS é ainda activados são em grande parte desconhecida.

galectina-3 (Gl-3), uma proteína de b-galactósido de ligação apresenta funções biológicas pleiotrópicas e patológicas, e tem sido implicado na célula o crescimento, diferenciação, adesão, o processamento do ARN e transformação maligna [7] – [10]. Gal-3 é encontrada em vários compartimentos celulares, incluindo o citoplasma, a superfície da célula, o núcleo, e Gal-3 também é segregada [11]. O significado da expressão de Gal-3 foi avaliada em muitos tipos de cancro, incluindo o cancro pancreático [12] – [16]. Vários estudos têm indicado que o ARNm de Gal-3 é sobre-regulada em tecidos de tumor pancreático em comparação com os tecidos de controlo [15], [17], [18], [19], e supressão transiente da galectina-3 foi avaliado para induzir pancreático cancro migração celular e invasão [16]. Wang et al descobriram que Gal-3 também foi regulado para cima em pancreatite crônica e sugeriu que ele estava envolvido em ambas as matrizes (ECM) mudanças extracelular e formação do complexo ductal [20]. No entanto, o significado completo de Gal-3 em PDAC permanece pouco clara e pouco se sabe sobre os possíveis mecanismos de função de Gal-3 na patogênese da PDAC. Recentemente, Kloog e colegas demonstraram que a K-RAS GTP recruta Gal-3 a partir do citossol para a membrana de plasma onde se torna um componente integrante nanocluster. O nível citosólico de Gal-3 determina a magnitude do sinal de saída nanoclustering e K-Ras de GTP em células de cancro da mama [21]. Mais recentemente, as observações do mesmo grupo demonstrou que a associação K-Ras com Gl-3 contribui para a malignidade da tiróide [22]. Desde mutações no K-Ras são quase universais no PDAC eo nível de Ras atividade parece ser um mecanismo fundamental controlar o desenvolvimento de PDAC, procurou-se determinar se Gal-3 afeta a atividade Ras contribuindo para a patogênese do câncer de pâncreas.

neste estudo, avaliou-se sistematicamente a expressão de Gal-3 em 120 tecidos pancreáticos humanos aos pares a partir de pâncreas normal, pancreatite e tumores pancreáticos, e pela primeira vez, determinou-se a expressão da Gal-3 em tecidos e células tumorais derivadas a partir de um modelo de rato mutante K-Ras de câncer pancreático. Nós estendemos os resultados de estudos anteriores, e delineada ainda mais a função de Gal-3 in vivo e in vitro no que diz respeito à formação de cancro pancreático. Gal-3 expressão foi aumentada em cancros do pâncreas e células cancerosas, e estimulou a proliferação das células do câncer de pâncreas e de invasão e crescimento do tumor promovido. Gal-3 se liga Ras e aumenta a atividade Ras e sinalização a jusante. Estas observações suportam a conclusão de que Gal-3 pode ser um novo alvo potencial para esta doença mortal.

Materiais e Métodos

estudos relacionadas com os animais foram aprovados pelo MD Anderson Cancer Centro institucional IACUC comissão (ACUF 09-04-08832). Todos os outros estudos aqui apresentados foram o investigador-iniciado e não necessitam de aprovação de outros órgãos reguladores.

Células e reagentes

linhas celulares Paca Humano (L3.6pl, BxPC-3, Mpanc96, Panc-1, e MiaPaCa-2) foram fornecidos gentilmente pelo Dr. C. Logsdon (Departamento de Biologia do Câncer) e Dr. S. Guha (Departamento de Gastroenterologia, Hepatologia Nutrição) em UT MD Anderson Cancer Center e foram descritos anteriormente [23], [31]. Todas as identidades de linha de células foram verificadas por DNA fingerprinting. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos (100 ug /ml de estreptomicina e 100 IU /mL de penicilina). Obteve-se anticorpo anti-Gal-3, como descrito previamente [8]. O anticorpo anti-Ras monoclonal, anticorpo monoclonal anti-rala, anti-fosfo-AKT e anticorpos anti-fosfo-ERK foram de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Anti-ciclina D1 e anticorpo anti-C-MYC foi de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).

o isolamento das proteínas e análise de imunotransferência

Total de lisados ​​de células de cancro pancreático humano, incluindo e um modelo de ratinho K-Ras G12D [25] foram preparadas em 2% de tampão de lise de SDS como previamente descrito [9]. Citoplasmática e extracções nucleares foram preparados utilizando NE-PER citoplasmáticas de extracção Reagentes e Nucleares (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante. análises de Western blot foram realizados conforme descrito anteriormente [9].

