Abstract

O cancro do pulmão é o segundo câncer mais comum ea principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Apesar dos recentes avanços no desenvolvimento de terapias específicas, os doentes com doença avançada permanecer incurável, principalmente porque os carcinomas do pulmão de células metastáticas não-pequenas (NSCLC), eventualmente, tornar-se resistentes aos inibidores da tirosina cinase (TKI). inibidores de cinase têm o potencial para a promiscuidade alvo porque a quinase super-família é a maior família de genes druggable que se liga a um substrato comum (ATP). Como resultado, muitas vezes TKI desenvolvido para um propósito específico, foram encontrados para agir sobre outros alvos. cromatografia de afinidade droga tem sido usada para mostrar que o dasatinib interage com o receptor de TGF-p de tipo I (TβR-I), uma serina-treonina quinase. Para determinar o potencial relevância biológica desta associação, foram estudados os efeitos combinados de dasatinib e TGF em linhas celulares de cancro do pulmão. Nós descobrimos que o tratamento com dasatinib sozinho teve muito pouco efeito; No entanto, quando as linhas celulares de NSCLC foram tratados com uma combinação de TGF-p e dasatinib, foi induzida a apoptose. O tratamento combinado com TGFp-1 + dasatinib não teve nenhum efeito sobre a actividade de Smad2 ou outros não canónicas TGFp mediadores intracelulares. Curiosamente, combinada TGFp e dasatinib tratamento resultou num aumento transiente em p-Smad3 (observada após 3 horas). Além disso, quando as células NSCLC foram tratadas com esta combinação, o BIM proteína pro-apoptótica foi regulado para cima. Knockdown da expressão de Smad3 usando Smad3 siRNA também resultou numa diminuição da proteína BIM, sugerindo que TGFp-1 + induzida por apoptose dasatinib é mediado pela regulação Smad3 de BIM. Dasatinib só é eficaz em matar células mutantes EGFR, que é mostrado em apenas 10% dos CPNPC. Portanto, a observação de que tipo selvagem cancros do pulmão EGFR pode ser manipulado para torná-las sensíveis ao matando pelo dasatinib poderia ter implicações importantes para a elaboração de estratégias de tratamento inovadoras e potencialmente mais eficazes para esta doença

Citation:. Gordian E, Li J, Pevzner Y, Mediavilla Varela-H, K Luddy, Ohaegbulam K, et al. (2014) fator de crescimento transformador β Sinalização vence a resistência do dasatinib in câncer pulmonar. PLoS ONE 9 (12): e114131. doi: 10.1371 /journal.pone.0114131

editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Março, 2014; Aceito: 03 de outubro de 2014; Publicação: 11 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gordian et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health SPORE Grant P50 CA119997-02-S2. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é o segundo câncer mais comum e responde por cerca de 15% de todos os diagnósticos de câncer. Apesar dos recentes avanços no desenvolvimento de terapias específicas, os doentes com doença avançada permanecer incurável. Devido à diversidade genética dentro de tumores, células com vias de crescimento alternativos ativados eventualmente emergir; assim compreender os mecanismos pelos quais diferentes vias são ligados e desligados é importante na concepção de novas terapias. Embora alguns tipos de câncer são inicialmente muito sensível a tirosina quinase (TKI), a resistência eventualmente se desenvolve. Por exemplo, uma maioria de cancro do pulmão de células não-pequenas metastático (NSCLC) pacientes com mutações de activação de EGFR respondem ao tratamento com erlotinib; no entanto, todos os pacientes em última análise, o progresso. Assim, são urgentemente necessárias terapias alternativas para os pacientes com mutações de EGFR que inicialmente respondem a terapias de TKI de EGFR, mas, eventualmente, desenvolver resistência, bem como para pacientes que apresentam o genótipo de EGFR de tipo selvagem [1]. Esta resistência pode ser em parte devido à complexidade que caracteriza a sinalização de estes tipos de proteínas, bem como a heterogeneidade de adenocarcinomas do pulmão [2]. Dasatinib, um TKI com múltiplos alvos quinase, está sendo testado para tratar diferentes tumores malignos, onde estes objectivos são sobre-expressos, incluindo leucemia mielóide crónica e de mama e câncer de pulmão [3], [4], [5]. Os ensaios clínicos têm testada a eficácia de dasatinib em NSCLC como um único agente [6], em combinação com regimes de quimioterapia utilizados actualmente, tais como o erlotinib inibidor do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) [7], e em pacientes que se tenham tornado resistentes ao erlotinib e gefitinib [8]. Música

et ai

demonstrado que o dasatinib induz apoptose em várias células NSCLC que exibem um fenótipo mutante de EGFR; No entanto, este efeito não foi observado em linhas celulares de NSCLC com um fenótipo de EGFR de tipo selvagem [9].

