Abstract

Fundo

O câncer colorretal é o terceiro mais câncer incidente e causa de Câncer morte relacionada nos Estados Unidos. Os microRNAs, uma classe de pequenos RNAs não-codificantes, têm sido implicados na patogênese e prognóstico do câncer colorretal, embora poucos estudos examinaram a relação entre a mutação germinativa nos microRNAs com risco e prognóstico. Por isso, investigou a associação entre um SNP em

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, que fica dentro do 10q24 lugar, e cancro colorectal.

Métodos e Resultados

Um grupo consistindo de 245 casos e 446 controles foi genotipados para rs4919510. A freqüência do genótipo GG foi significativamente maior em afro-americanos (15%) em comparação com os caucasianos (3%) controles. Não houve associação significativa entre rs4919510 e risco de câncer colorretal (American Africano: OR

GG

vs

CC [95% CI, 0,41-1,80] 0,89.) (Caucasiana: OR

GG

vs.

CC 1,76, ([95% CI, 0,48-6,39]). no entanto, foi observada uma associação com a sobrevivência. O genótipo GG foi associado com um risco aumentado de morte em caucasianos (HR

GG

vs.

CC 3,54 ([95% CI, 1,38-9,12]) e com um risco reduzido de morte em afro-americanos (HR

GG

vs.

CC 0,36 ([95 CI% 0,12-1,07)

Conclusões

Estes resultados sugerem que rs4910510 pode estar associada a sobrevivência de câncer colorretal em uma forma que é dependente de raça

Citation:.. Ryan BM, McClary AC, Valeri N, Robinson D, Paone a, Bowman ED, et al. (2012) rs4919510 no

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está associado com o resultado, mas não sem risco de cancro colorectal. PLoS ONE 7 . (5): e36306 doi: 10.1371 /journal.pone.0036306

editor: Paolo Peterlongo, IFOM, Fondazione Istituto FIRC di Oncologia Molecolare, Itália |

Recebido: 09 de fevereiro de 2012; Aceito: 31 de março de 2012; Publicado em: 11 de maio de 2012

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer e em parte pela o Centro National Cancer Institute of Excellence para a Integração da Biologia Chromosome e Genética. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma colorretal é o terceiro mais câncer incidente e causa de mortalidade relacionada ao câncer nos Estados Unidos. As estimativas para 2011 prever 141,210 novos casos de cancro colorectal e 49,380 mortes [1]. Nos últimos dez anos, houve avanços significativos em nossa compreensão da história natural e dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento de cancro colorrectal. Além disso, as orientações de fundo para triagem foram desenvolvidos pela Força-Tarefa de Serviços Preventivos dos Estados Unidos. melhorias terapêuticos também foram alcançados, particularmente após a aprovação de 2004, de bevacizumab (Avastin®) para a doença avançada. Apesar destes avanços, a sobrevivência de cinco anos para o câncer colorretal aumentou apenas ~ 5 pontos percentuais nos últimos anos [1].

Embora essa tendência sobrevivência vale para ambos os americanos e caucasianos africanas, uma disparidade de saúde facilmente perceptível existe para os afro-americanos. Por 65 anos, os afro-americanos têm um valor aproximado de 25% maior probabilidade de desenvolver carcinoma colorretal relação aos caucasianos [1], [2]. Além disso, a incidência de câncer colorretal em afro-americanos em 2007 foi estimado a ser essencialmente o mesmo que em 1975, enquanto que os caucasianos têm experimentado uma queda de 17 percentual na incidência. Vinte e quatro por cento dos cancros colo-rectais são detectados em fase tardia em afro-americanos, em comparação com 19% em caucasianos. Isso pode em parte explicar a taxa de sobrevida global significativamente pior em afro-americanos, que têm um 15% maior risco de morrer de câncer colorretal quando comparado aos caucasianos [1], [2].

microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs, não-codificante composta por cerca de 22-25 nucleótidos, na sua forma processada, madura. Até à data, mais de 1000 miARNs foram descobertos em seres humanos, com algumas estimativas prevendo uma contagem final de vários milhares de [3], [4], Fisiologicamente, miARNs actuar como um reóstato, saída de sintonização fina através de translação o ARNm alvo de ligação e de repressão. O repertório de um miARN alvo é definida essencialmente pela sua

semente

sequência, 2-6 nucleótidos na extremidade 3 ‘da sua forma madura. Uma variedade de associações patológicos têm sido atribuídas a redes de miARN alteradas particularmente no cancro, com miARNs capazes de funcionar tanto como oncogenes e supressores de tumor [5], [6], [7].

