Abstract

Sagopilone, uma epotilona totalmente sintético otimizada , é um composto de estabilização dos microtúbulos que tem mostrado alta

in vitro

e

em

actividade in vivo contra uma ampla gama de modelos de tumores humanos. Foram analisados ​​o mecanismo diferencial da ação da sagopilone em linhas celulares de cancro de pulmão de células não-pequenas

in vitro

. Sagopilone inibiu a proliferação de linhas celulares de cancro de pulmão de células não-pequenas em concentração nanomolar inferior. O tratamento com sagopilone causada fortes perturbações de organização do citoesqueleto celular. Foram observados dois fenótipos dependentes da concentração. No sagopilone 2,5 nM ou 4 nM de paclitaxel um fenótipo aneuplóide ocorrer enquanto que um fenótipo de paragem da mitose foi induzida por 40 nM sagopilone ou paclitaxel. Curiosamente, o tratamento com 2,5 nM de proliferação sagopilone eficazmente inibida célula, mas – em comparação com concentrações elevadas (40 nM) – única apoptose induzida marginalmente. O tratamento com um elevado versus uma baixa concentração de paclitaxel ou sagopilone regula um conjunto não sobreposição de genes, o que indica que ambos os fenótipos diferem substancialmente um do outro. Genes envolvidos na transição de fase G2 /M e do checkpoint de montagem do fuso, como ciclina B1 e BubR1 foram regulada pelo tratamento com 40 nM sagopilone. Inesperadamente, também genes envolvidos na resposta danos no DNA foram regulada no referido tratamento. Em contraste, o tratamento de células A549 com uma baixa concentração de sagopilone revelaram uma supra-regulação de genes alvo transcricionais directos de TP53, como CDKN1A, MDM2, GADD45A, FAS. Knockdown de TP53, que inibiu a indução da transcrição de genes alvo TP53, conduziu a um aumento significativo na indução de apoptose em células A549 quando tratados com uma baixa concentração de sagopilone. Os resultados indicam que a activação de TP53 e seus efectores a jusante como CDKN1A por baixas concentrações de sagopilone é responsável pela resistência à apoptose relativa de células A549 e pode representar um mecanismo de resistência para sagopilone

citação:. Winsel S, Sommer Um, Eschenbrenner J, Mittlestaedt K, L Klar, Martelo S, et al. (2011) Modo moleculares de ação e papel das TP53 na sensibilidade à Novel epotilona Sagopilone (ZK-EPO) em A549 Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (4): e19273. doi: 10.1371 /journal.pone.0019273

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Agosto, 2010; Aceito: 31 de março de 2011; Publicação: 29 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Winsel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi financiado pela Bayer Healthcare (www.bayerhealthcare.com). Os financiadores não tiveram um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar, e preparação do manuscrito. Todos os autores são funcionários ou ex-funcionários da Bayer Healthcare. Conceder um apoio em detalhe: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt recebido bolsas de investigação comerciais da Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann são employes atuais ou antigos da Bayer Healthcare e detêm patentes sobre Bayer Healthcare, bem como ações na Bayer

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores leram o política e da revista tem as seguintes conflitos: a empresa teve um papel neste estudo no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar e preparação do manuscrito. Todos os autores são funcionários ou ex-funcionários da Bayer Healthcare. Conceder um apoio em detalhe: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt recebido bolsas de investigação comerciais da Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann são employes atuais ou antigos da Bayer Healthcare e detêm patentes sobre Bayer Healthcare, bem como ações na Bayer. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O cancro do pulmão é uma das principais causas de morte por cancro em todo o mundo, como muitas vezes é única diagnosticada em estágios avançados e exibe um elevado grau de resistência aos regimes quimioterapêuticos utilizados. [1] – [5]. Sagopilone (SAG) é uma epotilona totalmente sintético, atualmente em desenvolvimento clínico que foi otimizado para superar as limitações frequentemente associados com taxanos, agentes de ligação de tubulina convencionais (PTs) como de mecanismos resistentes exemplo MDR mediada [6]. SAG tem demonstrado alta