factor de crescimento transformante β (TGF-p) é uma citoquina envolvida em numerosos processos celulares, incluindo o crescimento, a proliferação, a adesão , migração e apoptose. Além disso, a perda de capacidade de resposta ao TGFp-1 tem sido correlacionada com tumorigenicidade em muitos tipos de cancro diferentes [10]. transdução de sinal TGFp começa com a ligação do ligando ao receptor de TGF-p de tipo II (TβR-II), seguido por recrutamento do receptor de tipo I (TβR-I) e formação de um complexo hetero-oligomérico de TGFp-1, TβR-II, e TβR -I [11]. Após a formação do complexo, o constitutivamente autofosforilado TβR-II fosforila TβR-I, iniciando uma cascata de fosforilação dos substratos a jusante citoplasmáticas, incluindo as proteínas Smad, com a subsequente activação de genes alvo [10]. A conversa cruzada entre a via de TGF e muitas outras vias de transdução de sinal resulta em modificação do sinal de TGF original através de vias não-canônicos e é usado para explicar os múltiplos efeitos do TGF [12], [13], [14]. Nas células epiteliais normais, o TGF-p inibe a proliferação e induz a apoptose de células, actuando assim como um supressor de tumor; No entanto, em muitos tipos de cancro, o TGF-p actua como um promotor de tumores (invasão celular, metástase, regulação imune, e modificação microambiente) [15].

afinidade de Drogas experiências de cromatografia revelou que o dasatinib, originalmente desenvolvido como um inibidor de SRC [16], interage com mais de 40 quinases, incluindo quinases tirosina, quinases de tirosina receptores, quinases serina /treonina e quinases MAP. Uma das cinases de serina /treonina que foi identificada utilizando esta abordagem era o receptor de tipo I TGFp (TβR-I) [17]. A fim de determinar o potencial de relevância biológica desta associação, foram estudados os efeitos combinados de dasatinib e TGF sobre linhas de células NSCLC. Nós descobrimos que o tratamento com dasatinib sozinho teve muito pouco efeito; No entanto, quando as linhas celulares de NSCLC foram tratados com uma combinação de TGF-p e dasatinib, foi induzida a apoptose. Dasatinib só é eficaz em matar células mutantes EGFR [9], que responde por 10% dos CPNPC; portanto, a observação de que os cânceres de pulmão pode ser manipulado para torná-las sensíveis ao matando pelo dasatinib poderia ter implicações importantes para a concepção inovadora e potencialmente mais eficazes estratégias de tratamento para esta doença.

Materiais e Métodos

cultura celular

o adenocarcinoma do pulmão humano NCI H292 e A549 de células linhas foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em meio RPMI-1640 (Thermo Scientific, Waltham, MA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals, Inc, Lawrenceville, GA), 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e glutamina 1 mM. As linhas de células foram mantidas numa incubadora húmida a 37 ° C e 5% de CO

2.

Os anticorpos e compostos

anticorpo anti-Shc1 policlonal foi obtido a partir de Thermo Scientific Pierce (Rockford , IL), e o anticorpo policlonal anti-MADH7 (Smad7) foi adquirido a partir de Abcam Inc. (Cambridge, MA). Anti-HDAC2 foi adquirido a partir da Millipore (Billerica, MA). Os anticorpos seguintes foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA): anti-pSma2 (ligante e fosforilação específica COOH), anti-Smad2, anti-pSmad3, anti-Smad3, anti-pAKT, anti-pERK, anti-BIM, anti-PARP, e anti-GAPDH. Recombinante proteína TGFp-1 humana foi adquirida de R D Systems (Minneapolis, MN) e reconstituído em HCl 4 mM e 1 mg de solução de albumina /mL de soro de bovino. Dasatinib e erlotinib foram obtidos a partir de ChemieTek (Indianapolis, IN) e diluídos em DMSO. LY-364947 foi compra a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). AZD0530 foi obtido a partir AstraZeneca (Londres, Reino Unido)