Geração de estável silenciamento Gal-3 e com superexpressão linhas celulares PADC com lentivírus shRNA

Para produzir lentivírus para Gal-3 superexpressão (L- GAL3) ou Gal-3-shRNA (A3), pLVTHM-GAL3 ou pLVTHM-shGal3, respectivamente, e vector de controlo foram co-transfectadas com o plasmídeo de empacotamento (MD2G) e do plasmídeo envelope (PAX2) necessário para a produção virai em 293FT células utilizando lipofectamina 2,000 reagente (Invitrogen). Meio contendo lentivírus com Gl-3 shRNA (chamado A3) e o vector de controlo (chamado GN10) foi utilizado para transduzir Mpanc96, MiaPaCa-2 e linhas celulares de Panc-1 com elevados níveis de expressão de Gal-3. Meio contendo lentivírus com Gl-3 sobre-expressão (denominada G-gal-3) e o vector de controlo (denominada V) foi utilizado para transduzir linhas de células BxPC-3 e L3.6pl PACA com baixa expressão de Gal-3. separação de células foi conduzida de uma ARIA de separação de células activada por fluorescência de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences). Gal-3 Expressão de linhas de células estáveis ​​foi ainda confirmada por bloting Ocidental.

proliferação celular ensaio

A viabilidade celular foi medida utilizando o kit de One Solution celular Ensaio de Proliferação de CellTiter aquoso como descrito [24].

ensaio de formação de colónia de agar macio

5 × 10

3 MPanc96 células que expressam de forma estável pLVTHM vetor de controle pLVTHM-shRNAGal3 ou foram misturados com 0,6% de agar em DMEM. As misturas de células /agar foram colocados em placas de 6 poços revestidas com 0,3% de agar em triplicado. As células foram incubadas a 37 ° C durante 10 dias. Colónias foram coradas com Diff-Quik (Dade Behring). A experiência foi repetida três vezes de forma independente.

Co-imunoprecipitação

Co-imunoprecipitação em GN10 controlo e Gal-3 células shRNA A3 de ambas as células Panc-1 e Mpanc96 foram realizadas como descrito [9 ].

Ras e Ral Um ensaio de atividade

quantidades iguais de proteína ligado celular de células de controlo GN10 ou células Gal-3 A3 shRNA de Panc-1 e Mpanc96 ou BxPC-3 G-gal -3 e o seu controlo BxPC-3 V foram incubadas durante 45 min a 4 ° C, com esferas de agarose revestidas com RAF1-RBD para a actividade do RAS, total ou pérolas de agarose revestidas com agarose Ral BP1 para o total Ral Uma actividade (Upstate Biotechnology, Inc. , Lake Placid, NY). As pérolas foram então lavadas e a proteína ligada foi eluída com 2 × tampão de amostra de Laemmli, que tinha sido pré-aquecido a 95 ° C e analisados ​​por imunotransferência por Ras utilizando o anticorpo anti-Ras ou actividade rala utilizando anticorpo anti-rala.

Matrigel invasão ensaio

A capacidade invasiva de células foi determinada utilizando câmaras de invasão Matrigel-revestidas com tamanho de 0,8 poro (BD Biosciences). Uma suspensão de uma única célula contendo 1 × 10

5 células foi adicionado à câmara interior. Após 16 h de incubação a 37 ° C em 5% de CO2, as células sobre a superfície superior da câmara interior foram removidos com cotonetes de algodão. células invadidas que aderiram na superfície inferior da membrana foram fixadas, coradas com Diff-Quik (Dade Behring), e contadas.

coloração por imunofluorescência indirecta e microscopia confocal a laser

coloração por imunofluorescência indirecta em células BxPC-3 foram realizados como descrito [9]. Expressão e localização das proteínas foram observados sob um sistema de microscópio confocal (FluoView FV500; Olympus, Melville, NY) e analisados ​​por CellQuest software PRO (BD Biosciences, San Jose, CA) na Citometria de Fluxo e Análise de Imagem Núcleo laboratório na Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center.

real-time polymerase chain reaction

Para quantificar as alterações nos níveis de ARNm de Gal-3, em tempo real de RT-PCR foi realizada no ABI Prism 7900 ( Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando o ensaio comercialmente disponível para a expressão do gene Gal-3 (Mm00802901_m1), e a ciclofilina a (4326316E; Applied Biosystems), como descrito anteriormente [9]. O 7900 Sequence Detection System 2.2 software (Applied Biosystems, Foster City, CA) determinou automaticamente o fold-change para Gal-3 em cada amostra usando o método δδCt com 95% de confiança.