Numerosos estudos têm ligações tanto expressão aberrante e variação genética em miRNAs para o risco de câncer colorretal, diagnóstico, prognóstico e resposta à droga [8], [9], [10], [11]. polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em miRNAs pode afetar sua biogênese, processamento e /ou local de ligação alvo em uma variedade de formas, como em destaque na nossa recente revisão [12]. Por exemplo, uma vez que microRNAs são processadas de uma forma passo a passo de

pri

para

pré

a uma cadeia madura, um processo guiado pela estrutura secundária estereotipada, pode-se conceituar como um único par de bases mudança poderia afetar o processamento ou do reconhecimento pelo componentes de guia [12]. Alternativamente, um SNP na sequência madura pode alterar as interacções no local alvo por reforçar ou enfraquecer a cinética de hibridação, ou se a sequência de semente, que pode transformar significativamente a biblioteca de destino do próprio miARN. Curiosamente, a prevalência destas SNPs em miARNs é significativamente menor do que o previsto na parte restante do genoma, falando para a conservação evolutiva e a importância destas pequenas biomoléculas [13], [14]. No entanto, alguns relatórios recentemente destacada uma associação entre essas variações baixas germinativas frequência eo risco de câncer e /ou prognóstico [12].

Perda de heterozigosidade na 10q24 lócus tem sido relatada em uma série de cancros humanos, incluindo, mas não limitado a colorretal, próstata, pâncreas e cérebro [15], [16], [17], [18]. Apesar de numerosas investigações sobre um possível gene supressor de tumor neste hotspot, uma forte evidência de que falta [19]. Curiosamente,

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, um microRNA que praticamente nada se sabe funcionalmente, encontra-se dentro de um intrão de

SEMA4G

nesta região. Além disso,

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abriga um SNP, rs4919510, no pb 22 da sua sequência de 25 pb maduro. Este polimorfismo C-G é comum em várias populações. Aqui nós relatamos que o polimorfismo rs4919510 germinal dentro

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está associada a sobrevivência de câncer colorretal, de uma forma específica da corrida.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todos os participantes assinaram termo de consentimento. O protocolo estava em conformidade com a Declaração de Helsinki e aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional do Instituto Nacional do Câncer. O número ética isenção é 11289.

Estudo da População: O NCI-University of Caso Control-Estudo Maryland Colorectal Cancer

A população do estudo consistiu de 691 sujeitos. Incidentes casos de cancro colorectal (n = 245) e controles (n = 446) foram recrutados a partir de 1992-2003 e 1998-2003, respectivamente da maior área de Baltimore, Maryland. Os controles foram acumuladas tanto de um ambiente hospitalar (n = 236) e um ambiente comunitário (n = 210). Os critérios de inclusão e de exclusão foram previamente descritos [20]. Em resumo, os indivíduos foram auto-relatados caucasiana ou afro-americanos nascidos nos Estados Unidos, e foram excluídos se auto-relatou uma história de câncer que não colorectal, HIV, HBV, HCV, ou o uso de drogas intravenosas, foram institucionalizados, ou tinha uma deficiência mental. Informações para determinar o estágio da doença, tratamento e sobrevida foi obtido a partir de registros médicos e relatórios de patologia, Índice de morte de Segurança Social, e Índice Nacional de Morte. estadiamento da doença foi concluída de acordo com o sistema tumor-nódulo-metástase do American Joint Committee on Cancer. O período de sobrevivência foi determinada a partir da data de admissão hospitalar para cirurgia até a data da última pesquisa concluída para as entradas de morte no Índice de morte de Segurança Social (2010). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes, e questionários epidemiológicos, incluindo, história pessoal, história médica familiar, histórico médico, a história do tabaco, informações dietéticas, e as informações sobre ambiente de trabalho, foram administradas a todas as disciplinas. O estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais das instituições participantes.

curvas de sobrevida de Kaplan-Meier que descrevem a relação entre rs4919510 e sobrevivência de câncer colorretal em A) caucasianos (n = 145) e B) afro-americanos (n = 94). indivíduos censurados são indicados com um círculo fechado.

Genotipagem.

O DNA genômico foi isolado de creme leucocitário ou tecido colorectal usando o Kit Qiagen FlexiGene DNA ou o kit de tecido DNAeasy, respectivamente ( Qiagen, Valencia, CA). Casos e controles foram genotipados utilizando o ensaio Taqman (Life Technologies, Carlsbad, CA) para rs4919510 no

mir-608

na Universidade Estadual de Ohio Genotipagem Core. O caso, controle, controles negativos e amostras duplicadas foram distribuídos aleatoriamente por ordem de processamento, com 10% de duplicatas para testar tanto inter e concordância intra-placa. Todas as partes envolvidas no genotipagem foram cegos para o caso, controle, e duplicar o status das amostras. As amostras que falharam ao genótipo foram registrados como indeterminada. Ambos duplicados inter e intra-placa foram 100% concordantes. A taxa de conclusão foi de 98%.

análise de mutação KRAS.