TβR-I estudos de docking

A estrutura cristalina do TβR-1 no complexo com peptídeo FKBP12 e dorsomorphin (PDB ID: 3H9R). Foi utilizado para coordenadas iniciais [18]. Todos os átomos não pertencentes à proteína foram excluídos manualmente usando Maestro [19] ambiente de modelagem molecular de Schrodinger. A proteína foi preparada usando o protocolo de preparação de proteína de Schrodinger [20]. A fase inicial da preparação de proteína incluídos além dos átomos de hidrogénio atribuição de pedidos de títulos adequados para todos os átomos, seguida pela criação de ligações dissulfureto, a adição de cadeias laterais em falta utilizando software Prime [21], e supressão de todas as moléculas de água. Após a preparação inicial, a estrutura de proteína foi optimizado de modo a reflectir um pH de 7,0 usando PROPKA [22], [23] software seguido por minimização de toda a estrutura até átomos pesados ​​convergiram para desvio de raiz quadrada média de 0,30 Á.

com o uso de Desmond [24], [25] de software, a estrutura da proteína preparada foi solvatado num banho contendo TIP3P [26] moléculas de água e os iões cloreto em uma caixa cúbica, tal que houve um tampão de solvente de 10 a entre a superfície da proteína e o bordo da caixa de solvente. Uma simulação de dinâmica molecular foi, então, realizada sobre o sistema. Usando um padrão de relaxamento e protocolo de aquecimento de Desmond, que aquecido o sistema para 310 K e equilibradas por um tempo química total de 10 ns usando pressão constante e conjunto temperatura. interações de Coulomb interatômicas foram calculados para pares de átomos separados por até 13 A, enquanto a malha de partículas lisa Ewald foi usado para contabilizar as interações além do corte. Análise de trajetória indicaram que o sistema atingiu o equilíbrio em cerca de 4,5 NS de tempo químico. Nove instantâneos do sistema correspondente a 4,613 ns, 6.005 ns, 6.394 ns, 7.123 ns, 7.550 ns, 8.050 ns, 8.789 ns, 9.538 ns, e 10,00 ns foram escolhidos aleatoriamente. Usando script de estrutura média do Maestro, o instantâneo que representa o sistema em 7.123 ns foi escolhido como a estrutura representativa e utilizado nos estudos para conexão de aparelhos subsequentes.

Os ligantes bosutinibe, dasatinib, dorsomorphin, e LY-364947 foram processados ​​com LigPrep [27]. O processamento assegurada Bond ordens apropriadas e, usando o Epik [28], [29] módulo, gerado todos os tautómeros possíveis dos ligandos para reflectir um pH na gama de 5,0 a 9,0. Mapa do site [30], [31] software foi utilizado para sondar a superfície do TβR-1 para possíveis bolsas de ligação. Um total de cinco bolsas de ligação foram identificados; estes foram classificados com base nas características que incluem hidrofobicidade, a exposição a solventes, e o potencial de ligação de hidrogénio. Glide inicial [32], [33] SP (precisão padrão) seguido de XP (precisão adicional) de ancoragem dos quatro compostos foi realizada para os locais de ligação de topo 3. Com base neste acoplamento inicial, um sítio foi escolhido como o local mais provável ligação. Site 1, que se correlaciona com o bolso onde dorsomorphin foi descrito, também foi mais alta classificação por SiteMap.

estudos de docking subsequentes foram realizados utilizando Docking Induzida Fit (IFD) [32], [34] fluxo de trabalho no Maestro. contas de fluxo de trabalho IFD para a flexibilidade do receptor por amostragem orientações das cadeias local dentro da região de ligação mediante encaixe do ligando. Vários conformações ligante são encaixadas na forma e registados com Glide. Cada ligando foi ancorado em Site 1 definido pela melhor pontuação do ligando colocam a partir do encaixe SP inicial no site 1. Para cada ligando IFD marcou e relatou várias conformações (~ 50) proteína-ligante a partir do qual foi calculada a pontuação média IFD.

