Abstract

MicroRNA (MIR) -150 foi relatado para ser drasticamente reprimidos em epitelial de cancro do ovário humano tecidos (EOC) e soro dos pacientes em relação aos controles normais. Este estudo teve como objetivo investigar significado clínico e mecanismos moleculares de miR-150 em EOC. No estudo actual, a análise quantitativa por PCR em tempo real mostraram que o miR-150 foi significativamente regulada negativamente em tecidos humanos EOC em comparação com amostras de tecido normal. Em seguida, demonstramos as associações significativas de miR-150 downregulation com características clinicopatológicas agressivas de pacientes EOC, incluindo alta estágio clínico e grau patológico, e mais curtos sobrevivências global e livre de progressão. Mais importante, a análise multivariada identificou o miR-150 como um biomarcador expressão independente de prognóstico no EOC. Depois disso, os ensaios de repórter de luciferase demonstrado que o zinco dedo e-box Binding homeobox 1 (ZEB1), um regulador fundamental da epitelial para mesenquimal transição (EMT), era um alvo directo de miR-150 em células de AOE. Além disso, descobrimos que a expressão ectópica de miR-150 pode inibir eficazmente a proliferação celular, invasão e metástase através da supressão da expressão de ZEB1. Além disso, também observamos uma correlação negativa significativa entre a expressão de mRNA ZEB1 em tecidos EOC miR-150 e (rs = -0,45, P 0,001). Em conclusão, estes resultados oferecem a evidência convincente de que a expressão aberrante de miR-150 pode desempenhar um papel na progressão do tumor e o prognóstico em pacientes com EOC. Além disso, os dados revelam que o miR-150 pode funcionar como um supressor tumoral e modular a proliferação celular EOC, e invasão directa e negativamente regulação ZEB1, implicando a re-expressão de miR-150 pode ser uma estratégia terapêutica potencial para EOC.

Citation: Jin M, Yang Z, Ye W, Xu H, Hua X (2014) MicroRNA-150 prevê um prognóstico favorável em doentes com cancro do ovário epitelial, e inibe celular invasão e metástase através da supressão transcricional repressor ZEB1. PLoS ONE 9 (8): e103965. doi: 10.1371 /journal.pone.0103965

editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital centro de pesquisa, Arábia Saudita

Recebido: 25 de maio de 2014; Aceito: 09 de julho de 2014; Publicação: 04 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Jin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural de Xangai Secretaria Municipal de Saúde (No. 20114y079); Medicina e Fundação Engenharia de Shanghai Jiaotong University (No. YG2011MS33). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução cancro do ovário

epitelial (EOC) representa o quinto malignidade ginecológica mais letal e origina a partir da superfície do ovário, cistos de inclusão no parênquima do ovário, ou a partir do epitélio da trompa de Falópio distai perto [1]. Porque há alguns biomarcadores e terapias eficazes, EOC é uma doença agressiva que provoca estimado de 125.000 mortes em todo o mundo anualmente [2]. sobrevida de pacientes com EOC cinco anos é criticamente dependente do estágio clínico no momento do diagnóstico dos pacientes; Se diagnosticado e tratado enquanto localizada (estágios I e II), as taxas de sobrevida em 5 anos pode chegar a mais de 90% [3]. No entanto, a maioria dos pacientes EOC são diagnosticados como doença avançada (estágios III e IV), onde a sobrevida em 5 anos é de apenas 30~40% [4]. Estes dados sugerem que o resultado clínico de pacientes EOC pode ser significativamente mais elevada com o diagnóstico precoce, no entanto, actualmente não existe um método não invasivo para detectar com precisão EOC numa fase precoce. Perante este cenário, o desenvolvimento de novos e biomarcadores moleculares de diagnóstico e prognóstico eficientes para EOC é necessária.

