Abstract

andrógeno (AR) variantes estão associadas com resistência à terapia anti andrógeno tanto em linhas de células humanas de câncer de próstata e clínica amostras. Estas observações sustentam a hipótese de que a acumulação de AR isoforma é uma consequência da pressão terapêutica selectiva sobre o AR comprimento completo. O modelo de cancro da próstata deficiente Pten prossegue com cinética bem definidas, incluindo a progressão para o câncer de próstata resistente à castração (CRPC). Enquanto cirúrgicos de castração e enzalutamida tratamentos deu uma resposta terapêutica inicial,

Pten

– /-

epitélios continuam a proliferar rendimento patologia tumor primário localmente invasivo. Que permanece mais epitélio AR positiva, mas independente do ligando, sugere a presença de variantes de AR oncogénicos. Para abordar esta hipótese, utilizou-se um painel de recentemente descrita

Pten

– /- linhas de células tumorais

derivada tanto da hormona intacta (E4, E8) e castrados mutantes PTEN (EC1, EC2) seguido por RACE PCR para identificar e caracterizar três novos truncados, no terminal amino contendo variantes AR (Mar-Va, b, c). Variantes aparecem não só conservadas ao longo da evolução, mas estão correlacionados com a perda quase completa da AR comprimento total (AR-FL) nos níveis de castração de andrógenos. A sobre-expressão de variantes leva a atividade transcricional melhorada do AR, enquanto derrubar estudos mostram a saída da transcrição reduzida. Colectivamente, a identificação de variantes de AR truncadas no modelo de supressão de PTEN condicional suporta um papel para a manutenção do fenótipo CRPC e fornece mais aplicações terapêuticas da presente modelo pré-clínico

citação:. Liang H, Adisetiyo H, Liu X, Liu R, Gill P, Roy-Burman P, et al. (2015) Identificação do receptor andrógeno variantes de processamento no modelo de cancro da próstata Murino Pten deficiente. PLoS ONE 10 (7): e0131232. doi: 10.1371 /journal.pone.0131232

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 01 de abril de 2015; Aceito: 29 de maio de 2015; Publicação: 21 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Liang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seu arquivo de Informações de Suporte

Financiamento:.. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder RO1CA059705 para PR, o Investigador Award e Icahn Escola PCF Jovem de fundos de pesquisa Cancer Medicine adjudicados a DJM

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

células cancerosas da próstata têm sido propostos para avançar para a resistência a castração através de uma multidão de receptor de andrógeno (AR) modificações Introdução

. incluindo a amplificação, rearranjos de genes ou mutações, expressão alterada de co-reguladores da transcrição e

de novo

esteroidogênese [1-6]. Mais recentemente, estudos com linhas celulares de cancro da próstata humano e tecidos identificaram a presença de variantes de splicing de AR (AR-VS) que podem ser regulados positivamente em resposta a castração e promovem a resistência à terapêutica hormonal do receptor alvo [7-9] [10 ] [11]. O receptor de androgénio pertence ao receptor de esteróides factor de transcrição da família e é composta de um domínio de activação transcricional do terminal N (DTN, exon1), domínio de ligação a DNA (DBD, do exão 2 e 3), uma região de charneira (exão 4), e o domínio C-terminal de ligação do ligando (LBD, o exão 4-8) [12,13]. Até à data, até 15 diferentes AR-Vs sem diferentes porções de LBD foram relatados em linhas celulares de cancro da próstata humana CWR-R1, 22rv1, VCaP e LuCaP xenoenxertos [14-21]. Apesar disso, as isoformas AR permanecem muito pouco estudada em modelos de ratos pré-clínicos de tecidos de cancro da próstata a ser limitada a dois Ar-Vs como relatado utilizando a linha celular Myc-CAP [15]. Até o momento, não há variantes AR têm sido relatados a partir do principal órgão de um rato modelo pré-clínico de câncer de próstata.

O

Pten

modelo de mouse null do câncer de próstata é pouco responsiva à terapia de ablação do andrógeno incluindo cirúrgico receptor de androgénio e castração terapia-alvo [22] [23] [24]. Enquanto PI3K elevado de sinalização /Akt foi mostrado para fornecer pistas de sobrevivência significativas em condições castrados, a maioria dos epitélios permanecem andrógeno receptor positivo. Esta observação levanta a possibilidade de que o ligando de formas independentes do receptor de androgénio podem existir facilitar a sobrevivência e progressão continuada. Temos tido uma abordagem multifacetada para abordar esta hipótese, incluindo a caracterização e aplicação de vários novela, deficientes, linhas celulares de cancro da próstata murinos PTEN [25] [26] e modelo tumor primário correspondente.

