Abstract

Fundo

células-tronco cancerosas (CSCs) desempenham um papel importante na iniciação do tumor, progressão e metástase e são responsáveis ​​por altas taxas de fracasso terapêutico. Identificação e caracterização de CSC são cruciais para facilitar a monitorização, a terapia ou prevenção de cancro. Grandes esforços têm sido pagos para desenvolver uma metodologia mais eficaz. No entanto, o modelo ideal para a investigação CSC ainda está evoluindo. Neste estudo, foi criado um sistema de cultura não adesivo para enriquecer CSCs de linhas celulares de carcinoma epidermóide de boca humanos com formação de esfera e caracterizar suas propriedades CSC ainda mais.

Métodos

Um sistema de cultura não adesivo foi concebido para gerar esferas de SAS e linhas celulares OECM-1. Uma investigação posterior de suas propriedades CSC, incluindo stemness, auto-renovação, e quimioterapia e radiorresistência

in vitro

, bem como capacidade de iniciação do tumor

in vivo

, também foi realizada.

Resultados

Spheres foram formados de forma rentável e tempo de forma eficiente dentro de 5 a 7 dias. Além disso, provamos que essas esferas expressa marcadores de células estaminais putativas e exibiu resistência chemoradiotherapeutic, além de capacidades de iniciação do tumor e de auto-renovação.

Conclusões

Usando este sistema de cultura não adesivo, nós com sucesso estabeleceu um modelo rápida e de baixo custo que exibe as características de CSCs e pode ser usado na pesquisa do câncer

Citation:. Chen SF, Chang YC, Nieh S, Liu CL, Yang CY, Lin YS (2012) Sistema de Cultura não adesiva como um modelo de formação rápida Sphere com propriedades de células-tronco cancerígenas. PLoS ONE 7 (2): e31864. doi: 10.1371 /journal.pone.0031864

editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de dezembro de 2011; Aceito: 14 de janeiro de 2012; Publicação: 16 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente apoiado pela Tri-Service general Hospital e National Defense Medical Centre: Grant No. TSGH-C100-007-009-10-S02, TSGH-C100-161, TSGH-C100-155 e I-29; Departamento de Higiene Dental, China Medical University: Grant No. CMU99-N1-04-1; Conselho Nacional de Ciência, República da China (Taiwan): Concede No. 99-2320 NSC-B-039-028-MY3 e NSC 100-2320-B-016-009; Departamento de Saúde, Executive Yuan, República da China (Taiwan): DOH100-TD-PB-111-TM007-22. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas oral (CCEO) é uma das neoplasias mais comuns e letais de cabeça e pescoço em Taiwan e em todo o mundo [1], [2]. CEB é uma doença que é difícil de tratar por causa das diversas estratégias de tratamento disponíveis e o comportamento natural variável do câncer. invasão local e frequentes metástases em linfonodos regionais, em conjunto com a resistência relativa a drogas quimioterápicas, conduzir a um resultado imprevisível [2] – [4]. Apesar do aumento da experiência em tecnologia cirúrgica e tratamentos adjuvantes, os prognósticos globais do CCEO permanecem sem melhorias, resultando na necessidade urgente de uma nova estratégia para o tratamento CCEO [3], [5].

evidências substanciais de estudos recentes mostram tumores sólidos que contêm uma subpopulação de células-tronco do cancro (CCC) [6] – [8]. É bem conhecido que os CSCs desempenhar um papel importante na iniciação do tumor, progressão, metástase, e resistência terapêutica [9] – [11]. No entanto, os CSCs putativos de CCEO não foram bem caracterizados. Supõe-se que os CSCs possuem várias características que os tornam resistentes a quimioterapia e radioterapia convencional, incluindo a expressão elevada de transportadores de fármacos, quiescência-ciclo celular relativa, elevada função de máquinas de reparação do ADN, e resistência à apoptose [12], [13] . A identificação e caracterização de CSCs do CCEO são cruciais para facilitar o acompanhamento, tratamento e prevenção da doença.