in vitro

e

in vivo

atividade em uma variedade de modelos de tumor em comparação com o paclitaxel (PAC) e outros agentes quimioterápicos comumente utilizados [6]. Com actividade anti-tumoral forte foi observada em NSCLC linhas celulares (cancro do pulmão de células não-pequenas)

modelos in vitro humanos primários de xenoenxerto de ratinho e NSCLC

, SAG pode proporcionar uma nova oportunidade potencial para o tratamento de NSCLC [7].

Vários estudos descrevem marcadores preditivos de resposta para as linhas de células NSCLC, como expressão do grupo de acesso a complementação de reparação da excisão 1 (ERCC1) gene para compostos de platina [8] ou o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) estado mutacional para os inibidores de tirosina-cinase de EGFR (gefitinib e erlotinib) [9]; [10]. No que diz respeito à resistência aos TBA, os relatórios sobre linhas celulares seleccionadas para resistência a PAC por meio de cultura de longo prazo, na presença do fármaco apresentaram níveis aumentados de TUBB3 (beta tubulina III) a expressão da proteína [11]. Em contraste, a sua contraparte patupilone (epotilona B) resistentes, incubadas do mesmo modo, mostrou a expressão de proteínas de baixo TUBB3 [11]. Estes dados sugerem que TUBB3 contribui para a resistência celular em direcção PAC mas não a epotilona. Como consequência, há uma necessidade de outros marcadores que podem predizer a resposta SAG.

As mutações em genes supressores de tumores, que desempenha um papel central na resposta celular a danos no ADN, a regulação do ciclo celular e apoptose [12] , foram encontrados em cerca de 50% de todos os casos de NSCLC [13]. No entanto, o papel de TP53 em resposta a parteiras tradicionais como PAC foi contestada: Alguns grupos relataram nenhuma correlação entre o estado mutacional TP53 e sensibilidade à PAC [14]; [15], enquanto outros observaram que a falta de actividade TP53 resultou num aumento da quimiossensibilidade ao PAC [16]; [17]. Estes achados sugerem que o estado mutacional TP53 e TP53 actividade alterada podem influenciar a sensibilidade das células à SAG. Para resolver esta questão, analisamos a influência de TP53 na capacidade do SAG para induzir a apoptose em um modelo NSCLC

in vitro

.

A identificação de biomarcadores de estratificação ou alvo droga ou medicamento marcadores de resposta relacionados com pode melhorar consideravelmente o resultado da terapia e levaria a uma mudança para terapias mais personalizadas contra tipos específicos da doença [18]. O tratamento ideal para pacientes que sofrem de NSCLC dependerá cada vez mais a análise de biomarcadores para identificar a população de pacientes que irão beneficiar mais de uma determinada terapia mono ou combinação. No entanto, a identificação de biomarcadores e validação continua a ser um grande desafio [19] e por isso é importante para acompanhar o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para pacientes com NSCLC com pesquisa sobre estratificação paciente e a identificação e validação de biomarcadores clínicos que predizem a resposta. Como parte deste processo, é essencial para compreender como a actividade de novos agentes promissores é influenciada por alterações nas vias celulares chave, e vice-versa.

O objectivo do nosso programa de translação foi examinar a actividade de SAG

in vitro

em um painel de linhas celulares de NSCLC, para analisar melhor seu mecanismo de ação e compará-lo com os efeitos da PAC e investigar possíveis mecanismos de resistência, bem como preditores de resposta com base no perfil de expressão gênica.