Nós identificamos três novas variantes do receptor de androgénio (denominado MAR-Va, b, c). Estas variantes contêm AR AR-NTD com apenas uma contendo uma sobreposição de sequência parcial com o AR-LBD. A expressão relativa destas variantes não aumenta apenas em resposta à castração, mas em resposta a AR terapia-alvo incluindo Casodex e enzalutamida. Surpreendentemente, após a progressão a longo prazo dos níveis de andrógenos castração, observou-se uma redução significativa na AR comprimento total, mas a manutenção das isoformas identificadas. Estudos funcionais revelou que a superexpressão ou derrubar de AR-Va e AR-Vc poderia regular AR saída da transcrição.

Em conjunto, nossos dados suportam a presença de novas variantes AR que podem servir como contribuintes importantes durante a progressão para CRPC. identificação variante também aumenta significativamente a utilidade do modelo de cancro da próstata nula PTEN tanto em termos de compreensão da função de RA e como um sistema para avaliar terapias enfocadas formas resistentes do receptor de andrógeno.

Resultados

a identificação de novas variantes AR em linhas celulares derivadas do modelo de câncer de próstata nula Pten

Como parte de nossos estudos de receptor de andrógeno função (AR) e mecanismos de progressão CRPC, caracterizamos recentemente quatro novos de câncer de próstata murino linhas celulares derivadas de qualquer hormona intacta (E4, E8) ou castrados (EC1, EC2)

ratinhos mutantes nulos PTEN

. As linhas celulares foram caracterizados como sendo

Pten

– /- PI3K

, ter activado /Akt sinalização e características do modelo de tumor primário [25] [26]. Para ensaiar para a presença do receptor de androgénio (AR) variantes, aplicou-se RACE 3 ‘de ADNc gerados a partir das linhas E8 e CE1 utilizando os iniciadores para a frente dentro do ancorados exon1 de AR rato (Tabela S1). Usando essa abordagem imparcial, nós amplificado AR mRNAs com caudas poli (A) incluindo os AR-Vs com potenciais novas sequências 3 ‘. Seguindo com PCR, observamos vários produtos sequência única (Fig 1a, S1 Fig). Como antecipado, o (~ 2 kb) banda maior foi o AR de comprimento completo (FL-AR), contendo sequências a montante da região poli (A), que correspondeu com o 3 ‘UTR de AR rato (MAR) do mRNA. Clonagem e sequência de análises dos ~ 850 produtos bp PCR indicaram a existência de várias rato original AR-Vs (Mar-Vs) em células E8 e CE1. Estamos focados em três transcrições originais. Em primeiro lugar, uma isoforma curta AR encontrado na linha E8, retendo os exões 1-4 de ARNm Mar, seguido por uma sequência de 175 pb exclusivo encontrado para alinhar a região do intrão adjacente a AR para o exão 4 que denominado o exão 4a (m4a) ou variante AR-Va (Figura 1A e 1B). A estrutura molecular AR-Va é análogo aos exões de retenção de 5’1-4, mas que diferem nas composições de 3’-sequências de rato previamente descrito MAR-V4 [15] e ARV humano

567es [27]. Em seguida, duas novas AR-Vs com os locais de splicing alternativo potencialmente únicos foram detectados em células CE1. Ao mapear as suas sequências do genoma do rato, verificou-se que as sequências 442 pb e 495 pb corresponde a intron 1 e emendados exão 1, que se refere a variantes M1b e M1C. Para evitar possíveis confusões com a nomenclatura de ARVs reportados em modelos de câncer de próstata humanas, nós nomeamos estas variantes de três novel AR como mouse AR-Va, b, c (Mar-Va, b, c), dos quais Mar-Va foi identificado pela primeira vez em E8, com mar-Vb e Mar-Vc em CE1 (S1 Fig). Usando as linhas celulares acima foram determinados os níveis de expressão relativa de cada variante. Curiosamente, a expressão Mar-Va foi mais elevada nas linhas E4 e E8, enquanto Mar-Vb e Mar-Vc mostrou maior expressão nas linhas CE1 e CE2. Todas as variantes foram significativamente menores do que na expressão do AR-FL (Fig S2).