Proliferação Cytotoxiticy

As células A549 foram semeadas em placas de 96 poços a 5 x 10

3 células por poço, em triplicado. Após 24 horas, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de TGFp-1, dasatinib, ou TGFp + dasatinib combinados. Após uma incubação de 48 horas, a proliferação /citotoxicidade foi medida pela adição de CellTiter 96 One Solution (Promega Corporation, Madison, WI). Depois disso, as células foram deixadas a incubar durante 1 hora, e a absorvância foi medida a 490 nm num leitor de microplacas Biotek EL808 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT). As amostras tratadas foram normalizados para os controlos não tratados, com os resultados indicados em percentagem.

Western blotting

extracção de proteína de célula completa foi realizada por demolição as células em 1X tampão de fosfato salino frio (PBS), seguido de ultra-sons e a lise em 1X tampão CHAPS (Cell Signaling Technology). Para determinar a localização subcelular de proteínas SMADs, as células foram fraccionados em componentes nucleares e citoplasmáticos tal como anteriormente descrito [35]. As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Os lisados ​​de proteínas foram resolvidas por electroforese em dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida gel (SDS-PAGE), transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (Millipore Corporation, Billerica, MA), bloqueadas durante 1 hora em 1X TBST contendo 5% de leite desnatado, e incubadas durante a noite em correspondentes anticorpo primário a 4 ° C. As manchas foram terminou por incubação com anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano e desenvolvido usando Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA).

ensaio Caspase

As células A549 foram semeadas em placas de 96 poços a 5 x 10

3 células por poço. Após 24 horas, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de TGFp-1, dasatinib, ou TGFp + dasatinib combinada, e Jogador celular de 96 poços cinética caspase 3/7 reagente foi adicionado simultaneamente (Essen Bioscience). Os tratamentos foram realizados em triplicado. A incubação foi realizada numa incubadora húmida a 37 ° C e 5% de CO

2 com o sistema IncuCyte imagem de células vivas (Essen Bioscience), o que nos permitiu capturar uma imagem a partir de cada poço através de um cubo objectivo e filtro GFP × 20 em intervalos de tempo de 2 horas para 48 horas. O primeiro e último imagens de cada conjunto de imagens foram extraídas para análise com Definiens Developer versão 1.5 (Definiens Inc., Munique, Alemanha), e caspase foram identificados e segmentado, com um algoritmo autothreshold segmentação 3 células /7-positivos. Esta segmentação foi adicionalmente refinado por tamanho do objecto, e, finalmente, o número de células de caspase 3/7 foi enumerada. Os valores são representados como a média do número de células caspase 3/7-positivos a partir de três experiências independentes.

ciclo celular análise

As células A549 foram semeadas a 3 x 10

5 células por poço em placas de cultura de 6 poços. Após 24 horas, as células foram tratadas com 5 ng /mL de TGF-p-1, 100 nM de dasatinib, ou veículo (DMSO). Após o tratamento, as células flutuantes foram recolhidas e depois combinada com as células aderentes colhidas por tripsinização. As células foram ressuspensas em 1X PBS, fixadas em 2 mL de gelo frio de 70% de etanol, e foram incubadas durante 2 horas a -20 ° C. Os sedimentos celulares foram recolhidos por centrifugação (5000 rpm durante 5 minutos) e ressuspensas em 400 ul de iodeto de propídio (0,6 mM), Triton X-100 (0,1% v /v) e RNAse A (0,2 mg /mL). Após uma incubação de 30 minutos a 37 ° C, foram analisadas as células para o conteúdo de ADN, utilizando um FACS Calibur (BD Bioscience, San Jose, CA), e os dados foram analisados ​​utilizando o software ModFit LT V3.3.11 (Verity Software House, Topsham, ME).