Materiais e Métodos

células e compostos

linhas de células de carcinoma de pulmão humano (A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522, NCI-H226, NCI- H460) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas de acordo com os protocolos recomendados. SAG foi sintetizado da Bayer HealthCare Laboratories através de sínteses totais. CAP foi adquirido de Sigma-Aldrich (Munique, Alemanha). O ZVAD.fmk inibidor da pan-caspase foi adquirido à Bachem, (Heidelberg, Alemanha). Todos os meios e suplementos de cultura celular foram adquiridos a Biochrom AG (Berlim, Alemanha). As soluções stock foram preparadas como previamente descrito [20]. Para a selecção de linhas celulares estavelmente transduzidas higromicina foi adquirido a partir de Roche (Mannheim, Alemanha).

proliferação de células tumorais ensaio

O efeito de SAG ou PAC sobre a proliferação de cancro do pulmão foi avaliada utilizando um ensaio de proliferação de células com base na coloração das células com violeta de cristal tal como descrito antes [20]. Os valores de IC50 foram calculados a partir de três experiências independentes, utilizando o software SigmaPlot (SPSS, Friedrichsdorf, Alemanha).

In vitro

análise dos efeitos sobre o citoesqueleto, o ciclo celular e apoptose

células A549 foram incubadas com veículo (etanol a 0,1%), 2,5 nM ou 40 nM SAG durante 20 h, fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com um anticorpo monoclonal de murganho anti-tubulina-α (1:1000) (Sigma-Aldrich ), de cabra Alexa-488 Fluor® ligado anticorpo IgG anti-ratinho secundário (1:250) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, EUA) e DRAQ5 (Biostatus, Leicestershire, Reino Unido), de acordo com protocolos padrão. Fixa e células coradas foram analisadas usando uma Zeiss LSM 510 microscópio META (Carl Zeiss, Jena, Alemanha) equipado com um 63x /1.4 (DIC óleo) objetiva Plan-Apochromat®. software Zeiss LSM (versão 3.0 SP3) foi utilizado para a imagem confocal.

classificador de células activadas por fluorescência (FACS) foi executada para determinar a distribuição do ciclo celular de SAG- ou células tratadas com PAC. As células foram incubadas com SAG nas concentrações indicadas ou veículo durante 18 h, fixadas com etanol a 70%, e coradas com 50 ug /mL de iodeto de propídio (PI) (Sigma-Aldrich). conteúdo em ADN celular foi determinada por citometria de fluxo utilizando o BD FACSCalibur ™ (Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, EUA) e os dados foram analisados ​​com o software CellQuest ™ (Becton, Dickinson and Company). Para investigar a apoptose por FACS, as células A549 foram incubadas continuamente durante 72 horas com as concentrações indicadas de SAG ou veículo, tripsinizadas e marcadas com DIOC

6 (3) (iodeto de 3,3′-dihexyloxacarbocyanine) (Invitrogen Inc.) e PI, tal como descrito antes [21].

quantitativa PCR em Tempo real e Western Blot

O ARN foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), foi gerado usando ADNc SuperScript First Strand Synthesis System (Invitrogen Inc.). PCR em tempo real foi realizada com ensaios de expressão genética da Applied Biosystems: p21 (# Hs00355782_m1), TP53 (# Hs00153340_m1), ciclina B1 (# Hs00259126_m1), BubR1 (Hs00176169_m1), FAS (Hs00163653_m1), GADD45A (Hs00169255_m1), MDM2 ( Hs00242813_m1), e HPRT (# 4326321E) como controlo endógeno. As reações foram criados em triplicado usando o TaqMan RÁPIDO Universal PCR Mastermix e gravado em um Fast-PCR em Tempo Real-System 7500 (Applied Biosystems). A expressão relativa de cada gene foi quantificado de acordo com o método do ciclo limiar comparativa (ΔΔ

Ct método) com eficiências de amplificação iguais do alvo e o controlo endógeno.