MicroRNAs (miARNs), como uma nova classe de pequenos RNAs de cadeia simples não codificantes, foram recentemente demonstrado para regular gene expressão pós-transcricionalmente através de pares de bases complementares com os locais de ligação na 3′-UTR do mRNA alvo, levando a clivagem de mRNA alvo ou repressão translacional [5]. Ao ligar-se com os seus genes alvo, miARNs estão implicados em vários processos biológicos, incluindo a proliferação celular, apoptose, bem como diferenciação celular [6]. Uma evidência crescente relatou que miARN pode desempenhar papéis essenciais na invasão de células cancerosas e metástases. Especialmente em EOC, Yeh et al. [7] indicou a regulação negativa da miARN-138 nas células altamente invasivos, e o seu funcionamento como um inibidor da migração celular e invasão; Wang et al. [8] descobriram que o miR-182 pode actuar como um miARN oncogénica e promover o crescimento de células do cancro, a invasão, e por quimiorresistência em células de segmentação PDCD4 EOC; Wu et al. [9] sugeriu que o miR-145 podem modular o crescimento e invasão EOC suprimindo p70S6K1 e MUC-1, que funciona como um supressor de tumor. Estes estudos anteriores forneceram pistas iniciais para as contribuições de perda ou ganho de função de miRNAs específicos para tumorigênese e progressão do cancro da EOC.

miR-150, localizado no cromossoma 19q13, foi indicado como um miRNA específico do hematopoiéticas em linfoma maligno e foi observada a ser significativamente regulados negativamente em células tumorais em relação a células saudáveis ​​[10]. A expressão anormal de miR-150, também tem sido encontrada em outros tecidos de tumores sólidos, tais como cancro do pulmão, cancro gástrico, cancro colorrectal, cancro endometrial, EOC, e cancro pancreático [11] – [16]. Especialmente, Vang et ai. [14] descobriram que miR-150 exibido baixa expressão na maioria dos tecidos EOC primário; Shapira et al. [15] também descreveram que o miR-150 mostrou pelo menos uma redução de 10 vezes na expressão em amostras de plasma pré-cirúrgicos de mulheres diagnosticadas com EOC em comparação com amostras de plasma de mulheres sem uma massa conhecida pélvica (controlos saudáveis). Estes resultados implicam um possível papel do miR-150 em EOC humano, o que nos levou a identificar e funcionalmente validar miR-150-associado significado clínico e mecanismos moleculares na EOC.

Materiais e Métodos

pacientes e amostras de Tecido

As amostras clínicas foram obtidos a partir do hospital Xinhua, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, na China. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Xinhua, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, na China.

Para quantitativo em tempo real PCR, 100 EOC amostras de tecido e 10 amostras de tecido ovariano normal foram snap-congelados em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C após a cirurgia, que foram realizadas no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia do Hospital Xinhua, Shanghai Jiaotong University School of Medicine de dezembro de 2006 a janeiro de 2008. Todos os 10 normais tecidos ovarianos foram obtidas de mulheres submetidas a histerectomia por doenças benignas. Todos os pacientes foram tratados EOC sem radioterapia pré-operatória, a quimioterapia, ou terapia hormonal. estadiamento cirúrgico foi estabelecido de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e sistema de Obstetrícia (FIGO). As características clínicas de 100 pacientes EOC foram resumidos na tabela 1.

follow-ups regulares (variação: 2.08-119.06 meses, 62,86 meses, em média, 62,66 meses em média) foram realizados após o tratamento de todos os 100 pacientes EOC incluídos no estudo atual, com o seu tempo de sobrevivência, data da morte e data da última follow-up a ser gravada. A sobrevida global (OS) foi definido como o intervalo de tempo entre a data do diagnóstico no nosso centro para a data da morte ou do último follow-up. sobrevida livre de progressão (PFS) foi definido como o intervalo de tempo entre o diagnóstico no nosso centro de doença progressiva, a morte de qualquer outra causa que não a progressão, ou um segundo cancro primário.

cultura celular

A linha seroso do ovário humano OVCAR3 cística celular de adenocarcinoma seroso papilar e linha de células de adenocarcinoma humano cística SKOV3 foram adquiridos da American Type Tissue Collection (Manassas, VA). Ambas as linhas celulares são hospedeiros adequados de transfecção. Todas as células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (GIBCO), em uma atmosfera humidificada de 5% de CO

2 a 37 ° C.