experimentos siRNA

ON TARGETplus INTELIGENTE piscina siRNA contra o

Shc1

,

Smad3

e controle negativo foram adquiridos de Dharmacon (Thermo Scientific) . Cada conjunto foi reconstituído em tampão 1X siRNA (Dharmacon) e diluiu-se em água tratada com DEPC a uma concentração final de 20 uM. As transfecções transientes foram efectuadas utilizando Lipofectamina RNAiMax (Invitrogen, Grand Island, NY). Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 6 poços e foram transfectadas, após 24 horas a 60-70% de confluência. A lipofectamina RNAiMAX, OptiMEM (Invitrogen), e 200 pmol de mistura de siRNA foram incubadas durante 20 minutos à temperatura ambiente e adicionou-se as células incubadas em meio isento de soro. Após incubação a 37 ° C durante 4 horas, o meio foi removido. As células foram então lavadas uma vez em PBS 1X, e o composto contendo o meio foi adicionado às células. As células foram colhidas 48 horas após a transfecção para a preparação de extração de proteínas.

Resultados

TβR-I estudos de docking

Experimentos utilizando cromatografia de afinidade da droga para identificar moléculas que interagem diretamente com dasatinib foram identificadas mais de 40 quinases, incluindo quinases tirosina, quinases de tirosina receptores, quinases serina /treonina e quinases MAP. Uma das serina /treonina quinases identificadas utilizando esta abordagem é TβR-I [17]. TβR-I tem um domínio N-terminal rico em cisteína envolvido na ligação ao ligando, de uma única hélice transmembranar, uma região justamembranar citoplasmática reguladora, e um domínio de serina-treonina cinase de terminal-C [36]. Para examinar a ligação do dasatinib às TβR-I, foram realizados estudos de acoplamento utilizando a estrutura cristalina previamente relatado do domínio citoplasmático TβR-I [18]. Como descrito em Materiais e Métodos, o local designado como Site 1 foi escolhida como o local mais provável de ligação. Nos nossos estudos, comparou-se a ligação do dasatinib, bosutinibe (estruturalmente relacionadas ao dasatinib), LY-364947 (TβR-cinase I disponível comercialmente de inibidor [37]), e dorsomorphin (originalmente utilizado nos estudos de cristalização TβR-I). Cada ligando foi ancorado em Site 1 definido pela melhor pontuação do ligando colocam a partir do encaixe padrão inicial de precisão no local 1. Para cada ligando, Induzida Docking Fit (IFD) foi marcado, com múltiplas (-50) conformações da proteína-ligando relatado a partir do qual a pontuação média IFD foi calculada (Fig. 1C). Nossos resultados de encaixe dos quatro ligantes de interesse mostrou que dasatinib obteve a maior pontuação. protocolo IFD informou que TβR-I -dasatinib formado o melhor complexo de pontuação (escore IFD de aproximadamente -14.742 kcal /mol), bem como pontuaram melhor em média (pontuação IFD de aproximadamente -14.694 kcal /mol) ao longo de todos os complexos relatados. A melhor complexo TβR-I-dorsomorphin teve uma pontuação IFD de cerca de -14.519 kcal /mol com a média de -14.469 kcal /mol. Bosutinibe e LY-364947 realizada a mais pobre, com melhores complexos proteína-ligando conseguir a aproximadamente -14.353 kcal /mol e -14154 kcal /mol, respectivamente, e fazendo a média -14.313 kcal /mol e -14119 kcal /mol. Análise de topo pose da produzida pelo modelo de acoplamento flexível revela que a interacção do bosutinibe com o local de ligação envolve quatro ligações de hidrogénio com os resíduos de Pro-439, Thr-378, Asn-341 e Tir-219 a distâncias de 2.4, 2.18, 2.37 e 2.25 Â e com os respectivos ângulos de 120,7, 144,8, 154,1 e 151,6 graus (Fig. 1A). Por outro lado, o dasatinib forma três ligações de hidrogénio com Arg-218, Asn-341 e A-284 em distâncias de 1,97, 2,00 e 2,32 Å e ângulos de 145,9, 150,3 e 139,7 graus (Fig. 1B).

Ligand diagrama de interacção de (A) bosutinibe e (B) encaixado em dasatinib TβR-1. Ligando está representada a preto. As ligações de hidrogênio são rotulados por números próximos ao vínculo. Distâncias e ângulos de cada ligação de hidrogênio como marcadas no diagrama são dados em tabelas dentro de cada figura. (C) Site 1 resultados IFD. Média (preto) e melhor (branco) pontuações IFD dos quatro compostos que atracam no local 1 com base em -50 poses reportados para cada composto. IFDScore é multiplicado por -1 para clareza da apresentação.