O isolamento de CSCs a partir de células cancerosas tem sido alcançado com sucesso através do uso de técnicas diferentes. O isolamento das CSCs é efectuada utilizando citometria de fluxo com base na expressão de marcadores específicos da superfície celular, tais como CD133, CD44 e ALDH1, por CSCs [14] – [20]. Devido à resistência terapêutica de CSCs, classificando as populações de células cancerosas laterais através intracelular Hoechst 33342 exclusão ou selecção de células-quimioterapêutico-resistentes também tem sido utilizado para a identificação e caracterização de CSCs [21] – [23]. estudos simultâneos confirmou que o sistema de esfera cultura é tão eficiente na separação de CSCs de muitos tumores sólidos ou células cancerosas linhas. Estes estudos sugeriram que os CSCs pode ser enriquecido em esferas quando estas são cultivadas em meio livre de soro suplementado com mitogénios adequados, tais como o factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e factor de crescimento epidérmico (EGF) [11], [24] – [26]. Contudo, a derivação de CSCs de tumores sólidos e de linhas de células de cancro cultivadas em meio isento de soro suplementado com bFGF e EGF é um processo que consome tempo e 2-6 semanas são necessários para a formação de esfera [11], [24] – [26 ]. Além disso, os factores de crescimento seleccionados, tais como o factor de crescimento derivado de plaquetas, bFGF, e EGF, são caros e ineficazes. Para superar estas desvantagens e limitações, foi utilizado um sistema de cultura concebido de propósito esfera não adesivo para identificar e enriquecer CSCs de linhas de células de CCEO humanos estabelecidos, e caracterizar suas propriedades CSC usando mais fenotípica /genotípica.

Resultados

A formação de esfera a partir de linhas celulares humanas CEs

linhas celulares CEB (SAS e OECM-1) foram suavemente dissociados em células singulares e semeadas em louças de cultura de plástico com um revestimento não adesivo, como mostrado na figura 1. uma parte da suspensão de células podem sofrer apoptose durante os primeiros 2 dias, quando cultivadas num meio não adesivo, suspensa. Algumas das células em suspensão agregada e, em seguida, fundiram-se e diferenciar-se em esferas tridimensionais (3D) com uma configuração esferóide. A alteração morfológica subsequente (~3-5 dias) consistiu em esferas flutuantes. Depois de 5-7 dias de cultura, foram observados esferas com uma rodada e contorno suave. Estas esferas cresceram gradualmente ao longo do tempo (Figura 1A). Morfologicamente, as esferas apareceu mais fortemente ligados, a agregação ou a sobreposição de uma configuração 3D, em comparação com os observados nas células parentais. Um estudo anterior sugeriu que a derivação de esferas a partir de linhas de células de cancro ou células de cultura primária pode acompanhar a alteração de fenotípicos /genotípicas características, tais como a transição epitelial-mesenquimal (EMT) [27]. Os marcadores de EMT representativos E-caderina e fibronectina foram escolhidos para identificar e comparar as diferenças entre as células parentais e esferas em células OECM-1 e SAS. O exame microscópico das células e esferas parentais imuno-histoquimicamente coradas mostrou a presença de expressão generalizada e difusa de E-caderina e escasso de fibronectina nas células parentais, enquanto que as esferas exibiu perda de expressão de E-caderina e a sobre-expressão de fibronectina (Figura 1B).

(a) microfotografias de contraste de fase das esferas cultivadas a partir de SAS (topo) e OECM-1 (parte inferior) linhas de células usando um design não adesivo (quatro mais à esquerda painéis superiores e inferiores: do dia 0 ao dia 7, ampliação , 200 ×, e mais à direita painéis superiores inferiores: dia 10, ampliação, 100 ×). (B) os resultados Imuno-histoquímica mostrando diversos padrões de transição representante epitelial-mesenquimal (EMT) marcadores em OECM1 células parentais e esferas (ampliação, 200 ×) de expressão.