ARN e miARN extracção

para a quantificação de ARNm, RNAs totais a partir de linhas de células e tecidos foram extraídos utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Para quantificação de miARN, total de miARN foi extraído a partir de linhas celulares e tecidos utilizando o kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion, Austin, TX, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

ensaio de PCR quantitativo em tempo real

para o ARNm e quantificações de miARN, ensaio de PCR em tempo real quantitativo foi realizado para detectar, respectivamente, os níveis de miR-150 e ZEB1 de expressão em linhas celulares e tecidos. Resumidamente, 10 ug de ARN de pequena e 20 ug de ARN total foi submetido a transcrição reversa. O cDNA foi utilizado para a amplificação de miR-150 maduro, ZEB1 e os controlos endógenos, U6 e β-actina, por PCR. Os iniciadores de PCR utilizados foram como se segue: o miR-150 para a frente, 5′-CAG TAT TCT CTC ACC ACC CTT GTA-3 ‘e inverso 5′-AAT TGA GGA TCT CGT CAG TCT TTG-3′, U6 para a frente, 5’ GGA ATT ACG ATA CAG AGA AGA TT-3 ‘e inverso, 5′-ACG GGA CTT CAC GAA TTT G-3′; ZEB1 frente 5’-CAG GCA GAT GAA GCA GGA TG-3 ‘e reverso 5′-CAG CAG TGT CTT GTT GTT GTA G-3′; β-actina frente 5’-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3 ‘e reverso 5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3’. As condições de PCR foram:. Desnaturação inicial a 95 ° C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 62 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 30 s

Real- PCR em tempo foi realizada utilizando SYBR Green PCR master Mix (Applied Biosystems) em um sistema de PCR em tempo real ABI 7300HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As curvas padrão foram geradas, e a quantidade relativa de miR-150 ou ZEB1 foi normalizada para a quantidade de U6 ou β-actina, respectivamente. A quantificação relativa da expressão do gene alvo foi avaliada utilizando o 2

-. △△ CT método

Construção de vectores de expressão e transfecção de células

O plasmídeo pcDNA_6.2-GW /EmGFP-miR vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) com um gene resistente à espectinomicina foi usada para construir um plasmídeo que sobre-expressam o miR-150. Um fragmento de DNA de 62 bp com a sequência madura miR-150 ou um controlo negativo (NC) incompatíveis foi sintetizado quimicamente e adicionado a este vector de Shanghai Shenggong Biotech (Xangai, China).

células EOC foram colhidas e semeadas em placas de 6 poços com 70-80% de confluência durante a noite antes da transfecção. O vector HSA-miR-150 e NC foi transfectada com Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a uma concentração de 100 nM durante 48 h a 37 ° C, de acordo com as instruções do fabricante.

ZEB1 siRNA e transfecção de células

ZEB1 siARN (siARN-ZEB1) e controlar siARN (siARN-NC) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA) e foram usados ​​para transfectar células EOC durante a fase de crescimento logarítmica utilizando Lipofectamine 2000 lipossoma (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, EUA) a uma concentração de 100 nM durante 48 h a 37 ° C, de acordo com as instruções do fabricante. O nível de expressão ZEB1 foi detectado por Western blot para determinar o efeito de interferência para ZEB1.

análise Western blot

EOC células foram colhidas 72 h após a transfecção transiente e análise de Western blot foi realizada para detectar os níveis de expressão de proteína ZEB1. As células foram lisadas utilizando um tampão RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS). As proteínas foram resolvidas num gel de poliacrilamida desnaturante de SDS e, em seguida, transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Os filtros foram bloqueados em leite desnatado PBS-Tween e sondadas com anticorpo anti-ZEB1 (diluição 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA) ou sondadas com anticorpo anti-actina β (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA) . β-actina foi utilizado como um controlo interno para a normalização de genes candidatos. As membranas foram lavadas e incubadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários. A expressão proteica foi avaliada por quimioluminescência aumentada e a exposição ao filme quimioluminescente (Pierce Biotechnology).