As proteínas foram extraídas utilizando M-PER de proteínas de mamíferos Reagente de Extracção (Pierce, Perbio Science, Bonn, Alemanha). As concentrações de proteína dos lisados ​​foram determinadas com o kit BCA Protein Assay (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. Quantidades iguais de proteínas foram separadas num gel de 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) numa câmara de electroforese Xcell SureLock (Invitrogen) preenchido com MOPS SDS tampão de corrida e transferido para uma membrana de PVDF (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após o bloqueio dos sítios de ligação não específicos, a membrana foi sondada com anticorpos específicos para CDKN1A (Abcam, # 16767), TP53 (BD ​​Pharmingen, # 15801A), BUB1B (BD Transduction Laboratories, # 612502), ciclina B1 (BD Pharmingen, # 554176 ), γH2AX (norte do estado, # 05-636), PARP (BD Pharmingen, # 551024), fosfo-Ser /Thr-MPM-2 (upstate # 05-368) e GAPDH (Advanced imunoquímico, # RGM2 /Clone 6C5) como controlo de carga.

extracção de ARN para a análise da expressão do gene

As células A549 foram semeadas em placas de cultura celular de 10 cm e deixadas a aderir durante a noite. As células foram então tratadas com meio contendo 2,5 nM SAG, 40 nM SAG, 4 nM ou 40 nM PAC PAC, respectivamente, do veículo (etanol a 0,1%), ou foram deixadas sem tratamento durante 18 horas. O ARN total foi extraído utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), incluindo um I (Qiagen) passo para eliminar o ADN genómico de ADNase. O ARN total foi verificada a integridade de ARN utilizando os LabChips sobre o Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, EUA) e a concentração foi determinada num espectrofotómetro Nanodrop (Peqlab, Erlangen, Alemanha). Todas as amostras de RNA tinham números de alta integridade de RNA [22] maior do que 9,5.

análise de Affymetrix GeneChip®

O One-Cycle eucariótica alvo Labeling Kit (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, EUA ) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 2 mg de RNA total de alta qualidade foi sujeitos a transcrição reversa utilizando um T7 com etiquetas de oligo-dT para a reacção de síntese de ADNc de primeira cadeia. Após a síntese RNase H-mediada segunda cadeia de cDNA, o cDNA de cadeia dupla foi purificado e serviu como modelo para o

in vitro

subsequente reacção de transcrição que gera RNA complementar marcado com biotina (cRNA). O cRNA biotinilado foi então limpo, fragmentado e hibridizado com GeneChip HGU133Plus2.0 matrizes de expressão (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, EUA.), Que contêm 54675 conjuntos de sondas. Os GeneChips foram lavadas e coradas com estreptavidina-ficoeritrina num Fluídica Estação GeneChip 450 (Affymetrix). Após a lavagem, as matrizes foram digitalizados em um scanner de 3000 Affymetrix GeneChip com carregador automático. Um total de 30 matrizes HGU133Plus2.0 foram processados ​​com n = 5 réplicas biológicas para todos os grupos de tratamento.