A expressão de marcadores de superfície de células estaminais putativas

para elucidar se esferas poderia enriquecer as células que expressam marcadores de células-tronco do câncer putativos, optamos por analisar o perfil de dois marcadores de superfície de células-tronco representativas de CCEO, CD133 e ALDH1 expressão [11], [14] – [18]. Como mostrado na Figura 2A e B, as células parentais e as esferas (após 7 dias de cultura) não adesiva foram positivamente coradas para CD133 e ALDH1. A expressão de CD133 e ALDH1 era geralmente ausente ou muito baixa em células parentais. Detectamos um aumento de 3-4% na expressão de CD133 e um aumento de 20-30% na expressão ALDH1 em esferas em comparação com as células parentais. Os níveis de expressão de CD133 e ALDH1 foram significativamente maiores em esferas do que em células parentais (Figura 2C).

(A) As células parentais e as esferas foram coradas quer com um anticorpo IgG de controlo negativo (aberta espaço) ou anticorpos anti-CD133 experimentais (espaço sólido). (B) Comparação da expressão de ALDH1 entre as células parentais e esferas; DEAB, um inibidor de ALDH1, foi utilizado como um controlo negativo. (C) comparações quantitativas e estatísticas da percentagem de sinais positivos para CD133 e ALDH1 entre as células e esferas parentais (*

P Art 0,05).

A expressão de células-tronco do câncer genes e proteínas relacionadas

a expressão de genes de células-tronco e proteínas relacionadas, incluindo

SOX2

,

Oct4

, e

NANOG

, foi examinado no transcrição e da tradução níveis. O ARN total foi purificado a partir de células progenitoras e esferas após 7 dias de cultura não adesiva. Os níveis de SOX2, transcrições Oct4, e NANOG foram significativamente aumentados em comparação com esferas células parentais, tal como avaliado usando transcrição reversa análise de PCR (Figura 3A). dados de transferência de Western mostrou que a expressão das proteínas, SOX2 Oct4, e NANOG também foi regulada positivamente em esferas em comparação com as células parentais (Figura 3B). Além disso, utilizou-se imunofluorescência para avaliar os níveis celulares de CD133, ALDH1, SOX2, Oct4 e NANOG em esferas. Observou-se diversos padrões de expressão para estas proteínas, tal como indicado na Figura 3C, o que sugere heterogeneidade de CEB. CD133 foi expressa na membrana da célula e ALDH1 foi expresso na membrana celular e no citoplasma, ao passo que SOX2, Oct4, e NANOG foram expressas no núcleo.

(a) uma análise de RT-PCR mostrou que a expressão de

SOX2, Oct4 e NANOG

genes foi regulada nas esferas comparação com células parentais. (B) Análise de transferência de Western mostrou que a expressão de SOX2, Oct4, e NANOG foi regulada positivamente em esferas em comparação com as células parentais. (C) Análise por imunofluorescência de marcadores CSC em esferas demonstrou a presença de CSCs com níveis variáveis ​​de expressão de CD133, ALDH1, SOX2, Oct4, e NANOG, como indicado pelas setas (ampliação, x 200).

Radio- e quimio-sensibilidade

para avaliar a radiossensibilidade das células parentais e esferas, nós tratamos estas células e esferas com doses de radiação até 10 Gy para avaliar a viabilidade celular, que foi medida utilizando um ensaio MTS depois 36 h de tratamento de radiação. As esferas foram mais do que radiorresistente células parentais (Figura 4A). Também examinou a quimio-sensibilidade das células parentais e esferas usando a cisplatina. células parentais e as esferas foram tratadas com cisplatina durante 48 horas e a viabilidade celular foi medida subsequentemente utilizando um ensaio de MTS (Figura 4B). As esferas foram mais resistentes à cisplatina do que as células parentais. Para imitar o estado clínico, administrou-se uma quimioterapia combinada e tratamento de radioterapia (CCRT), com (1) a quimioterapia inicial que consiste de 20 pM de cisplatina durante 24 h seguida por radiação (Figura 4C) ou (2) irradiação inicial seguida por quimioterapia utilizando cisplatina 20 uM durante 24 h (Figura 4D). Os resultados do tratamento utilizando estes dois regimes CCRT revelado que as combinações foram mais eficazes na redução da taxa de sobrevivência das células parentais e esferas comparado com um tratamento único de qualquer das radiações ou quimioterapia. Além disso, as esferas foram mais resistentes do que as células parentais (com níveis de significância variável) quando se utiliza o tratamento combinado.