repórter luciferase ensaio

A 3’UTR do ARNm ZEB1 foi clonado e inserido no jusante do gene luciferse em pGL3 /luciferase vector (Promega, Madison, WI, EUA). O mutante de 3′-UTR do mRNA ZEB1 foi clonado utilizando o tipo selvagem 3′-UTR como um molde e inserida em pGL3 /luciferase, tal como descrito para o tipo selvagem 3′-UTR. EOC células foram cultivadas em placas de 24 poços e foram co-transfectadas com o miR-150 imita e pGL3-ZEB1-WT ou pGL3-ZEB1-Mut. Às 48 horas após a transfecção, as células foram colhidas e EOC actividade de luciferase foi medida utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, EUA) seguindo as instruções do fabricante. As actividades da luciferase Renilla foram usadas como um controlo interno. As experiências foram realizadas de forma independente em triplicado.

in vitro a proliferação de células de ensaio

A proliferação de células in vitro de células transfectadas com HSA EOC-miR-150 e NC vector do vector foi determinada às 24, 48 e 72 h, utilizando o One Solution kit de Ensaio de Proliferação celular CellTiter 96 Aqueous (Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante. A absorvância a 490 nm foi medida utilizando um espectrofotómetro de microplaca mquant Universal (BioTek, Winooski, VT). Os dados são apresentados como o valor médio para ensaios em triplicado.

In vitro invasão ensaio

A capacidade de invasão das células EOC transfectadas com HSA-miR-150 vector e NC vector foi testada em células Matrigel revestido câmaras de cultura (8 um de tamanho de poro, Millipore, Billerica, MA, EUA). EOC células foram transf ectadas e cultivadas até à confluência ou próximo ( 90%) de confluência em pratos de 24 poços. Em seguida, as células foram ressuspensas em EOC 200 ul 1640 isento de soro, foram colocadas dentro da câmara superior da peça inserta com Matrigel. O meio com FBS a 5% foi adicionado para dentro das câmaras inferiores como um quimioatractor. Após 24 h de incubação, as células remanescentes sobre a membrana superior foram cuidadosamente removidos. As células que tinham invadido através da membrana foram contadas manualmente a 200 × ampliação de dez diferentes campos de cada filtro. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

In vitro migração ensaio

A capacidade de migração de células EOC transfectadas com HSA-miR-150 vector e NC vector foi testado em Corning transpoço inserir câmaras. Resumidamente, 48 h após a transfecção, as células foram ressuspensas em EOC 200 ul 1640 isento de soro, foram colocadas dentro da câmara superior do inserto sem Matrigel. O meio com FBS a 5% foi adicionado para dentro das câmaras inferiores como um quimioatractor. Após 24 h de incubação, as células remanescentes sobre a membrana superior foram cuidadosamente removidos. As células que migraram através da membrana foram contadas manualmente a 200 × ampliação de dez diferentes campos de cada filtro. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

A análise estatística

Os dados são expressos como média ± E.P. As comparações entre os grupos foram feitas usando o teste de Kruskal-Wallis para variáveis ​​contínuas e o χ

2 de teste para as variáveis ​​categóricas. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para a análise de sobrevivência, e as diferenças na sobrevivência foram estimadas pelo teste de log-rank. A análise de sobrevida multivariada foi realizada para todos os parâmetros que foram significativos nas análises univariadas, utilizando o modelo de regressão de Cox. P 0,05 foi considerado significativo