Expressão As análises foram realizadas com o expressionis Pro 4.0 software (Genedata AG, Basileia, Suíça). A qualidade dos arquivos de dados (formato CEL) contendo dados de expressão de nível sonda foi verificado e refinado usando o software do expressionista Refiner (Genedata AG). O processo refinador foi realizada pelo agrupamento de amostras no nível de intensidade recurso. Isto permite a identificação de possíveis valores extremos no nível de intensidade recurso. Subsequentemente, os ficheiros CEL refinados foram condensados ​​com o algoritmo MAS5.0 (Affymetrix) e LOWESS normalizados utilizando todas as experiências como referência. Os conjuntos de dados de expressão normalizados foram carregados no banco de dados Cobi (Genedata) e analisados ​​com o software Genedata expressionista. Princípio Análise de Componentes (PCA) e de agrupamento hierárquico foi realizada com o software 4.0 Pro expressionista Analyst (Genedata). A análise de valor proporção válida foi realizada para cada grupo (4 de 5 conjuntos de sonda tinha que mostrar um sinal) e os grupos resultantes de conjuntos de sondas foram unidos. Estes dados foram submetidos a uma série de comparações aos pares utilizando o software 4.0 Pro expressionis Analyst (Genedata). As análises estatísticas incluíram comparações de pares entre SAG- ou PAC amostras tratadas e as amostras tratadas com o veículo. conjuntos de sondas foram considerados a ser regulada se estivessem fora da região elipsóide na trama Volcano aplicar os seguintes limites: Lote de Volcano: mudança 5x vezes e P-value 1 × 10-5 a partir de T-teste para 40 nM SAG e PAC; para 2,5 nM SAG e 4 nM PAC mudança de 3 vezes e P-value 5 × 10-3. Venn intersecção análises de forma significativa genes regulados foram realizados para identificar genes regulados comumente por diferentes tratamentos usando o software do expressionista Analista Pro 4.0. análises da via foram realizadas com o GeneGo MetaCore (St. Joseph, MI, EUA) ferramentas de banco de dados e software. Todos os dados em arquivo cel Affymetrix estão disponíveis através do número de acesso ArrayExpress E-MTAB-377.

Clonagem de shRNA constrói

O algoritmo Designer BLOCK-iT RNAi (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA ) foi utilizado para analisar ARNm de TP53 (número de acesso GenBank, NM_000546.4) e a identificação de três sequências alvo para shRNA, ou seja shTP53_1 (sentido) 5′-GCATCTTATCCGAGTGGAAGG-3 ‘e 5′-CCTTCCACTCGGATAAGATGC-3′; shTP53_2 (sentido) 5’-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3 ‘e 5′-GTAGATTACCACTGGAGTC-3′; shTP53_3 (sentido) 5’-GCGCACAGAGGAAGAGAATCT-3 ‘e 5′-AGATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’. As sequências alvo para um controlo não-específica shRNA (não segmentação shRNA) foram shCtrl1 (sentido) 5′-TAAGGCTATGAAGAGATAC-3 ‘e 5′-GTATCTCTTCATAGCCTTA-3′ e shCtrl2 (sentido) 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘e 5 ‘-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3’.

oligonucleótidos de ADN sintéticos complementares foram hibridados e inserido no vector de pENTR /U6 (Invitrogen). cassetes shRNA foram recombinadas pela Gateway clonagem em um Plenti-6 vector destino modificado (pGT3, Invitrogen) para gerar a expressão shRNA lentiviral constrói shCtrl1, shCtrl2, shTP53_1, shTP53_2 e shTP53_3. Todas as construções foram confirmadas por sequenciação de DNA nos Serviços de Biologia Molecular (SMB), Berlim, Alemanha.

Produção de lentivírus e transdução de células A549

293FT células foram transfectadas com diferentes vetores de expressão pGT3 contendo TP53 shRNAs ou controlo não-alvo shRNA. produção de lentivírus foi realizada de acordo com o BLOCK-iT U6 RNAi Vector InserManual Kit do usuário (Invitrogen). As células A549 foram infectadas com lentivírus recombinante para shTP53_1, shTP53_2, shTP53_3, ou o controlo não-alvo shRNAs shCtrl1 e shCtrl2, respectivamente, e seleccionado com higromicina (100 ug /ml). Os clones individuais foram expandidos e testados quanto a eficiência TP53- knockdown por qRT-PCR (dados não mostrados) e imunotransferência.

Resultados

Sagopilone eficazmente inibe a proliferação de linhas de células NSCLC na gama nanomolar

A actividade anti-proliferativa do SAG e PAC foi examinada em 6 linhas celulares de cancro de pulmão de células não-pequenas de diferentes subtipos (adenocarcinoma: A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522; carcinoma de células escamosas: NCI -H226; carcinoma do pulmão de células grandes: NCI-H460) usando um

in vitro

ensaio de proliferação (Fig 1A).. SAG inibiu a proliferação de células de tumor de pulmão em todas as linhas celulares, com valores de IC50 variando 0,2-3,3 nM, e foi eficaz em concentrações sub-nanomolares (nM) ≤1 em cinco das seis linhas celulares. Além disso, a SAG foi consistentemente mais eficaz do que o PAC.