Imunohistoquímica

coloração imuno-histoquímica para GAL3 foi realizada em lâminas de tecido microarray que consistem em 125 adenocarcinomas do ducto pancreático e seus tecidos pancreáticos não neoplásicas pares de pacientes submetidos a pancreaticoduodenetomy no MD Anderson Cancer Center. Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board of M. D. Anderson Cancer Center. Após recuperação do antígeno e o bloqueio da peroxidase endógena, as secções foram então incubadas com anticorpo contra GAL3 (1:100 diluição) a 4 ° C durante a noite, em seguida, incubadas com o anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 60 min. Padrão análise imuno-histoquímica de avidina-biotina de cortes foi realizada de acordo com as recomendações do fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Os resultados de coloração foram avaliadas por um patologista (HW) com base na percentagem de coloração em células tumorais (0, nenhuma coloração; 1, ≤10%; 2, 10-50% e 3, 50%) e a intensidade da coloração (0-negativa, 1-fraco, 2-moderada e forte 3-). Os tumores foram classificados em GAL3-baixa (scores≤3 combinado) e GAL3 de alta (pontuação combinada ≥4).

Othotopic modelo PADC

MPanc96 células estavelmente transfectadas com Gal-3 shRNA e vetor de controle correspondente foram transduzidas estavelmente com luciferase como descrito anteriormente [25], [26]. Os animais foram divididos em 2 grupos (n = 5 por grupo). O primeiro grupo foi injectado com células MPanc96 que foram transfectadas com vector (GN10) e apenas o segundo grupo com as células transfectadas com MPanc96 Gal-3 shRNA (A3). Os animais foram anestesiados com a solução de cetamina-xilazina, uma pequena incisão de flanco abdominal esquerda foi feito, e (1 × 10

6) MPanc-96 células em 50 ul de PBS foram injectadas na região subcapsular do pâncreas, usando um calibre 27 agulha e um dispositivo calibrado impulso controlado por botão de distribuição (Hamilton Seringa Company). A ferida abdominal foi fechada por uma camada com agrafos (Braintree Scientific, Inc.).

Uma semana após a implantação, os volumes dos tumores foram monitorizados semanalmente por não-invasivo de imagem de bioluminescência em tempo real por IVIS 200 (Xenogen) utilizando um sistema de imagem criogenicamente arrefecida bioluminescência acoplado a um software de aquisição de imagens de dados de computador correr habitável (Xenogen) como anteriormente descrito [23]. Os ratinhos foram fotografadas no dia 7, 14, 21, e 28 após a implantação células tumorais. Os animais foram sacrificados no dia 28 após a implantação de células de tumor. Os tumores primários no pâncreas foram excisadas, eo peso final foi medida. Todas as medidas foram comparadas entre os dois grupos usando o

t

teste de Student não pareado. O tecido de tumor e órgãos circundantes foram embebidos em parafina e cortes de 5 ^ m em série foram cortadas, coradas com hematoxilina-eosina, e examinadas por microscopia de luz para verificar a presença de tumor e metástases microscópicas. Os tecidos tumorais foram processados ​​para imuno-histoquímica e coradas para a expressão da galectina-3, Ras e phopho-ERK. tal como descrito acima.