Resultados

regulação baixa de miR-150 em tecidos humanos EOC

O nível de expressão de miR-150 em 100 amostras de tecido EOC e 10 de ovário normal. amostras de tecido foram detectados por qRT-PCR e normalizada para RNU6B. Como resultado, o nível de expressão de miR-150 em tecidos EOC foi significativamente mais baixa do que em tecidos normais de ovário (EOC vs normal: 2,38 ± 0,80 vs 3,83 ± 0,77, P 0,001, Figura 1). O valor da mediana (2,36) de miR-150 de expressão em todos os tecidos EOC detectados por qRT-PCR foi utilizado como um ponto de corte de 100 pacientes classificados EOC em miR-150 de baixa (n = 58, 58,00%) e miR-150 . elevadas grupos (n = 42, 42,00%) de expressão

os resultados mostraram que o nível de expressão de miR-150 em tecidos EOC foi significativamente mais baixa do que em tecidos normais de ovário (EOC vs normal: 2,38 ± 0,80 vs. 3,83 ± 0,77, P . 0.001)

regulação negativa do miR-150 associados com a progressão do tumor agressivo de EOC humana

a Tabela 1 mostrou as associações entre diversas variáveis ​​clínico-patológicas e miR -150 níveis de expressão em amostras de tumor de pacientes AOE. Os tecidos Edc com estádio clínico avançado (III~IV) mais frequentemente apresentaram baixa expressão de miR-150 do que aqueles com baixo estágio clínico (I~II, P = 0,005, Tabela 1). Além disso, o miR-150 exibiu uma tendência expressão que correlacionada com o grau patológico (P = 0,02, Tabela 1). Descobrimos que miR-150 foi aberrante reprimidos em tecidos tumorais com alto grau patológico em comparação com aqueles com baixo grau patológico. No entanto, a expressão de miR-150 não foi associada com outras variáveis ​​clínico-patológicas, incluindo a idade, grau, tipo histológico e tumor residual após a cirurgia (todos P 0,05).

regulação negativa do miR-150 associados com mau prognóstico em pacientes com EOCs

oS e curvas de PFS foram plotados de acordo com o nível de expressão de miR-150 em amostras de tumores de pacientes EOC pelo método de Kaplan-Meier. Como mostrado na Figura 2, os pacientes EOC com baixa expressão de miR-150 tinham significativamente mais curtos global (p 0,001, Figura 2A) (;, A Figura 2b 0,001 P 0,001); sobrevivência do que aqueles com alta miR-150 expressão fez

e livre de progressão (0,001 P https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), que já acumulou mais de cinquenta mil interações miRNA-alvo (MTIS), que são coletados por meio de levantamento manualmente literatura pertinente após a mineração de dados do texto de forma sistemática para filtrar artigos de investigação relacionadas com estudos funcionais de miRNAs [17], [18]. No estudo atual, nós só selecionados os genes-alvo candidato que foram validadas experimentalmente por ensaio de repórter, western blot e quantitativa PCR em tempo real. Como resultado, três genes, tais como MYB, EGR2 e ZEB1, foram seleccionados genes alvo candidato de miR-150. Além disso, RNAhybrid (Versão 2.1, https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html) foi usada para calcular a energia livre mínima (MFE) da miARN duplex: ARNm [19]. O miARN é hibridado com o alvo de um modo energeticamente otimizado. RNAhybrid foi optimizado para mostrar a hibridação no 3’UTR dos genes alvo. O miARN duplex: ARNm com MFE inferior é mais estável do que aquele com maior MFE. Como resultado, os valores de MFE de miR-150: MYB, miR-150: EGR2 e miR-150: ZEB1 foram respectivamente -11,51 kcal /mol, -14,30 kcal /mol e -18,00 kcal /mol. O duplex miR-150: ZEB1 tem a melhor MFE, portanto, optamos ZEB1 como um gene alvo candidato para miR-150 nas novas experiências de validação