a) Identificação de variantes de Mar (a, b, c) em linhas celulares derivadas visualizada usando PCR convencional. b) avaliação em tempo real de PCR de AR variantes amplificado a partir de cDNA de células E8 visualizados por electroforese em gel. C, esquerda) Detecção de isoformas de AR em linhas celulares de cancro da próstata de rato e humanos e C, à direita) análise de densitometria da variante e a expressão da proteína AR-FL normalizado para p-actina (*, P 0,05). d) Estrutura esquemática de Mar variantes (a, b, c) e AR comprimento completo (FL-AR). caixas de cor sólida representam os exons comuns de AR-FL e incubados cassetes indicar os exons enigmáticas. linhas retas em negrito referem-se às sequências transcritas em seus mRNAs. A sequência de aminoácidos prevista traduzido por m4a e M1C é listado (diagramas menores).

Usando Ape software editor de plasmídeo, fomos capazes de deduzir os pesos moleculares de Mar-Va como ~ 80 kDa e Mar- Vb, Vc ser ~ 54 e 56 kDa correspondendo a nossas transcrições identificados (Fig 1d, S2 Mesa, S3 Tabela). Para verificar se AR-Vs pode ser detectada ao nível da proteína foi utilizado um anticorpo como alvo o terminal animo da AR (Santa Cruz, N-20) e examinadas lisados ​​da E8, CE1 e derivados de androgénio castrados (E8-CSS, CE1 -CSS). Avaliada em conjunto com as linhas humanos, LNCaP e PC3, detectamos a AR-FL (~ 110 kDa) e três bandas principais que residem em ~ 75 kD, 85kD e espécies inferiores a ~ 50 kD e ~ 56 kD (1c Fig, S2 tabela).

andrógeno ablação aumenta a expressão relativa da AR variantes

para apoiar ainda mais um papel para as variantes AR durante CRPC, consideramos o impacto do tratamento anti-andrógeno. Para fazer isso, nós desafiamos as linhagens de células E8 e CE2, quer com castrar condições de cultura de andrógenos (soro despojado carvão, CSS) ou Casodex (10? M) durante 3 dias. Surpreendentemente, em condições de cultura CSS observamos aumento da expressão transcrição em todas as três variantes com o maior aumento vezes observada em Mar-Va em células E8 (Mar-Va, 3,5 vezes, Mar-VB, 2,5 vezes, Mar-Vc 2,2 vezes, p 0,05) quando normalizado para AR comprimento completo (Fig 2a). Usando Casodex, também observamos um aumento estatisticamente significativo de tudo AR variantes usando as linhas E8 e CE2 (Fig 2B).

a) Cultura de câncer de próstata murino (E8) linhagens de células com tratamento anti andrógeno incluindo carvão despojado resulta na expressão significativamente aumentada de AR soro (CSS) (3 dias) ou b) Casodex (10? M, 3 dias) para as isoformas normalizada AR comprimento completo. c) A castração cirúrgica de mutantes PTEN (

C

+

; Pten

L /L

, n = 7) resulta em um aumento significativo na expressão relativa das isoformas de Ar tal como detectado através de western blotting. d) expressão variante AR transcrição da

Peso

, ratos mutantes inteiros e castrados hormonais normalizados para níveis AR-FL (*, p 0,05; ** p . 0,01)

em seguida, considerou se isoformas AR existia

in vivo

usando hormônio tumores PTEN nulo intactas (

C

+

; Pten

L /L

; n = 6) e se a progressão nos níveis de andrógenos de castração poderia alterar a sua expressão. Usando lóbulos ressecados da próstata (ventral dorsal lateral, anterior) foi avaliada a expressão de ARs na hormona mutantes intactas em 2, 13 e 23 meses e detectada a presença de AR-FL (~ 110 kD) e três variantes principais de tamanho reduzido de, aproximadamente, 45-50, 64 e 75 kD (figura 2c). Dos 6 mutantes analisados, observou-se apenas um na coorte de 13 meses com expressão reduzida AR-FL (*, estrela). Surpreendentemente, em mutantes PTEN que foram castrados cirurgicamente (

C

+

; Pten

L /L

; n = 7) observou-se 6/7 a ter perda significativa de AR-FL, mas manteve a expressão de isoformas AR (Fig 2c, à direita). RNA quantitativa (q-PCR) de medição de Mar-Va, b e c confirmou a elevação das isoformas da hormona cancros deficientes intactas e CRPC PTEN em relação ao