Foram observadas diferenças significativas em (A) radiossensibilidade e (B) quimio-sensibilidade entre as células parentais e esferas. (C) por quimioterapia e radioterapia combinadas (CCRT) com quimioterapia inicial durante 24 h seguida por radiação. (D) CCRT com radiação inicial seguida por quimioterapia durante 24 h. Os dois regimes CCRT foram mais eficazes na redução da taxa de sobrevivência das células parentais e esferas comparado com o tratamento único usando radiação ou quimioterapia (*

P Art 0,05).

In vivo

tumorigenicidade

para confirmar as capacidades de iniciação tumor enriquecidos de esferas

in vivo

, ambas as células parentais e esferas foram injetadas em ratos pelados, para análise de tumorigenicidade transplantado. Esferas derivadas de células SAS deram origem a tumores quando 1 × 10

5 células foram injetadas em ratos (dois dos três ratos), e esferas derivadas de tumores OECM-11 células geradas quando apenas 1 × 10

4 células foram injectados em ratinhos (um dos três ratos). Em contraste, 1 × 10

6 foram necessários para gerar células parentais tumores, sugerindo que as esferas foram enriquecidas para células de iniciação do tumor de, pelo menos, 10 a 100 vezes em comparação com as células parentais (Tabela 1). Uma análise comparativa da aparência bruta entre os tumores recém-gerados a partir de células progenitoras e esferas revelou a presença de diferenças significativas em relação ao tamanho e contorno. Esferas produziu tumores de um tamanho muito maior com um contorno irregular, expansível comparados com os tumores gerados por células parentais (Figura 5A). Uma análise comparativa da histológico correspondente e os resultados de imuno-histoquímica de marcadores de EMT representativos mostraram que os tumores derivados de esferas parecia ser mais agressivos e têm uma aparência mesenquimal-like e invasão do estroma proeminente em comparação com os tumores derivados de células parentais. Observou-se expressão desigual de E-caderina em tumores derivados de células parentais, e perda de expressão de E-caderina em tumores derivados de esferas. Houve uma sobre-expressão óbvia de fibronectina em tumores derivados de esferas em comparação com os tumores derivados das células parentais (Figura 5B). As culturas primárias preparadas a partir da ressecção de tumores induzidos por esferas em ratinhos NOD /SCID demonstrou uma transformação gradual da esfera formação primária e secundária, sugerindo que as esferas têm uma grande capacidade de auto-renovação (Figura 5C)

.

( a) aparência macroscópica de um tumor representativo formada por inoculação de células parentais e dissociado esferas em ratinhos NOD /SCID (n = 3, em cada grupo). (B) correspondente achados histológicos e imunofenotipagem para marcadores EMT representativos em NOD /SCID (Ampliação, 100 ×). (C) a cultura primária de células dissociadas das esferas induzidas OECM-1 originalmente isoladas de NOD /SCID demonstrou uma transformação gradual do primário (1

st) e secundária (2

ND) esferas (ampliação, 100 × ).

Discussão

O conceito de CSCs e suas aplicações têm sido relatados nas últimas décadas. O termo “células-tronco cancerígenas” foi definido em 2006 pela Associação Americana para o Workshop de Pesquisa do Câncer de células-tronco cancerosas como uma célula dentro de um tumor que possui a capacidade de se auto-renovar e para gerar as linhagens heterogéneas de células cancerosas que compõem o tumor [6]. A revisão da literatura demonstrou que CSCs foram isoladas pela primeira vez por Bonnet e Dijk na leucemia mielóide aguda, e Al Hajj foi o primeiro a identificá-los em tumores sólidos [28], [29]. Até à data, os CSCs foram identificados em muitos tumores sólidos, incluindo o cérebro, mama, pulmão, próstata, e cancros do cólon [24], [25], [30] – [33] .A teoria CSC clarifica não só o problema de tumor iniciação, o desenvolvimento de metástases, e recaída, mas também a ineficácia das terapias do cancro convencionais. De acordo com o conhecimento actual, a iniciação, a recorrência, e metástase de cancros pode ser explicada, pelo menos em parte, pela presença de CSCs [6] – [8], [34]. Por conseguinte, o desenvolvimento de um modelo fiável de CSCs torna-se crucial para a investigação básica e clínica do cancro.