A fim de verificar o alvo candidato do HSA-miR-. 150, nós transfectadas células EOC com vector hsa-miR-150, vetor negativo (NC) e meio de cultura de controle em branco (simulada), respectivamente. Às 24 h pós-transfecção, análise de Western blot foi realizada e os resultados na Figura 3A~B mostrou que a expressão forçada de HSA-miR-150 conduziu a uma diminuição marcada dos níveis de proteína ZEB1 endógeno de expressão em comparação com células transfectadas com EOC NC ou simulados (grupos de células SKOV3 e OVCAR3: ambos P 0,001). Além disso, o ensaio de repórter de luciferase foi realizada por co-transfecção de miR-150 e um plasmídeo repórter da luciferase contendo o 3 ‘UTR de ZEB1 humano. De acordo com miRTarBase (Release 4.5: 01 de novembro de 2013; https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), há uma validado local de ligação e dois locais previstos para miR-150 no ZEB1 3’UTR vinculativo . No presente estudo, analisamos apenas o local de ligação validado como mostrado na Figura 3D. Para verificar se uma interação direta está envolvido entre a sua ZEB1 alvo oncogene miR-150 e, realizamos ensaios de repórter de luciferase (Figura 3E). Descobrimos que a co-transfecção de miR-150, juntamente com o tipo selvagem da 3’UTR ZEB1 causou um decréscimo significativo na actividade de luciferase em comparação com os controlos (Figura 3F e G).

(A) Os níveis de expressão de miR -150 em células SKOV3 e OVCAR3 por ensaio de PCR quantitativo em tempo real às 24 h pós-transfecção de miR-150 vetor. (B~C) A proteína ZEB1 em células SKOV3 e OVCAR3 por western blot às 24 h pós-transfecção de miR-150 vetor. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna. ‘NC’ refere-se ao vector de controlo negativo. (D) miR-150 sites na ZEB1 3′-UTR vinculativo. (E) de alinhamento de sequências de ARN que mostra a 3′-UTR do mRNA ZEB1 contém um site para complementar a região de semente de miR-150. Mut ZEB1 é um mutante com substituições na região complementar como um controlo negativo. (F e G) ensaio relatório luciferase foi realizada para confirmar a meta vinculativa de miR-150. A actividade da luciferase foi detectada após co-transfecção de pGL3-ZEB1-wt ou pGL3-ZEB1-mut, miR-150 vector ou vector de controlo negativo (NC) em células SKOV3 e OVCAR3.

MiR- 150 inibe a proliferação celular de células EOC in vitro por segmentação ZEB1

para avaliar o efeito de miR-150 em células malignas em fenótipos EOC, que transfectadas siRNA para suprimir ZEB1 especialmente ZEB1 expressão endógena. Como mostrado na Figura 4, a transfecção de siRNA-ZEB1 pode eficazmente inibir a expressão da proteína ZEB1 em ambas as linhas de células SKOV3 e OVCAR3 (ambos P 0,001). Além disso, observou-se que a expressão forçada de miR-150 a proliferação de células significativamente inibido de células SKOV3 e OVCAR3, no entanto, esta alteração foi revertida pela transfecção de siRNA-ZEB1. Como mostrado na Figura 5, a expressão forçada de miR-150 a proliferação celular significativamente inibida de células SKOV3 e OVCAR3 transfectadas com ARNsi-NC (ambas P = 0,006, Figura 5A e C), mas não o fez em células SKOV3 e OVCAR3 transfectadas com siRNA-ZEB1 (ambos P 0,05, Figura 5B e D).

análise por Western blot foi realizada para detectar os níveis de proteína ZEB1 expressão em siRNA-ZEB1 transfectadas, siARN-NC transfectadas e não transfectadas (em branco ) SKOV3 (A e B) e OVCAR3 (C e D), as células. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna.