1A, SAG e PAC inibir a proliferação de linhas de células de câncer de pulmão. Seis linhas de células de câncer de pulmão diferentes foram tratados com SAG ou PAC durante 72 horas. A proliferação foi medida com o ensaio de violeta de cristal. Os valores de IC50 médios como medida da inibição de crescimento semi-máxima e desvios padrão são mostrados. 1B, coloração por imunofluorescência de α-tubulina (verde) e de ADN (vermelha) nas células do cancro do pulmão A549 depois de incubação com veículo (0,1% de etanol), 2,5 nM, ou 40 nM SAG. Barra de escala = 20 mm. imagens representativas de interfase e células mitóticas são mostrados. 1C, a análise de FACS das células A549 tratadas com o veículo, de 2,5 e 40 nM SAG ou 4 nM e 40 nM PAC durante 18 horas revelou G2 /M de captura a 40 nM SAG ou PAC e aumento do número de células com 2 N e 2N conteúdo de DNA e de enriquecimento em L

0 /G

1 fase do ciclo celular em 2,5 nM SAG ou 4 nM PAC. 1D, a indução de apoptose por concentrações crescentes de SAG em células A549. As células A549 foram incubadas durante 72 horas com veículo, ou 2,5 nm, 5 nm a 10 nm, 40 nm, ou 100 nM SAG. Além disso, as células foram coradas com iodeto de 3,3′-dihexyloxacarbocyanine (DiOC6 (3)) e de iodeto de propídio para medição de FACS. As barras brancas indicam o percentual médio de células caracterizadas pela diminuição da ΔΨm (ΔΨm baixo) e barras pretas células com sinal ΔΨm baixa e alta de iodeto de propídio (PI + e ΔΨm baixo) devido à ruptura da membrana do plasma indicam. A média de três experiências independentes e desvio padrão é dado.

Sagopilone interfere com as funções do citoesqueleto e induz a apoptose em células A549

Outras experiências sobre o modo geral de acção da SAG foram realizados com a linha de células A549 como modelo. As células A549 tratadas com o veículo mostraram um spread normal de microtúbulos em células em interfase e fusos bipolares típicas com cromossomos congressed na placa metafásica em células mitóticas (Fig. 1B). Em contraste, quando as células A549 foram incubadas com 40 nM marcado SAG enovelamento de microtúbulos em células de interfase era visível o que levou a uma organização eixo anormal em células em metafase, com múltiplos pólos do fuso, várias placas de cromossomas congressed, e um alinhamento cromossómico irregular. Estes efeitos celulares foram dose-dependente e também visto depois da incubação com 2,5 nM SAG, mas em menor grau.

Efeitos da SAG e PAC sobre a progressão do ciclo celular foram medidos em células A549

In vitro

com a análise de FACS (Fig. 1C e suplementar Fig. S1). Foram observados dois fenótipos diferentes: baixas concentrações de SAG ou PAC (0,5-5 nM e 2-7 nM, respectivamente) induziu a divisão celular aberrante, resultando na formação de uma percentagem maior de células aneuploides com um teor de ADN 2N ou 2N, mas apenas um ligeiro aumento na percentagem de células na fase G2 /M. Um fenótipo diferente foi observada em concentrações mais altas de SAG e PAC ( 10 nm): Aqui, um aumento dramático na percentagem de células em G2 /M foi observada fase (Figura 1C e Figura Suplementar S1..). Para todas as análises posteriores dos dois fenótipos diferentes, duas concentrações foram empregados que induzem tanto o fenótipo aneuploidia, ou seja, 2,5 nM SAG ou 4 nM PAC ou o fenótipo paragem da mitose, ou seja, 40 nM SAG ou PAC.