A análise estatística

Os ensaios são apresentados nos gráficos como média ± DP e representam os resultados de pelo menos três experiências. Significância das diferenças entre os grupos foi julgado utilizando um Student bicaudal

t

teste. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o

P

valor foi . 0,05

resultados

Gal-3 é altamente regulado para cima em tecidos tumorais pancreáticas humanas

perfil de expressão gênica estudos sugerem que a Gal-3 é sobre-regulada em tumores pancreáticos em comparação com tecidos de controlo [18], [19]. Foi realizada a coloração imuno-histoquímica de tecidos pancreáticos humanos micromatrizes com GAL3 anti-anticorpo (Figura 1A). Descobrimos que Gl-3 expressão aumentada progressivamente na sequência de progressão da doença normais (Figura 1A, a, b), pancreatite (c, d) e o adenocarcinoma ductal pancreático (E, F). Gal-3 coloração foi classificada em dois grupos, Gal-3 Baixa (pontuação 3) e Gal-3-alta (marcar 4), com base na intensidade de coloração e a percentagem de coloração positivo tal como descrito em Materiais e Métodos. Descobrimos que 83 dos 125 (66,4%) amostras de adenocarcinoma do ducto pancreático mostrou altos níveis de Gal-3 expressão (GAL3 de alta). Entre estes casos, emparelhados tecidos pancreáticos não neoplásicas estavam disponíveis para avaliação em 108 casos (72 amostras de pancreatite crónica e 36 amostras de tecidos normais do pâncreas) e 32 (29,6%) foram GAL3-alta. Gal-3 expressão foi significativamente mais elevada no adenocarcinoma ductal pancreático do que as amostras emparelhadas não neoplásicas do tecido pancreático (p 0,0001). 28 de 72 (38,9%) amostras foram pancreatite crónica GAL3-elevado em comparação com 11,1% (4/36) de amostras normais de tecido de pâncreas (P 0,001) (Figura 1B). Estes dados indicam que a Gal-3 é sobre-regulado durante a progressão da doença pancreática humana normal, pancreatite e adenocarcinoma ductal pancreático.

a, lâminas Tissue microarrays que consistem de 125 adenocarcinoma ductal pancreático e emparelhado amostras de tecido pancreático não neoplásicas imunoistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal de Gal-3 como descrito em Materiais e Métodos. Gal-3 expressão foi aumentado ao longo da doença sequência normal (Figura 1A, a, b), pancreatite (c, d) e o adenocarcinoma ductal pancreático (E, F). B. Resumo da Gal-3 IHC dos microarrays de tecido PDAC. Os tumores foram classificados em GAL3-baixo (pontuações combinadas das ≤3) e GAL3-alta (pontuação combinada ≥4) com base na percentagem de Gal-3 coloração em células tumorais (0, nenhuma coloração; 1, ≤10%; 2, 10-50% e 3, . 50%) e a intensidade da coloração (0-negativa, 1-fraco, 2-moderada e forte 3-)

Gal-3 é altamente up- regulada em tecidos tumorais pancreáticas e células de um K-Ras rato mutante modelo

a descreveu recentemente rato modelo K-Ras mutante recapitula a sequência de progressão do cancro pancreático humano de inflamação PanIN a PDAC [25]. Era interessante determinar se este modelo de ratinho também imitar as alterações na expressão de Gal-3 observadas em amostras humanas. Como mostrado na Figura 2A, Gal-3 não foi detectável em tecidos normais do pâncreas de ratos (pistas 1-3), mas altamente sobre-regulada em sete linhas de células de tumor (pistas 4-10), que foram derivados a partir de sete diferentes tumores de ratinho.

A. Gal-3 expressão foi analisada em células derivadas de pâncreas normal e tumores pancreáticos a partir de ratinhos mutante K-Ras por transferência de Western como descrito em Materiais e Métodos. B. PCR em tempo real quantitativa de Gal-3 expressão de ARN utilizando iniciadores específicos de Gal-3 depois da extracção do ARN total a partir de pâncreas normal, tecidos pancreatite e tumores pancreáticos e de células isoladas a partir de diferentes tumores provenientes de um modelo de rato mutante K-Ras como descrito em Materiais e Métodos. Dobre a mudança de determinações realizadas em triplicata.

A fim de determinar se mRNA Gal-3 também foi regulado para cima em tecidos tumorais do mouse em comparação com tecidos normais e pancreatite, tecidos de camundongos individual que eram normais, tiveram pancreatite ou aqueles com tumores foram extraídos e PCR em tempo real foi realizado utilizando de ratinho específico de Gal-3 iniciadores (Mm00802901_m1, Ambion, EUA) (Figura 2B). Observou-se que a Gal-3 foi baixa expressão em tecidos normais do pâncreas (pistas 1-3), mas aumentou 10-27 vezes na pancreatite crónica (pistas 4-9) e aumentou 45-215 vezes em K-RAS tecidos tumorais de rato mutante (pistas 10-12). níveis de mRNA Gal-3 foram ainda maior (62 vezes a 831 vezes), quando medido em células tumorais isoladas (pistas 13-24).