Dasatinib afeta a resposta a TGF-1 em linhas celulares de NSCLC

Para determinar o potencial relevância biológica da associação entre dasatinib e TβR-I, células de cancro do pulmão A549 cultivadas em meio completo contendo TGFp-1 foram incubadas na presença ou ausência de diferentes concentrações de dasatinib, tal como descrito antes [9]. tratamento individual com a proliferação de TGFp-1 ou dasatinib celular inibido (45% e 34%, respectivamente; a Fig. 2A, asteriscos). Curiosamente, esta inibição da proliferação aumentada quando as células foram tratadas com uma combinação de TGFp-1 e dasatinib (75% de inibição; a Fig. 2A, dois asteriscos). O aumento da inibição da proliferação foi dependente da dose de dasatinib. Resultados semelhantes foram obtidos quando a viabilidade celular foi usada para determinar o número de células (S1 figura). Para entender melhor a inibição observada da proliferação celular, examinou-se o efeito deste tratamento combinado sobre a progressão do ciclo celular. Após 48 horas de tratamento com TGFp-1 e dasatinib, o aumento das células em G1 não foi significativamente diferente de quando as células foram tratadas com TGFp-1 por si só (Fig. 2B, linha sólida). Da mesma forma, com o duplo tratamento, houve um aumento do número de células em G2 /M, após o TGFp-1 de tratamento, mas o aumento de células não era diferente de quando as células foram tratadas só com dasatinib (Fig. 2B, linha a tracejado) . Portanto, a redução no número de células após o tratamento combinado TGFp-dasatinib não pode ser explicado por alterações no ciclo celular.

células A549 (A) foram tratados com DMSO, diferentes concentrações de TGF-p-1 (0-10 ng /mL; barras brancas), diferentes concentrações de dasatinib (0-400 nM; barras pretas), ou uma combinação de TGF-1 e dasatinib (tracejado bares) durante 48 horas. O tratamento de células com ambos os agentes resultou no aumento da inibição (**), em comparação com quando as células foram tratadas com qualquer agente sozinho (*). (B) As células A549 foram tratadas com DMSO, 5 ng /ml de TGFp-1, 100 nM de dasatinib, ou uma combinação de 5 ng /ml de TGFp-1 e 100 nM de dasatinib durante 48 horas. Após 48 horas, as células coradas foram analisadas iodeto de propídio para determinar a distribuição do ciclo celular e analisados ​​como descrito em Materiais e Métodos.

O aumento da apoptose em células tratadas com TGFp em combinação com dasatinib

TGFp tem sido implicada nas respostas pró-apoptóticos, bem como as respostas anti-apoptóticos [38]; portanto, nós examinamos se a inibição da proliferação observada após combinada TGFp + dasatinib em células A549 foi o resultado da morte celular por apoptose. A apoptose foi medida por poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) clivagem após o tratamento com a combinação de TGF-dasatinib. Dasatinib ou TGFp-1 por si só não induz a apoptose tal como medido por clivagem de PARP (Fig. 3A). Isto está de acordo com o que foi relatado antes, em que o tratamento de células A549 com dasatinib não resultou em apoptose [4]. Em contraste, a combinação de TGF-p + dasatinib resultou em apoptose, específico para o co-tratamento com dasatinib, tal como a incubação com um inibidor de EGFR (erlotinib) ou outro inibidor SRC (AZD0530) não resultou em clivagem de PARP (Fig. 3A). Para avaliar se é necessária

de novo a síntese da proteína de TGF-p + apoptose induzida por dasatinib, células A549 foram pré-tratadas com 10 ug /ml de cicloheximida durante 1 hora, seguido de TGFp-1 ou sem tratamento com dasatinib. Como mostrado na Fig. 3B, a adição de ciclo-heximida não inibiu o aumento da apoptose, sugerindo que

Novo

síntese de proteína não é necessária. Foi examinado o efeito do tratamento de combinação em 15 linhas de células NSCLC (13 EGFR WT e 2 EGFR MU) e encontraram um aumento de clivagem PARP em 5 deles quando tratados com a combinação TGF + tratamento dasatinib (S2 Figura).

células A549 (a) foram tratadas com 100 nM de dasatinib, 1,000 nM de AZD0530 ou erlotinib com ou sem 5 ng /ml de TGFp-1 durante 48 horas. (B) As células A549 foram pré-tratadas com 10 ug /ml de ciclo-heximida (CHX) durante 1 hora, seguido de TGFp-1 mais ou menos dasatinib. Após a incubação, as células foram recolhidas, lisadas, e a clivagem de PARP detectado por análise de Western blot. (C) As células A549 foram semeadas em placas de 96 poços a 5 x 10

3 por poço.