As amostras com tecido tumoral foram enviados para a análise de mutação KRAS em Bioserve (BioServe Biotechnologies, Ltd. Beltsville, MD). O DNA foi extraído usando Trizol ™ de acordo com as instruções do fabricante. Os seguintes mutações foram avaliadas: codão 12 (nucleótidos 1; 0,8%), codão 12 (nucleótidos 2; 20%), codão 13 (nucleótidos 1; 2,3%) e o codão 61 (nucleótidos 3; 0,8%). Os dados deste estudo é representado como normal ou mutante para qualquer uma das mutações descritas acima (26% do total).

Análise Estatística.

As análises estatísticas foram realizadas utilizando STATA 11,0 (College Station, TX). Um valor de p inferior a 0,05 foi utilizado como critério de significância estatística, e todos os testes estatísticos foram em frente e verso. Saídas de Hardy-Weinberg foram determinados utilizando um χ

2 de teste. odds ratio (OR) e seus intervalos de confiança de 95% (IC) foram estimados utilizando um modelo de regressão univariável incondicional logística e um modelo ajustado, que incluiu a idade co-variáveis ​​(contínua) e sexo (categórica). taxas de risco (HR) e IC 95% foram estimados usando um modelo univariável Cox riscos proporcionais regressão e um modelo ajustado para a idade co-variáveis ​​(contínua), sexo (categórica) e estágio da doença (categórica). O tempo de sobrevida foi calculado a partir da data da cirurgia até a data de qualquer Ultimo acompanhamento (última atualização NDI 12/31/2008) ou data de morte por câncer colorretal. Dos 245 pacientes, houve 117 eventos, dos quais 52 estavam em afro-americanos, dos quais 45 estavam em caucasianos. riscos proporcionais premissas foram verificadas por inspecção visual das parcelas log-log e usando um teste de inclinação diferente de zero dos resíduos de Schoenfeld [21] (p = 0,91 para os afro-americanos, p = 0,79 para os brancos). O método de Kaplan e Meier foi utilizado para traçar genótipos e sobrevivência, onde a morte devido a cancro colorectal foi novamente considerado como o ponto final. Estes gráficos foram gerados utilizando SigmaPlot 12.0 (Systat Software, San Jose, CA). Significância foi testada usando o método de Log-Rank. Os testes de tendência linear também foram realizadas, incluindo a variável genótipo no modelo como uma variável ordinal contínua (

P

tendência). Diferenças em genótipos rs4919510 em normal versus tumores KRAS mutantes foram avaliados através do teste exato de Fisher.

Resultados

População do estudo e análise do genótipo miR-608

Foi investigada a relação entre rs4919510 , um SNP na sequência madura de

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, com relação ao resultado de riscos e doenças em 245 casos de câncer colorretal e 446 controles. características da população relevantes estão descritas na Tabela 1. Em geral, os casos não diferem dos controles em termos de idade ou raça; no entanto, a coorte caso continha significativamente mais machos do que cada respectivo grupo de controlo (população, hospital ou total) (Tabela 1). A freqüência do alelo menor [22] do rs4919510 foi significativamente maior em afro-americanos, em comparação com os caucasianos; 40,5% e 17,5%, respectivamente (Tabela 2). Além disso, a freqüência do genótipo GG foi significativamente maior em afro-americanos (15%) em comparação com os caucasianos (3%) controles, de acordo com observações para este SNP em HapMap [23]. Uma vez que as frequências de genótipos rs4919510 não diferiu entre os grupos hospitalares e de controle de população, todas as análises são apresentados usando o grupo de controlo geral (Tabelas 2 e 3). Rs4919510 não se afastou da Hardy-Weinberg proporções em ambos os controles populacionais ou hospitalares.