Várias técnicas foram utilizadas para isolar as CSCs de cânceres (Tabela 2 e Figura S1). Inicialmente, tal como os marcadores de superfície específicos para CD34 e CD38 tinha sido extensivamente validado para a identificação de células-tronco hematopoiéticas normais, estas moléculas foram utilizados como marcadores em estudos originais de células estaminais leucemia [28]. Subsequentemente, CD24 e CD44 foram seleccionados como marcadores CSC em tumores da mama [29]. No entanto, actualmente não existe consenso aparente sobre a “melhor marcador (s)” deve ser utilizado para a identificação das CSCs em qualquer tipo de cancro em particular. Existem alguns relatórios demonstraram que o CD44 é um marcador selectivo das CSCs de HNSCC [19], [20]. No entanto, os nossos dados mostraram que CD24 e CD44 foram abundantemente presentes em ambas as células progenitoras e as esferas (até 20-40%) (Figura S2). Foram selecionados dois outros marcadores de superfície de células-tronco representante de CEO, CD133 e ALDH1, para detectar o perfil de ambas as células parentais e esferas [11] expressão, [14] – [18]. A expressão de CD133 e ALDH1 era geralmente ausente ou muito baixa em células parentais comparado com maior CD133 (3-4%) e ALDH1 (20-30%) expressão em esferas. Embora a expressão de CD133 e ALDH1 foi significativamente maior em esferas do que nas células parentais, CD133 e ALDH1 foram marcadores CSC relativamente adequados em CEB, mas não eram adequados para o isolamento de CSCs do cancro adequada devido à heterogeneidade do tumor e reprodutibilidade imprevisível (Figura S1A). A identificação do marcador de superfície específico (s) para a identificação de alvos terapêuticos CSCs e continua a ser um desafio. A classificação das populações de células cancerosas laterais através intracelular Hoechst 33342 exclusão e /ou seleccionando as células resistentes à droga quimioterapêutica também têm sido utilizadas para a identificação e caracterização de CSCs [21] – [23], [31]. No entanto, o método de classificação das populações laterais através de Hoechst 33342 exclusão produziu apenas um pequeno número de CSCs (0,23-22,3%), o que é inadequado para experimentação adicional [21], [22], [31]. Estudos recentes mostraram que a CSC selecção através de isolamento de células-quimioterapêutico-resistentes podem proporcionar um número limitado de CSCs (20-40%); No entanto, a produção de grandes quantidades de CSCs foi caro e demorado (Figura S1B) [17]. Estudos recentes têm sugerido também que CSCs pode ser enriquecido em esferas quando cultivadas em meio sem soro suplementado com factores de crescimento adequados [11], [24] – [26]. A produção de CSCs derivadas de células CEs cultivadas em meio isento de soro suplementado com bFGF e EGF foi um longo, demorado, e procedimento de custo-eficácia para a esfera formação [11], como mostrado na parte superior da Figura S1C.