Geração de Gal-3 sobre e sub-expressando células PDAC

de modo a manipular os níveis de Gl-3 em células PADC, determinou-se em primeiro lugar o nível de expressão de Gal-3 em uma variedade de linhas celulares PADC (Figura 3A, painel superior). MPanc96, MiaPaCa-2 e Panc-1 células teve alta expressão basal de Gal-3 (Figura 3A) e foram transfectadas de forma estável com apenas células (GN10) (células A3) shRNA Gal-3 lentivírus ou vector. A galectina-3 níveis foram reduzidos com sucesso em MiaPaCa-2, Panc-1 e células Mpan96 90%, 95% e 92%, respectivamente (Figura 3A, painel do meio). De modo a estudar os efeitos da sobre-regulação da galectina-3, Gal-3 lentivírus ADNc foram transfectadas em células basais PDAC com menores níveis de Gl-3 (Figura 3A, painel inferior). Estas variantes foram designadas como G-GAL3 e V (controlo de vector), como mostrado na Figura 3A, painel inferior. Estas células PDAC foram usados ​​para determinar ainda mais a função de Gal-3 na patogênese do câncer de pâncreas.

A. expressão de Gal-3 em diferentes linhas de células como determinado por PDAC blotting (painel superior) Ocidental. Knockdown Gal-3 por shRNA lentivírus de GAL3 (A3) ou vector de controlo (GN10) em Gal-3 elevada de células linhas- Mpanc96, MiaPaCa-2 e Panc-1 foram determinados por imunotransfer�cias (Figura 3A, painel médio). A sobre-expressão de células de Gal-3 no BxPC-3 e L3.6pl inferior GAL3 expressa por células de infecção por lentivírus GAL3 ADNc (L-GAL3) ou controlo de vector (V) foi confirmada por imunomanchas (Figura 3A, painel inferior. B. Efeitos de Gal -3 sobre a proliferação celular. proliferação de MiaPaCa-2, e em que Mpanc96 células Gl-3 foi regulado negativamente pelas células shRNA ou BxPC-3 e L3.6pl em que sobre-expressa pelo ADNc de Gal-3 foi determinada utilizando o CellTiter Aqueous kit de Ensaio de Proliferação de células Uma solução, tal como descrito em Materiais e Métodos. C. Efeito de Gal-3 no invasão de células de cancro em células PDAC. campos representativos são mostrados células PDAC (1 × 10

5) em que Gl-3 expressão foi derrubado por shRNA (A3) e as células de controlo do vector transfectadas (GN10) foram semeadas em câmaras de invasão Matrigel-revestidas; 24 horas mais tarde, as células invadidas que aderiram à superfície inferior da membrana foram fixadas, coradas com Diff conjunto Quick, e contam como descrito em Materiais e Métodos D. gráfico de barra por cento de Invasão em ambas as células e Mpanc96 MiaPaCa-2 com GAL3 knockdown (A3) ou de controlo (GN10) representa a média de três experiências independentes realizadas em triplicado.; bares, erros padrão, p . 0.001

Gal-3 regula a proliferação celular, invasão e formação de colónias em células PADC in vitro

A fim de determinar se Gal-3 desempenha um papel funcional no comportamento de células de tumor de pâncreas in vitro, utilizou-se linhas de células geneticamente alteradas para expressar diferentes Gal 3 níveis, como mostrado na Figura 3A para determinar os efeitos de Gal-3 no crescimento das células do tumor (ensaio MTS), invasão ensaio de invasão de Matrigel ( ) e na tumorigenicidade in vitro (ensaio de formação de colónia de agar macio). Derrube de Gal-3 em células MiaPaCa-2 e Mpanc96 diminuiu significativamente o crescimento celular às 72 horas (Figura 3B, painel superior). Numa experiência complementar, a sobre-expressão de Gal-3 no L3.6PL e BxPC-3 (L3.6PL células-L-GAL3 e BxPC-3-L-GAL3) aumentou a proliferação de células em comparação com células de controlo L3.6PL-V e BxPC-3-V (Figura 3B, painel inferior). Para investigar se a Gal-3 afecta as capacidades invasivas das células PDAC, foram realizados ensaios de invasão de Matrigel. Regulação negativa de Gal-3 (A3) em MPanc96 e células MiaPaCa-2 diminuiu a invasão de células por 95% e 90% respectivamente, em comparação com células de controlo (Figura 3C e 3D). Em contraste, o ADNc GAL3 células expressaram BxPC-3-L GAL3 aumento da capacidade de invasão de células (dados não apresentados). Estes resultados indicam que Gal-3 também desempenha um papel importante na invasão de células PDC.