C

varas foram tratados e celular do jogador de 96 Bem Kinetic Caspase 3/7 Reagente foi adicionado simultaneamente. Os tratamentos foram realizados em triplicado. Os valores estão apresentados como o número médio de células positivas para caspase 3/7 a partir de 3 experiências independentes.

Para confirmar a apoptose induzida por dasatinib TGFp +, foi utilizado um ensaio de caspase-3/7 (Incucyte) para medir simultaneamente a morte celular e caspase 3/7 atividade. Como mostrado na Fig. 3C, o tratamento de combinação de dasatinib TGFp + resultou em um aumento significativo (92%) no número de células que sofrem apoptose quando em comparação com qualquer dos tratamentos por si só (22% e 19%, respectivamente). Além disso, a combinação de TGF-dasatinib resultou na perda de potencial eléctrico mitocondrial e libertação de citocromo c das mitocôndrias (dados não mostrados), sugerindo que a apoptose observada é o resultado de activação de intrínseca (mitocondrial) vias apoptóticas.

efeito de TGFp-1-dasatinib sobre a actividade de TGF-p mediadores intracelulares

TGFp tem sido mostrado que estimula a várias vias de sinalização intracelular, incluindo a via Smad (via canonical) e outros mediadores intracelulares, incluindo p38 mitogen-activated proteína quinase (MAPK), AKT e ERK (vias não-canônicos) [39]. Portanto, o próximo examinado se o tratamento com TGFp-dasatinib activado por estas vias, utilizando anticorpos que detectam a forma fosforilada (activada) de mediadores de ambos os percursos canónicos e não canónicas. Como mostrado na Fig. 4, a expressão de Smad2 activado ou Smad3 não foi observada em extractos de células inteiras, quer de células não tratadas ou tratadas com dasatinib, mas foi observada após a TGFp-1 ou de tratamento após o tratamento com TGF-p + dasatinib. Curiosamente, níveis de Smad3 fosforilada após o tratamento com TGFp-dasatinib são mais elevados do que os níveis observados com TGFp-1 de tratamento sozinho. O aumento da p-Smad3 visto após 1 hora de tratamento da combinação TGF-dasatinib em activação Smad3 é transitória, uma vez que não pode ser vista 48 horas após o tratamento (dados não mostrados). Isto está em contraste com a fosforilação de Smad2, que pode ser observada a partir de 5 minutos e mantém-se fosforilada até 48 horas. Isto pode ser devido à meia-vida consideravelmente mais curto de Smad3 (4,7 horas) em comparação com Smad2 (12,5 horas) [40]. Pré-tratamento com o inibidor I-TβR LY364947, blocos de Smad2 fosforilação na presença ou ausência de dasatinib (Fig. 4B). Como esperado, SRC fosforilação é inibida na presença de dasatinib, e incubação com TGFp-1 não afecta esta inibição.

células NSCLC A549 foram tratadas com DMSO, 5 ng /ml de TGFp-1, 100 nM de dasatinib , ou uma combinação de 5 ng /ml de TGFp-1 e 100 nM de dasatinib para diferentes períodos de tempo (1 hora para a detecção de pSMAD2 e pSmad3, e 48 horas para a detecção de pSrc). Após a incubação, os lisados ​​celulares totais foram recolhidas e submetidas a transferência de Western com os anticorpos indicados.