estudos anteriores revelaram que muitos tipos de células têm sido descritos em relação à formação de esferóides 3D quando cultivadas em suspensão ou em um ambiente não adesiva [35], [36]. esferóides 3D são amplamente utilizados como modelos para estudo metástase e invasão do cancro e para o rastreio terapêutico; No entanto, para o melhor de nosso conhecimento, nenhum deles mencionou as propriedades de CSCs [36] – [39]. No estudo atual, estabelecido pela primeira vez um modelo de formação rápida e adequada esfera de linhas de células de CCEO humanos. Com base em um sistema de cultura não adesivo, este modelo era hora eficiente porque esferas foram geradas dentro de 5 a 7 dias (Figura 1A). Além disso, este sistema de cultura modificado não adesiva é rentável e não necessita de factores de crescimento em comparação com o sistema de esfera cultura anterior. Não pode enriquecer única com sucesso a formação esfera de linhas de células de CCEO (SAS, OECM-1, Cal27, SCC25 e Ca922), mas também gera esferas de linhas celulares de cancro de outras partes da cabeça e pescoço (FADU e TW205), a partir do cólon (HT29 e COLO320), e do pulmão (NCI-H23 e NCI-H661) (dados não mostrados). Certos evidência mostra que a formação de esferas pode ser alcançado dentro de 10-15 dias em meio isento de soro suplementado com factores de crescimento [30], [40]. No entanto, essas esferas são morfologicamente mais propensos a ser agregados de corpos de uva-like com contorno irregular, e não realmente esferas, como as observadas em nosso estudo (Tabela 2 e Figura S1). No nosso sistema de cultura não adesivo, as esferas apareceu mais firmemente ligado, redondo bola-like, e lisa no contorno. Além disso, a expressão de genes representativas tronco do câncer de células e proteínas relacionadas, incluindo

SOX2

,

Oct4

, e

NANOG

, foi regulada em esferas em comparação com aqueles detectados em parental células, tanto o ARN e os níveis da proteína (Figuras 3A e B). Utilizando a análise de imunofluorescência, demonstramos que as esferas exibem heterogeneidade histológica explícita, bem como propriedades CSC (Figura 3C). A evidência de aumento de resistência por CSCs terapêutico, que é uma outra propriedade importante destas células, foi avaliado. O fenómeno de a recorrência de muitos cancros após quimioterapia ou radioterapia pode resultar da sobrevivência e manutenção das CSCs. Em nosso estudo, nós demonstramos que as esferas eram mais radioterapia e resistente à quimioterapia, em comparação com células parentais (Figura 4A e B). Devido à diferente origem e as características de SAS e células OECM-1, houve um resultado de tratamento diferentes nestes dois tipos de células. SAS células eram mais sensíveis à quimioterapia, mas mais resistente à radiação; Em contraste, as células OECM-1 foram mais sensíveis à radiação, mas mais resistentes a quimioterapia. TRCC foi mais eficaz na redução da taxa de sobrevivência para ambas as células progenitoras e esferas em comparação com um único tratamento com radiação ou quimioterapia. No entanto, as esferas foram ainda mais resistentes do que as células parentais quando se utiliza o tratamento combinado. A utilização deste sistema de cultura não adesivo pode proporcionar uma nova visão e um novo modelo de CSCs que é aplicável em investigação terapêutica. estudos xenotransplante também pode ajudar a identificar e confirmar a capacidade consecutivamente tumorigênico de sistemas de cultura não aderentes. Inoculação de ambas as células parentais e esferas em murganhos NOD-SCID gerado novo tumor (s) 7 dias após a implantação e levou a um aumento no tamanho do tumor ao longo do tempo. Uma análise comparativa mostrou que os tumores gerados-esfera exibiu um tamanho muito maior com um contorno irregular, expansível em comparação com os que são gerados por células parentais (Figura 5A). Com base na cultura primária de células de tumores dissolvidos gerado-esfera, que foram transformados utilizando os mesmos protocolos, esferas primário e secundário foram gerados com sucesso, indicando a sua capacidade de auto-renovação (Figura 5C). Curiosamente, os correspondentes resultados histológicos e imuno-histoquímico mostrou que tumores derivados de esferas exibiu uma perda de E-caderina e regulação positiva de fibronectina, parecia ser mais agressivo, e tinha uma aparência mesenquimal-like comparação com tumores derivados de células parentais (Figura 5B) .