Wt

próstatas e normalizado para AR-FL (2d Fig ) (**, P 0,01). Para associar ainda mais a presença da truncada AR-Vs com a progressão resistentes a castração, nós tratados PTEN hormonais mutantes intactas (

C

+

; Pten

L /L

, n = 6) com enzalutamida (10 mg /kg,

via

ração do mouse

ad libitum

) durante 10 semanas, seguido de anticorpos imuno-histoquímica usando contra ou o terminal amino AR (AR, N-20) ou C-terminal de AR (AR, C-19). Consistente com a análise bioquímica, observou-se muito baixa detecção de AR de corpo inteiro, mas coloração robusta para amino, contendo variantes (S3 Fig). Estas observações indicam que a progressão nos níveis de andrógenos castração pode selecionar contra a AR corpo inteiro, mas não AR variantes.

A atividade transcricional do receptor andrógeno comprimento total é potenciado pela AR variantes

O

a análise in vivo

sugere que a expressão relativa das isoformas de AR pode persistir durante CRPC e nos levou a examinar as implicações de um aumento relativo da expressão de Mar-Vs no cancro da próstata deficiente Pten. Para isso, foi realizada uma série de ensaios de transcrição usando o repórter plasmídeo PSA-luciferase [28]. Em primeiro lugar, cada variante e AR-FL foram sub clonados em construções de expressão, seguido de validação de expressão utilizando transferência de Western e o anticorpo AR (N-20) (Fig 3a).

a) transferência de Western utilizando o AR ( N-20, anticorpo) confirma a expressão de variantes de AR clonados em células COS-1. b) A superexpressão da AR variantes em células E8 tratados com controle, DHT (0,03, 0,3 nM) ou DHT + Casodex (BIC, 1? M). (Controle

vs o mundo Mar-Va = comparações 1-4;.. Controle

vs o mundo Mar-Vc = comparações 5-6) (*, p 0,05, ** p 0,01 ). c) Co-imunoprecipita�es de células COS-1 transfectadas com AR-FL e quer AR-Va-myc (meio) ou AR-Vc-myc (direita).

Nós encontramos células controle E8 para ser responsivo a DHT de um modo dependente da dose (0,03-0,3 nM) (Figura 3b), enquanto que as células não foram CE1 responsivo a DHT a menos de rato exógeno AR-FL foi introduzido através de transfecção (fig S4). A seguir, sobre-expressos MARVA, b, c ou em células E8 e CE1 e observou-se que a isoforma MAR-Va significativamente o aumento da actividade de transcrição repórter comparação para controlar as transfecções de plasmídeos (comparações gráfico de barras 1-4, *, P 0,05, ** , p 0,01). Curiosamente, Mar-Vc transfecção aumentada níveis repórter apenas na presença de andrógenos (comparações 5-6; *, p 0,05), enquanto Mar-VB teve um efeito estatisticamente insignificante (p 0,05). (Fig 3b)

para entender um mecanismo potencial pelo qual MAR-Vs ativar a função de AR-FL, foi realizada co-imunoprecipita�es ensaio da variante à interação AR-FL. Os plasmídeos que codificam marcada com myc MAR-Va e Vc-Mar foram gerados para este ensaio baseado na descoberta de que estas duas ARV poderiam co-activate AR-FL em uma ou mais das linhas de células testadas. células AR negativos, COS-1 foram transfectadas com AR rato sozinho (+ vector vazio) ou em combinação com Mar-Va-myc (Va-myc) ou Mar-Vc-myc (Vc-myc) construções de expressão seguido de imunoprecipita�es para Mar proteínas -Va /VC usando o epitopo myc. As análises de Western blot foram em seguida conduzidas utilizando um anticorpo específico para o C-terminal de AR que só reconhece AR-FL. Nós encontramos o kDa banda AR-FL 110 para estar presente nos imunoprecipitados Va-myc, indicando que Mar-Va poderia formar um complexo com AR-FL. No entanto, uma vez que uma banda significativa AR-FL não foi detectada nos imunoprecipitados VC-myc, inferiu-se que a complexação estável foi menos eficiente ou não formado entre a RA-FL e AR-vc-uma observação que é consistente com uma redução significativa AR-Vb e AR-vc mediada co-activação do repórter PSA (Fig 3C). Estes dados sugerem que a expressão aumentada de Mar-Vs pode aumentar a estabilidade da AR-FL aumentando assim andrógeno dependente saída de ensaio de repórter. Estas observações também são semelhantes aos obtidos com AR humano-V5, 6, 7ES [27].