(A e B) Curvas de crescimento de células SKOV3 e OVCAR3 transfectadas com ARNsi-NC, e células SKOV3 e OVCAR3 transfectadas com ARNsi-NC e miR -150 vetor. (C e D) curvas de crescimento de células SKOV3 e OVCAR3 transfectadas com ARNsi-ZEB1, e células SKOV3 e OVCAR3 transfectadas com ARNsi-ZEB1 e miR-150 vetor.

miR-150 inibe a migração de células EOC e invasão in vitro por segmentação ZEB1

Para verificar ainda se o miR-150 inibiu a migração celular e invasão de linhas celulares EOC por segmentação ZEB1, também derrubado a expressão de ZEB1 pela transfecção de siRNA em ZEB1 ambas as células SKOV3 e OVCAR3. Como mostrado na Figura 6, a expressão forçada de miR-150 inibiu significativamente a migração celular e invasão de células SKOV3 e OVCAR3 transfectadas com ARNsi-NC (ambas P = 0,01, Figura 6A e C), mas não o fez em SKOV3 e OVCAR3 As células transfectadas com ARNsi-ZEB1 (ambos P 0,05, Figura 6B e D).

(A e C) Transwell ensaio de migração e ensaio de invasão Matrigel de células EOC transfectadas com ARNsi-NC, e células EOC transfectadas com siRNA-NC e miR-150 vector. (B e D) ensaio de migração Transwell e ensaio de invasão Matrigel de células EOC transfectadas com siRNA-ZEB1 e células EOC transfectadas com siRNA-ZEB1 e miR-150 vector.

correlação negativa entre o miR-150 e os níveis de expressão de mRNA ZEB1 em tecidos humanos EOC

a fim de avaliar a relação entre a expressão do mRNA ZEB1 em tecidos EOC miR-150 e, detectamos ainda mais os níveis de mRNA ZEB1 expressão em 100 amostras de tecido EOC e 10 normais espécimes de tecidos ovarianos por qRT-PCR e normalizado para p-actina. Como mostrado na Figura 7A, o nível de expressão de ARNm em tecidos ZEB1 EOC foi significativamente mais elevada do que nos tecidos normais do ovário (EOC vs normal: 4,49 ± 1,52 vs 2,41 ± 0,49, P 0,001, Figura 7A). Mais interessante, a análise de correlação de Spearman mostrou claramente correlação negativa entre a expressão de mRNA ZEB1 miR-150 e em tecidos EOC (rs = -0,45, P 0,001, Figura 7B)

O nível de expressão de mRNA ZEB1 em tecidos EOC. foi significativamente mais elevada do que nos tecidos normais do ovário (EOC vs normal: 4,49 ± 1,52 vs 2,41 ± 0,49, P 0,001, a). Mais interessante, a análise de correlação de Spearman mostrou claramente correlação negativa entre a expressão de mRNA ZEB1 miR-150 e em tecidos EOC (rs = -0,45, P 0,001, B).

Discussão

EOC é ainda um grande problema ginecológico com baixa taxa de sobrevivência de 5 anos e ameaça seriamente a saúde humana devido a metástases à distância, apesar da cirurgia de rotina e quimioterapia. Evidências crescentes exibir a desregulação de vários miRNAs no EOC e implicam seus papéis essenciais em processos tumorigênicos, incluindo proliferação celular, apoptose e motilidade. Assim, revelando as mudanças moleculares de miRNAs é crucial para superar esta doença mortal. Estudos anteriores demonstraram que o miR-150 é dramaticamente regulada negativamente em tecidos humanos e EOC soro dos pacientes em comparação com os controlos normais [14], [15]. No entanto, os papéis de miR-150 em iniciação e progressão de EOC e a regulação negativa da expressão de miR-150 neste câncer ainda não são claras. No presente estudo, ligamos o miR-150 para a sua ZEB1 gene alvo, e demonstrado seus envolvimentos na regulação fenótipos de células malignas de cancro do ovário. Nós confirmou o papel fundamental do miR-150 como um supressor de tumor directa e negativamente segmentação ZEB1 em EOC. A evidência para esta vem das seguintes fontes. Em primeiro lugar, que validou a regulação negativa de miR-150 em tecidos EOC usando um grande grupo de pacientes EOC, e mostraram que o baixo nível de expressão de miR-150 foi muito mais baixo em tecidos do EOC altamente agressivos. Em segundo lugar, a regulação negativa de miR-150 foi identificado como um marcador de prognóstico independente para ambas as sobrevivências global e livre de progressão dos pacientes com EOC. Em terceiro lugar, a sobre-expressão de miR-150 pode inibir significativamente a proliferação celular e a motilidade das células de cancro do ovário in vitro e suprime substancialmente a expressão da proteína de ZEB1. Adiante, ZEB1 foi identificada como um alvo directo de miR-150, e knock-down de ZEB1 em células de cancro do ovário pode imitar a inibição da proliferação celular, migração e invasão de miR-150. Além disso, encontramos uma correlação negativa significativa entre a expressão de mRNA ZEB1 em tecidos EOC miR-150 e.