Como mencionado anteriormente, as esferas enriquecidas em cultura de linhas celulares de CEs através de um sistema de cultura não adesivo pode, inicialmente, ficam suspensas e isolada a partir das células progenitoras, e formar aglomerados pequenos. Tais esferas cultivadas em uma condição não adesivo posteriormente exibem reduzida célula-célula ou interações célula-matriz, perdem a sua ancoragem, e tornaram-se desabrigados. Isso desencadeia um fenômeno chamado “anoikis”, presumivelmente resultando em resposta apoptótica [41]. Flutuantes esferas em um estado de anoikis no meio de cultura são isoladas e, embora eles tentam aderir, são incapazes de ligar à placa subjacente ou envolvente, que são esperados a desaparecer no final. Como podem estas células cancerosas sobrevivem e proliferam para superar a ameaça de anoikis? O mecanismo está envolvido na aquisição de sinais de sobrevivência que oferecem a capacidade para sobreviver e proliferar em uma população de tumores flutuante que carece do andaime em fase sólida normal, o que constitui um microambiente desafiados? Vários estudos têm sugerido que a adversidade atendidas por esferas em uma condição não adesivo, suspenso pode ser estimulada por EMT e também incentivar a inscrição do potencial de propriedades CSC [42], [43]. A literatura também revela que algumas vias de sinalização medeiam EMT e CSC propriedades, como WNT, Sonic hedgehog, Caracol /Slug e NOTCH [44] – [46]. Há evidências crescentes sugerindo que existe uma relação entre EMT e CSCs que envolve alteração da morfologia celular e motilidade. Estes conceitos podem explicar por que o nosso sistema de cultura não adesivo pode ser utilizado para enriquecer CSCs de linhas celulares de cancro.

Em conclusão, utilizando um sistema de cultura modificado não adesiva e uma série posterior de experiências, não só as propriedades validado CSC de esferas isolado a partir de linhas de células de CCEO, mas também estabeleceu com sucesso um método rápido e econômico que pode fornecer novos insights e um modelo recém-aplicável para a pesquisa CSC.

Materiais e Métodos

células

a linha de células de cancro da língua humana SAS, obtida a partir da Colecção japonesa, foi cultivada em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C na presença de 5% de CO

2. A linha gengival humano escamoso de células de carcinoma com uma p53 missens OECM-1, foi cultivada em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS a 37 ° C na presença de 5% de CO

2. Estas duas linhas celulares bem estabelecidas foram gentilmente cedidas pelo Dr. Yi-Shing Shieh do Departamento de Diagnóstico Oral e Patologia, Tri-Service General Hospital, Taipei, Taiwan [47].

cultura Sphere

As duas linhas de células foram cultivadas em louças de plástico de cultura com a superfície não adesiva. Placa de 10 cm são feitos de não adesivas para células por revestimento com filmes finos de agarose. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 5 × 10

4 ao vivo células /placa de 10 cm, e o meio de cultura foi trocado a cada dois dias até a formação esfera.

Imunohistoquímica

As secções de tecido ou bloco de células foram de-encerado em xilol e reidratados em álcool. A recuperação de antígenos foi realizada por incubação em 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) a 95 ° C durante 40 min. A peroxidase endógena foi bloqueada com 0,3% de peróxido de hidrogénio durante 10 min e depois incubadas com soro normal de cavalo a 5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 60 min à temperatura ambiente para bloquear a reacção não específica de anticorpos. Depois de uma lavagem com Tris-tamponada salina mais 0,1% de Tween 20 (TBST), as lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários, a E-caderina (SC-8426; 1:800) e fibronetin (SC-18825; 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, EUA). Depois de ser lavado em TBST, as lâminas foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente com anticorpo secundário biotinilado seguido de estreptavidina-biotinilado-complexo enzimático (kit streptABComplexes; Dako, Glostrup, Dinamarca). Posteriormente, eles foram coradas com 0,003% tetrahidrocloreto 3,3-diaminobenzidina, contrastadas com hematoxilina de Mayer, desidratado, e montado.