Não houve associação entre rs4919510 e risco de câncer colorretal

O GG ou CG genótipos de rs4919510 não foram associados com o colorectal o risco de cancro (Tabela 2). Na população total, a freqüência do genótipo GG foi de 8% nos casos e 8% nos controles. Em afro-americanos, o genótipo GG foi representada em 15% dos controles, e 13% dos casos, correspondendo a um OR ajustado de 0,89 (95% CI, 0,41-1,80). Em caucasianos, o genótipo GG estava presente em 3% dos controlos e 5% dos casos, com um OR de 1,76, (IC de 95%, 0,48-6,39). Não há nenhuma associação entre o SNP e estado de mutação KRAS em toda a coorte. Em afro-americanos, era notável que o genótipo GG não foi observado em tumores KRAS mutante, mas a diferença não alcançou significância estatística (Figura S1).

associação entre rs4919510 e sobrevivência do cancro colorectal

Encontramos uma associação significativa entre rs4919510 e sobrevivência do cancro colorectal. Em caucasianos, o genótipo homozigoto variante, GG, foi associada a um aumento significativo no risco de morte por câncer colorretal representado por uma razão univariável risco (HR) de 3,54 (IC 95%, 1,38-9,12), que permaneceu significativa após ajuste para idade, sexo, histologia e estágio em nosso modelo multivariada; HR

GG

vs.

CC 2,95 (95% CI, 1,13-7,71) (Tabela 3) (Figura 1A). O genótipo CG também mostrou uma tendência de pior prognóstico, embora a comparação com o genótipo CC referente não foi estatisticamente significativa (Tabela 3).

Em afro-americanos, observamos uma associação protetora entre o genótipo GG e sobrevivência, embora o modelo se aproximou de significado, tanto no ajustado (HR

GG

vs

CC 0,38 [IC 95%, 0,13-1,13; p = 0,082].) e não-ajustado (HR

GG

CC 0,36 [IC 95%, 0,12-1,07; p = 0,066] em> vs) modelos (Tabela 3) (Figura 1B).. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier graficamente descrevem os efeitos divergentes desta SNP nestas populações (Figura 1). Nenhuma associação de sobrevivência significativas foram encontradas quando rs4919510 foi analisada sem estratificação, ou quando a coorte foi estratificada respectiva de estágio do câncer (Tabela 3 e dados não mostrados).

Discussão

Nossos resultados mostram uma associação entre uma variante da linha germinativa no

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com o prognóstico, mas não de risco, de câncer colorretal. Em caucasianos, foi associado com um risco aumentado de morte por câncer colorretal. No entanto, uma tendência para o efeito oposto foi observado em afro-americanos. Estudos anteriores também demonstraram como corrida podem modular o efeito de um SNP no cancro colorrectal [24]. De notar no entanto, quando a associação foi estatisticamente significativa em caucasianos (n = 145), a associação apenas se aproximou de significado em afro-americanos. Isto poderia sugerir que a relação não é epidemiologicamente relevante, mas, dado o pequeno número de indivíduos no grupo americano Africano (n = 94), talvez seja mais reflexivo do nosso consumo reduzido de energia. Em ambas as populações, o SNP foi associada com a sobrevivência em um modelo recessivo.

Enquanto este manuscrito estava em preparação, Xing

et al.

Publicou um estudo sobre o prognóstico do câncer colorretal em associação com rs4919510 dentro uma população chinesa com 408 pacientes [25]. Eles relataram que o alelo variante (C) estava associado com um risco reduzido de livre de recidiva e sobrevivência global (HR = 0,61, IC 95% = 0,41-0,92), por conseguinte, o alelo G foi associada com resultado negativo. Isto está de acordo geral com os nossos achados em caucasianos. Xing

et al.

Não incluem um braço de controle para examinar associações de risco, embora, como descrito acima, os nossos resultados não suportam um papel para este SNP no cancro colorectal. Estes estudos reforçam a hipótese de que existe uma associação entre rs4919510 e prognóstico do câncer colorretal que podem ser específicas de cada corrida.

Embora no momento não podemos explicar o mecanismo funcional exato através do qual este SNP pode afetar o prognóstico do câncer colorretal, existem várias hipóteses plausíveis. Como mencionado antes, rs4919510 encontra-se dentro da sequência madura de miR-608, e está localizado na junção da haste com a estrutura em gancho canónica. Uma vez que esta estrutura secundária rígida é um requisito para o reconhecimento, e assim o processamento, de precursor de miARN pela RNAse Drosha, é possível que a ruptura da estrutura neste ponto crítico pode afectar o reconhecimento ou o processamento subsequente. Cada miRNA tem centenas de alvos, assim, uma mudança singular no perfil cinético miRNA de uma célula poderia ter um efeito exponencial grande na saída de proteínas, talvez tendo um efeito tão grande que poderia distorcer, mesmo que ligeiramente, prognóstico de uma doença.