Além disso, a infra-regulação de Gal-3 por shRNA em células MPanc96 (MPanc96 A3) diminuiu drasticamente número de colónias em soft ágar comparação com os controlos transfectados com vector (figura 4A, 4B) os painéis de topo, enquanto que a sobre-regulação de Gal-3 em células BxPC-3 aumentou significativamente os números de colónias comparativamente com os controlos (Figura 4A, 4B painéis inferiores). Estes dados indicam que Gal-3 níveis influenciar célula PDAC proliferação, invasão e crescimento independente de ancoragem.

A. Os ensaios de formação de colónias foram realizados em células de controlo MPanc96 GN10 e Gal-3 shRNA derrubar células A3 (painel de cima) ou células de controlo BxPC-3 V e BxPC-3 de ADNc GAL3 overexpressed células (painel inferior) de L-GAL3 como descrito em Materiais e Métodos. células MPanc96-A3 formado colônias menores e menos em comparação com as células de controlo do vector transfectadas (GN10). Em contraste, as células BxPC-3-G GAL3 formada maior e um maior número de colónias do que as células de controlo V. gráfico B. Bar no painel da direita demonstra o número de colónias médios após o plaqueamento a utilização de células de controlo MPanc96 GN10 e shRNA derrubar células A3 (em cima) ou BxPC-3 V e BxPC-3 L-GAL3 (inferior); p 0,001. C. Representante imagens bioluminescência de ratinhos atímicos 3 semanas após o implante ortotópico de células de câncer pancreático GN10 e A3 ortotopicamente no pâncreas de ratos atímicos. D. Medição de fotões /s /cm

2 /steridian que descreve área bioluminescência na margem de pico de 10% (média ± SE) na semana 3, utilizando IVIS da Xenogen como descrito em Materiais e Métodos (

N

=

5

). E. Os pesos dos tumores de ratinhos de controlo (GN10, n = 5) e grupo knockdown GAL3 (A3, n = 5) foram pesados ​​após sacrifício foram ratos na semana quatro. F. mouse tecidos tumorais de controlo (GN10) e Gal-3 grupo knockdown (A3) marcação imunoistoquímica utilizando Gal-3, Ras e anticorpos fosfo-ERK como descrito em Materiais e Métodos.

Downregulation de Gal-3 inibe o crescimento do tumor em um modelo in vivo ortotópico

Para investigar a influência de Gal 3-níveis no crescimento in vivo de PDAC, as células MPanc96 estavelmente transfectadas com Gal-3 shRNA ou um controle shRNA vector foram marcado com luciferase do pirilampo para permitir a imagem de bioluminescência em tempo real para monitorizar o volume do tumor e propagação in vivo. Estas células foram ortotopicamente injectada no corpo do pâncreas de ratinhos nus, e o crescimento do tumor foi monitorizado por imagem não invasiva uma vez por semana. As diferenças no crescimento dos tumores foram anotados dentro de 3 semanas (imagens representativas, como mostrado na Figura 4C). A avaliação quantitativa da carga de tumor indicou que os tumores foram significativamente maiores no grupo de controlo em comparação com o Gal-3 derrubar grupo (Figura 4D) (p 0,05). Além disso, os pesos dos tumores primários foram significativamente menor no GAL3 derrubar grupo que o grupo controle, como demonstrado na Figura 4 E; coloração imuno-histoquímica para Gal-3, Ras e fosfo-ERK nestes tecidos ratos tumorais (Figura 4F) confirmou ainda que a expressão de Gal-3, Ras ea jusante efetoras fosfo-ERK são diminuiu no Gal-3 derrubar grupo em comparação com o grupo de controlo. micrometástases regionais foram observadas em animais injectados com células de controlo (5/5) animais, mas não em animais injectados com células em que a galectina-3 foi derrubado por transfecção estável de galectina-3 shRNA (0/5 animais) (Figura S1 ).