então considerados os efeitos da inibição da variante sobre o PSA saída repórter transcricional. Para fazer isso nós projetamos siRNAs de substrato dicer (DsiRNAs) que visam especificamente as Mar-Va ou c, mas não completa AR comprimento. Através de transfecção destes ARNic em células E8 ou CE1, juntamente com os plasmídeos repórter da luciferase, foi observado que tanto knockdown de Mar-Va e Vc reduzida actividade de transcrição de AR em ambas as linhas celulares (Fig 4A). siRNAs variantes eram igualmente potentes em células E8 enquanto que em células CE1, knockdown de Mar-vc produziu o efeito mais robusta (dados não mostrados). A eficiência da variante derrubar é exemplificado por medição q-PCR dos níveis de Mar-VC no controle e Mar-Vc-siRNA trataram células E8 (Fig 4b).

a) as células E8 foram transfectadas com siRNAs segmentação tanto Mar-Va ou c e avaliados para a actividade repórter PSA-luc 48 horas mais tarde (controle de siRNA

vs o mundo Mar-Va siRNA = comparações 1-3;.. controlar siRNA

vs o mundo Mar-Vc siRNA comparações = 4-7). b) Validação de siRNA knockdown de Mar-Vc medida pelo q-PCR (*, p 0,05, **, p . 0,01)

Estes resultados indicam que o Mar-Vs contribuir para AR actividade de transcrição em células E8 e CE1 e que a sua inibição da actividade de AR se opõe. Para explorar ainda mais como a actividade de sinalização de AR pode ser modificada durante a CRPC, medimos níveis de expressão do gene alvo, AR

Fkbp5

[29], usando dois

In vivo

manipulações diferentes. Primeiro, castrados

C

+

; Pten

camundongos

L /L

mutantes em 6 semanas e analisadas em 30 wks e segundo nós excluídos epitelial AR em próstatas deficientes PTEN (

C

+

; Pten

L /L

; Ar

L

/Y

) -um modelo que caracterizaram anteriormente (S5 Fig) [30]. Similar aos nossos enzalutamida tratada mutantes (S3 Fig), observamos redução da perda de expressão do AR distal visando anticorpo /(AR-C19) e manteve a expressão do anticorpo amino terminal alvo (AR-N20). Comparado a hormona (AR +) regiões intactas (S5b Fig, painel superior esquerdo, AR + setas), expressão FKBP5 foi significativamente diminuída em amostras de castração. Como validação e controlo para a modulação dependente de andrógeno FKBP5 genética, avaliou AR e expressão FKBP5 em Pten-null; regiões AR-nulos de

C

+

; Pten

L /L

; AR

L

/Y

mutantes observando perda completa da AR epitelial (AR- região) e perto perda de expressão da proteína FKBP5 (S5b Fig, superior esquerdo, setas AR). Além disso, utilizando linhas CRPC derivados a partir do modelo do rato nula Pten [30], que validado activação de androgénio

Fkbp5

mediante adição de androgénio exógeno (Fig S5c). Estes dados indicam que durante a indução cirúrgica ou genética da CRPC em tumorigênese Pten nulo, o eixo sinalização AR-FKBP5 é prejudicada.

Discussão

A superexpressão de receptores androgênicos (ARs) ocorre em uma significativa número de cancros da próstata fase final, incluindo os de avançar para a resistência castração. A identificação de variantes de AR em linhas de células humanas e CRPC amostras clínicas sugere que as variantes de AR pode facilitar a continuação da função oncogénica AR, apesar da presença de RA terapia-alvo [31]. Isto pode ser atribuído ao facto de que a maioria de AR-Vs identificados até agora são previstos para codificar proteínas que não possuem o LBD, mas retendo o domínio de transactivação do terminal N assim como na qualidade dos factores de transcrição constitutivamente activa. Isto indica que a AR LBD é dispensável para a actividade transcricional AR e continuou contribuição para a progressão do cancro [27] [33] [32]. Como consequência, a compreensão do processo pelo qual surgem variantes AR e sua contribuição para o surgimento de CRPC tornou-se uma área de intensa investigação.