uma mudança na sequência madura de um miRNA também poderia, teoricamente, alterar seu repertório alvo uma vez processada [26], [27]. Embora rs4919510 não se encontram dentro da sequência de semente de miR-608, a cinética de hibridação fora desta região têm demonstrado ser importante no reconhecimento do alvo [28]. A importância exata, peso relativo, e subsequente transferência de preferência, devido às variações de sequência de miRNA ainda não foi totalmente elucidado, embora existam exemplos [12]. Uma extensão deste princípio poderia ser aplicado ao SNP em

HSA-mir-608

em relação ao cancro colo-rectal, cujos alvos putativos incluem

BCL-xL

,

SEPT9

e

CDK6

(www.targetscan.org). Na verdade, uma alteração na transcrição a segmentação por miR-608 para qualquer um desses genes podem ter consequências directamente relacionados com a sobrevivência da célula cancerosa.

Curiosamente, Xing

et al.

Também informou que a associação entre o genótipo GG e mau resultado só foi observado nos pacientes que tinham sido tratados com quimioterapia, a maioria dos quais tinha sido em um regime FOLFOX. Curiosamente, o miR-608 está previsto para atingir, pelo menos, duas das enzimas chave envolvidas na activação de 5-FU, a timidina-quinase e folilpoliglutamato-sintase (www.targetscan.org). Além disso, tem havido vários estudos que examinam as taxas de resposta quimioterápicos variantes em carcinoma colorectal por raça. Em um estudo, embora o tempo para progressão da doença não foi afetada pela raça, uma porcentagem significativamente maior dos caucasianos respondeu a um FOLFOX ou regime IROX [29]. Portanto, rs4919510 teoricamente poderia desempenhar um papel nas taxas de resposta diferenciais aos quimioterápicos nas populações.

Além de uma associação funcional putativa com miR-608, desequilíbrio de ligação com SNPs em genes vizinhos não pode ser descartada. De nota, existe significativamente menos ligação previsto para rs4919510 da corrente de 1000 dados de genomas na população americana Africano, onde apenas 7 SNPs em 2 genes originais estão previstas para estar em desequilíbrio de ligação com rs4919510, em oposição a 39 SNPs em 5 genes únicos em caucasianos (www.broadinstitute.org/mpg/snap/ldsearch.php#, r

2 0,8 e distância 500 kb). De particular interesse entre a lista de alelos do gene diferencialmente ligados em caucasianos é leucina zipper supressor de tumor 2 (

LZTS2

), que contém vários SNPs no primeiro intron e 5 ‘UTR previsto para ser fortemente associada com rs4919510. Descobertas recentes a partir de dois estudos separados demonstraram que knockdown de expressão LZTS2 sensibiliza as células para a terapia de paclitaxel para além de antagonizar a proliferação de várias linhas celulares de cancro por sub-regulação de myc e de ciclina D1 através do envolvimento da via NF-kB [30], [ ,,,0],31]. Se o alelo G do rs4919510 está verdadeiramente em ligação com um SNP em

LZTS2

, a expressão deste gene pode ser alterada, contribuindo para o mau prognóstico deste genótipo variante em nossa coorte de cor branca. No entanto, essa hipótese continua a ser investigado.

Em resumo, nosso estudo confirma a hipótese de que um SNP na sequência madura de

HSA-mir-608

pode afetar significativamente o prognóstico do câncer colorretal pacientes. Curiosamente, este efeito desta SNP parece variar de acordo com a raça, como demonstrado pelas nossas descobertas e outros [25]. Embora a associação entre este SNP e sobrevivência do cancro colorectal é notável como demonstrada em três coortes, novos estudos devem ser realizados para confirmar a natureza específica da corrida do efeito do SNP. Além disso, a exploração do papel funcional deste SNP, o mecanismo da sua interacção com 5-FU, bem como o seu potencial envolvimento em outros tipos de câncer se justifica.

Informações de Apoio

Figura S1.

rs4919510 e estado de mutação KRAS. Percentagem de mutações KRAS em rs4919510 CC, amostras de CG e GG em toda a população A), caucasianos B) e Africano americanos C). percentagens exactas mostradas na D). WT denota o tipo selvagem, mut denota mutante

doi:. 10.1371 /journal.pone.0036306.s001

(PDF)

Reconhecimentos

Agradecemos Majda Haznadar e Mike Bekkerman para análise construtiva, feedback e comentários; Glenwood Trivers, Donna Perlmutter, Leoni Leonaridis e Cirurgia e Patologia Departamentos dos Hospitais participantes; Audrey Salabes e John Cottrell por sua contribuição para recrutamento de pacientes; e Karen Yarrick de assistência administrativa.