localização e actividade das proteínas SMADs são dependentes do estado de fosforilação na COOH e regiões ligantes [41]. Para determinar se o aumento observado na apoptose com o tratamento de combinação é devido a alterações na localização dos Smads, examinámos o efeito do tratamento combinado TGFp-dasatinib na localização dos Smads activas. Após 48 horas de TGFp-1 ou a combinação de tratamento de TGFp-dasatinib, os extractos celulares foram fraccionados e as Smads fosforilados foram examinados em cada fracção. Como mostrado na Fig. 5A, o Smad2 fosforilada no carboxi (p-Smad2 COOH) aumenta predominantemente no núcleo. O Smad2 fosforilada na região de ligante (p-Smad2 Linker) também aumenta após o tratamento com TGFp-1, mas uma maior quantidade permanece no citoplasma. Curiosamente, a quantidade de Smad3 fosforilada após TGFp-1 tratamento também se acumula no núcleo, independentemente do tratamento de dasatinib (Fig. 5B).

células A549 foram tratadas com DMSO, 5 ng /ml de TGFp-1, 100 dasatinib nM, ou uma combinação de 5 ng /ml de TGFp-1 e 100 nM de dasatinib durante 48 horas. Após o tratamento, os lisados ​​celulares foram recolhidos e as fracções nuclear e citoplasmática foram separados como descrito anteriormente [35]. Após o fraccionamento, lisados ​​foram submetidos a Western blot com os anticorpos indicados.

O tratamento com a combinação de TGF-dasatinib não teve um efeito significativo sobre a ERK não-canônico da via TGF mediadores intracelulares, AKT, ou p38 (S3 Figura). Além disso, o tratamento com TGFp-1 não resultou em um aumento na activação de Shc em células A549, conforme relatado anteriormente por outros tipos de células [42], [43], e knockdown da expressão de SHCA usando SHCA siRNA não têm um efeito na apoptose em SHCA-negativo células A549 (dados não mostrados), sugerindo que esta via não está envolvida na apoptose induzida observada com o tratamento com TGFp-dasatinib.

apoptose TGFp-1-dasatinib é mediada por Smad3- induzida BIM

Smad3 foi reportado para sensibilizar células aos efeitos apoptóticos de TGF [40], e um dos mecanismos sugeridos é a indução da expressão da proteína pro-apoptótica BIM (Bcl-2 que interage mediadora da morte celular) [44]. Como mostrado na Fig. 6A, às 24 horas após tratamento de combinação, foi observado um aumento na expressão da proteína do BIM de isoformas elevado peso molecular e do BIM molecular e mais citotóxico inferior. Foi recentemente relatado que um BIM polimorfismos de deleção (resultando numa isoforma BIM sem o domínio BH3) estão envolvidos na resistência a tirosina quinase em vários tipos de cancro [45], [46]. Triagem de todas as linhas 15 celulares utilizando iniciadores descritos na literatura [45], não foram capazes de detectar a isoforma BIM em qualquer uma das nossas linhas celulares (S5 Figura). No entanto, knockdown da expressão de Smad3 usando Smad3 siRNA resultou num decréscimo na quantidade de BIM após tratamento de combinação, indicando que a expressão de Smad3 é necessário para o aumento da expressão de BIM (Fig. 6B). Tem sido relatado que a expressão de Smad7 previne a apoptose através da inibição da expressão do BIM [47]. Como pode ser visto na Fig. 6A com o tratamento TGF-dasatinib que resultou na clivagem PARP, observamos reduzida expressão de Smad7. Esta diminuição de Smad7 sugere um mecanismo para manter a via de TGF-p activo. Os nossos dados sugerem que o tratamento de combinação de TGF-p e dasatinib induz apoptose por aumentar a activação de TGF-p BIM e sub-regulação de sinais inibidores da via de TGF-p, tais como Smad7.

(A) As células A549 foram tratadas com DMSO, 5 ng /ml de TGFp-1, 100 nM de dasatinib, ou uma combinação de 5 ng /ml de TGFp-1 e 100 nM de dasatinib durante 48 horas. Após o tratamento, os lisados ​​celulares totais foram recolhidas e submetidas a transferência de Western com os anticorpos indicados. (B) siRNA contra Smad3 e controle negativo foram transfectados em células A549. Após 4 horas de incubação, as células foram lavadas e meios que contêm os compostos foram adicionados a cada poço. As células foram colhidas 48 horas após a transfecção para a preparação de extracção de proteína e a análise Western blot.