Gal-3 se liga a Ras e aumenta a atividade Ras em células PDAC

anteriormente foi relatado que Gal-3 está associada com activado K-Ras e promove forte ativação de Raf- 1 e PI3-K, mas atenua a activação da sinalização de ERK em células COS [21]. Nós, portanto, a hipótese de que Gal-3 ligaria com Ras e mediar a atividade Ras em células PDAC caracterizados pela ocorrência frequente de mutações Ras. Utilizando uma matriz de anticorpo (Hypromatrix, Worcester, MA), foi detectada a interacção entre Ras e Gal-3, utilizando HA etiquetado GAL3 transfectadas BxPC-3 lisado (dados não mostrados). Ras foi confirmado ser um dos parceiros de ligação de Gl-3 com base em dados a partir da matriz de anticorpo. Para confirmar ainda que Ras interage com Gal-3, foram utilizados ensaios de co-immunoprocipitation. Os lisados ​​de Panc-1 e MPanc96 com ou sem derrubar de Gal-3 foram sujeitos a imunoprecipitação com anticorpo monoclonal de rato GAL3 ou um anticorpo monoclonal anti-Pan-Ras seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-GAL3 formiga-Ras ou. Os resultados demonstraram que Gal-3 co-imunoprecipitados com Ras, enquanto lisados ​​com IgG normal, produziu nenhuma banda (Figura 5A) visível.

A. Co-imunoprecipitação foi realizada em Panc-1 e com MPanc96 derrubar Gal-3, utilizando anticorpos anti-Ras, ou anticorpo anti-Gal-3 como descrito em Materiais e Métodos. B. Quantidades iguais de proteína de células de controlo Panc-1 e Mpanc96 GN10 ou células shRNA A3 foram incubados com esferas de agarose revestidas com RAF1-RBD, e activa Ras-GTP foi detectada como descrito em Materiais e Métodos. Activo actividade C. Ras de GTP foi determinada em BxPC-3 de células L-GAL3 e células de controlo (V), tal como descrito em Materiais e Métodos. D. membrana plasmática celular e fracções citoplasmática de células GN10 e A3 de ambos Panc-1 e MPan96 foram sujeitos a SDS-PAGE e, em seguida, coradas imunologicamente com o anticorpo anti-Ras. E. imunofluorescência indirecta foi realizada em 3 BxPC-células L-GAL3 BxPC-3-V e com o anticorpo anti-Gal-3 (TIB166 1:100, vermelho) e anticorpo anti-Ras (1:100, verde), seguido pela DAPI contracoloração (azul). A fusão de Gal-3 (vermelha) e Ras (verde) com DAPI (azul) também é mostrada.

Para determinar ainda se interação entre Ras e Gal-3 afeta a atividade Ras, examinamos a efeitos de manipular a expressão Gal-3 sobre a atividade Ras. Como mostrado na Figura 5B, a sub-regulação de Gal-3 no Panc-1 e células MPan96 (A3) a diminuição da actividade de Ras utilizando o ensaio de Ras-GTP, enquanto que a sobre-expressão de GAL3 em BxPC-3 células de um aumento da actividade de Ras de GTP (Figura 5C) . A fim de elucidar como Gal-3 medeia a atividade Ras, membrana celular e proteínas citosólicas foram isolados [26] a partir Panc-1 e celular de controlo MPanc96 (GN10) e derrubar células (A3) e proteína Ras foi detectada usando immunoblotting. proteína Ras Menos foi detectado nas membranas plasmáticas de Panc-1 e células A3 A3 Mpanc96 em comparação com células de controlo GN10 (Figura 5D). No contrato, foi observada mais proteína RAS no citoplasma das células Panc-1 e Mpanc96 A3 em comparação com células de controlo GN10. Estes dados sugerem que a Gal-3 podem ser reguladas por Ras localização subcelular. imunofluorescência confocal confirmou que a sobre-regulação de Gal-3 em células BxPC-3 está associada com o aumento da Ras na membrana plasmática (Figura 5E) .Este sugere que a Gal-3 se liga Ras e é responsável pela ligação de Ras na membrana plasmática da célula, mediando assim a sua actividade.

Gal-3 medeia a sinalização a jusante de Ras em células PDAC

Se ativa Ras (estado ligada a GTP) ativa efectores a jusante, incluindo a Raf /ativada por mitógeno proteína (MAP) /ai. ai.