Uma concentração observou-se a indução dependente da apoptose pela SAG na análise FACS depois de 72 horas de incubação. Curiosamente, o tratamento com concentrações baixas de SAG (2,5, 5, e 10 nM) a proliferação de células eficazmente inibida, mas induziu apenas pouca apoptose, enquanto que os tratamentos SAG concentração elevada (40 nM e 100 nM) levou à indução pronunciada da apoptose em células A549 ( Fig. 1D).

efeitos fortes de alta concentração, mas não por baixa concentração sagopilone-tratos sobre as mudanças na expressão dos genes do genoma em células A549

O ARN foi isolado a partir de células A549, sem tratamento , veículo de controlo tratado, assim como tratados com duas concentrações de cada um dos SAG (2,5 nM e 40 nM) e PAC (4 nm e 40 nm) durante 18 horas, e hibridado com matrizes Affymetrix HGU133Plus2.0. Foram obtidos dados de expressão gênica de alta qualidade. Uma análise de componentes principais (PCA) com base na expressão de todos os genes revelou dois grupos principais: Um aglomerado continha o, SAG não tratado tratado com veículo e baixa concentração (2,5 nM) – ou PAC-tratada (4 nM) amostras, ao passo que as amostras tratadas com concentrações elevadas (40 nM) de SAG ou PAC formado um agregado separado (Fig. 2A, 2B), indicando que o tratamento com uma baixa concentração de droga de SAG ou PAC induziu alterações de expressão de gene única relativamente pequenas em comparação com as amostras não tratadas, ao passo que um alta concentração de droga de SAG ou PAC induziram mudanças mais fortes de expressão gênica.

2A e 2B. Princípio Análise de Componentes (PCA) de microarray de dados de células A549 não tratada (cinza), (cinza escuro), ou tratadas com 2,5 nM (azul) ou 40 nM SAG (azul escuro) e 4 nM (verde) ou 40 nM tratado com veículo PAC (verde escuro) durante 18 horas. Cada esfera traçada representa o perfil de uma amostra individual com n = 5 réplicas biológicas independentes sobre a projecção dos dados sobre os três primeiros componentes principais expressão, representando a maior parte da variabilidade nos dados (eixos marcado). Vistas a partir de dois ângulos diferentes (Fig. 2a, 2b) são mostrados para visualizar o clustering.

O teste t pareado comparando cada grupo de tratamento com os grupos tratados com o veículo foram realizadas e os resultados exibidos como Volcano trama (Recurso Fig. S2) que descreve o significado como uma função da mudança de dobragem. Quatro listas de genes foram geradas com os parâmetros de limiar para o valor P e dobre mudança dos tratamentos de alta e baixa concentração de ambos os compostos foram como descritas na Tabela 1, em conjunto com o número total e o número de genes para cima e para baixo-regulados. As listas de genes obtidos a partir dos testes estatísticos foram comparados usando diagramas de Venn. Do total de 503 genes regulados por 40 nM de PAC e 593 por 40 nM SAG, 391 genes foram regulados tanto por ambos os tratamentos, indicando um conjunto semelhante de genes afectados por uma elevada concentração de ambos os TBA. Uma análise do gene ontologia (GO) dos 391 genes regulados com o software GeneGo MetaCore revelou uma ocorrência e grau de ordem semelhante de processos biológicos (dados não mostrados) indicando um mecanismo de acção muito semelhante para ambos os TBA em concentração elevada. Em contraste, quando se comparam os 593 genes regulados por 40 nM SAG com os 221 genes afectados pelo tratamento com 2,5 nM da mesma droga, apenas 41 genes foram geralmente regulada por ambas as concentrações de droga e um magro nove genes foram geralmente regulada por 40 nM ( [32]. [15]. [45].