MIR-150 provou ser um miRNA essencial implicado no desenvolvimento e progressão de várias doenças malignas humanas. Por exemplo, a expressão diminuída de miR-150 actua como um factor anti-apoptótico em difundir cancro gástrico humano e tumores pituitários secretores de hormona adrenocorticotrófica [20]; A injeção de células de linfoma do rato miR-150-transduzidas em camundongos imunodeficientes podem produzir menos tumores do que as células de controlo [21]; expressão forçada de miR-150 pode inibir o crescimento de células tumorais in vitro e inibem o crescimento do tumor em modelos animais através downregulation directa de DKC1 e AKT2, redução de AKTser473 fosforilados /4 e um aumento na supressores de tumor, tais como Bim e p53, levando à activação da telomerase e imortalização das células cancerosas [22]; expressão de miR-150 é reduzido no carcinoma do pulmão de células não-pequenas e foi fortemente associada com o estágio do tumor, tamanho do tumor e sobrevida dos pacientes como significativamente baixa expressão no estágio avançado, de grande tamanho e tumores de mau prognóstico foi observado [13]. Diminuição da expressão de miR-150 também é observada em carcinoma epidermóide de esôfago e é indicado para ser contribuíram para potencial maligno, tais como a profundidade do tumor, metástase linfonodal, invasão linfática, invasão venosa, estadiamento clínico e prognóstico ruim [23]. No estudo atual, os nossos dados são consistentes com estes estudos publicados anteriores que fornecem evidências de mudanças na expressão de miR-150 que promovem a formação de tumores. Nós demonstramos que miR-150 foi funcionalmente envolvido na supressão do crescimento de células EOC, migração e invasão, que foi apoiada por ambos os estudos de cultura celular e dados clínicos. Em experiências de cultura celular, a sobre-expressão de miR-150 levou à diminuição da proliferação de células EOC e motilidade celular. Em amostras clínicas, miR-150 foi dramaticamente regulada para baixo em tecidos EOC com alto estágio clínico e alto grau patológico em comparação com os tecidos EOC com baixo estágio clínico e baixo grau patológico, e baixa expressão de miR-150 em tumores foi associado com pior sobrevida de pacientes com EOC

Mais importante, a nossa identificado miR-150 foi ZEB1 alvo, um membro da família de proteínas de dedo de zinco [24] – [26].. ZEB1 é um do indutor da transcrição no procedimento de transição epitelial-mesenquimal (EMT) em cancro de origem epitelial, tais como cancro da mama, cancro do pulmão, carcinoma de células escamosas esofágico, carcinoma gástrico, cancro pancreático, cancro do colo do útero, cancro do endométrio e da próstata cancro [23], [27] – [31]. Especialmente em EOC, Chen et al. [32] relatou que downregulating expressão ZEB1 com um RNA pequeno hairpin baseado no vetor de expressão (shRNA) visando ZEB1 (shZEB1) em células EOC SKOV3 poderia inibir EMT de células shZEB1-SKOV3 e bloco shZEB1-SKOV3 metástase de células in vivo, sugerindo seu papel no reforço EMT nas células EOC. Eles também observaram que o shRNA mediada ZEB1 infra-regulação em células SKOV3 poderia diminuir significativamente o crescimento do tumor nos ratos de xenotransplante. Nossos dados aqui mostrou a alteração de miR-150 em células de cancro do ovário levaram à mudança oposto do ZEB1, destacando sua regulação negativa.