A citometria de fluxo

1 × 10

suspensão de uma única célula 6 a partir de células tratadas com tripsina e esferas foram respondeu em 1 ml de PBS e coradas com CD133 (C24B9 clone, 1:200) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) e aldeído desidrogenase 1 (ALDH1) (kit de ensaio ALDEFLUOR; StemCell Technologies, Durham, NC , EUA). Após marcação, as células foram lavadas três vezes com PBS e subsequentemente coradas com FITC ou anticorpo secundário marcado com PE durante 30 minutos no escuro. As células foram analisadas num citómetro de fluxo ao fim de três lavagens com PBS.

reacção em cadeia da polimerase de transcrição reversa-(RT-PCR)

O ARN total foi isolado com Reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia , EUA) e quantificado por espectrofotometria a 260 nm. Em uma GeneAmp® PCR Sistema termociclador 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), 5 ^ g de cada ARN total foi transcrito de forma inversa com SuperScript III (Invitrogen) a 55 ° C durante 1 hora em ADN complementar total, o que foi usado como molde para as reacções subsequentes de PCR e análise. As reacções de PCR envolveu uma desnaturação inicial a 94 ° C durante 5 minutos, seguido de 25 ou 30 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, a exposição a uma temperatura de emparelhamento apropriada (58-62 ° C) durante 30 segundos, e, em seguida, uma definitiva de incubação a 72 ° C durante 45 segundos. Os iniciadores de PCR para análise de ARNm foram: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), sentido (5′-AGCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3 ‘) e anti-sentido (5′-TCATATTTGGCAGGTTTTTCT-3’);

Oct-4 , sentido (5′-CGCACCACTGGCATTGTCAT-3 ‘)

e antisense (5′-TTCTCCTTGATGTCACGCAC-3′);

Nanog, sentido (5′-AATACCTCAGCCTCCAGCAGATG-3 ‘)

e anti-sentido (5′-CTGCGTCACACCATTGCTATTCT-3 ‘);

SOX2, sentido (5′-GGCAGCTACGCATGATGCAGGAGC-3′)

e anti-sentido (5′-CTGGTCATGGAGTTGTACTGCACG-3 ‘) . Os produtos amplificados por RT-PCR foram então analisados ​​em géis de agarose a 1% e visualizados utilizando coloração com brometo de etídio e um sistema de câmara (Transiluminador /local; Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, EUA). As imagens do gel dos produtos de RT-PCR foram directamente digitalizada (1-D Analysis Software ONEDscan gel; Scanalytic Inc. Fairfax, VA, EUA), e as densidades relativas foram obtidos através da determinação da relação entre a intensidade do sinal para a banda de GAPDH. A expressão de genes entre o ensaio (ciclosporina A tratados) e os grupos de controlo foi comparada.

Western blotting

lisados ​​celulares totais foram separadas por electroforese em 12% SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno . As membranas foram bloqueadas com leite magro a 5% à temperatura ambiente durante 1 h. Foram utilizados os anticorpos primários: GAPDH (ab9482; 1:5000 diluição) (Abcam, Cambridge, MA, EUA), oct-3/4 (sc-8630; 1:1000), NANOG (SC-81961; 1:1000) e SOX2 (SC-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology) em tampão TBST contendo 3% de leite desnatado a 4 ° C durante a noite e subsequentemente com o anti-ratinho e o anticorpo secundário de coelho anti-cabra conjugado com peroxidase (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology) a 25 ° C durante 1 h. Os imunoblots foram desenvolvidas usando um sistema de quimioluminescência aumentada, e a luminescência foi visualizada em película de raios-X.

Imunofluorescência

As células vivas e as esferas foram fixadas em 4% de paraformaldeído, permeabilizadas em 0,1% Triton X-100, e bloqueados em 5% de cabra normal sérica PBS. As células foram incubadas com anticorpos primários, oct-3/4 (sc-8630, 1:200), NANOG (SC-81961,1:200), SOX2 (SC-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology), CD133 (clone C24B9,1:200) (Cell Signaling Technology) e ALDH1 (clone 44, 1:200) (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA), lavada três vezes em PBS e depois incubadas com anticorpos de cabra anti-murganho ou anticorpos secundários conjugado com FITC (verde) ou PE (vermelho). O DAPI foi utilizado como corante nuclear (azul).