sistemas homólogo de câncer de próstata (dependência hormonal, resistência à castração e linhas celulares derivadas) tal como obtido utilizando o modelo nulo PTEN fornecer uma plataforma excelente para avaliar a iniciação e progressão da doença [22]. O nosso estudo, pela primeira vez, descreve a ocorrência natural destas variantes de AR NTD em células de cancro de próstata de rato deficiente PTEN e o local principal órgão. Importante, nós mostramos que o identificado AR-Vs não são estáticos, mas alterou na expressão durante a progressão CRPC. As três variantes de rato AR identificados neste estudo são compostos de estruturas moleculares novos. Mar-Va, que mantém os exons contíguos 1-4 seguido por ler-through no intron 4 e é aproximadamente análogo ao relatado Mar-V4 [15] e AR

V567es [27], com excepção do aminoácido única sequência codificada pela extremidade 3 ‘. Mar-Vb e Mar-Vc são compostas de duas regiões diferentes, localizadas dentro intron 1 emendados após exão 1, levando à sequência deduzida da proteína AR-Vs contendo apenas a NTD. A assim chamada AR-V8 identificados em 22rv1 células de cancro da próstata humanos aparece como o homólogo humano mais próximo que contém o AR-NTD seguido de uma cauda 33-aa mais codificado por um exão 3 ‘localizada dentro do intrão 3 [19]. A semelhança entre as variantes do rato identificados e aqueles previamente identificados em linhas de células humanas, sugere que o estresse celular da terapia de ablação hormonal pode agir de maneira comum durante a seleção para as variantes variante AR populações

Estudos clínicos recentes demonstraram Har-V7 a ser elevados em CRPC, metástase, a associação com recorrência bioquímica e prognóstico clínico [11] [17] [18] [34]. Uma das descobertas mais significativas do nosso estudo é a capacidade da castração ou AR terapia-alvo para selecionar para as isoformas do mouse AR. Estes dados demonstram não só um mecanismo adicional pelo qual

PTEN

células de cancro da próstata deficientes podem progredir para CRPC mas também tem fortes implicações para terapias destinadas a atingir directamente o domínio de ligação ao ligando do receptor de androgénio. Curiosamente, enquanto que foi observada a expressão aumentada relativa de Marvs em linhas celulares derivadas de cultura, a expressão de AR-FL foi mantido, o que é diferente do que foi observado em tumores primários do rato. Isso pode ser atribuído à natureza monoclonal de derivação de células

contra

a natureza altamente heterogénea de amostras primárias. Ele também pode ser associado com a manutenção geral de linhas de células em condições hormona intactas

relação

as condições de castração muito utilizado para manter tumores primários. A observação marcante que AR-FL diminuiu durante a progressão nos níveis de andrógenos castração ou na presença de exposição enzalutamida crônica, fornece suporte convincente que AR-FL é selecionado contra e que os ARVs podem facilitar a função AR continuou. Relatórios anteriores demonstraram que

PTEN

mutantes nulos são pouco responsiva tanto para castração e enzalutamida terapia [23] [35] [24]. Os nossos dados demonstram o aumento relativo de variantes AR-NTD, tanto

in vitro

e

in vivo

, o que é consistente com a falta de resposta a AR terapia direcionada neste modelo.

Foi observada a capacidade de Mar-Va, mas reduziu para Mar-VB e Mar-Vc, para melhorar a atividade de ensaios de repórter de transcrição AR. Isso pode ser atribuído ao fato de que Mar-Vb e Vc falta um motivo de ligação DNA. Nossos dados, no entanto, não se pode descartar a possibilidade de variantes, tais como Mar-Vb e Vc ter a função oncogénica através de mecanismos alternativos. Interessante, uma nova variante da estrutura de AR semelhante foi identificada em várias linhas celulares de cancro da próstata humanos [19]. A assim chamada AR8 também não tem um domínio de ligação de ADN e, assim, como o MAR-Vb e Vc-Mar identificados aqui, é improvável que funcionar como um factor de transcrição sobre o seu próprio. Em vez disso, foi demonstrado que AR8 associar com Src e o receptor EGF promovendo assim reforçada fosforilação do ar [19]. Será interessante para estudos futuros para abordar se MAR-Vb e Vc são capazes de associações da membrana plasmática semelhantes e uma contribuição potencial para CRPC.

Nossa AR-V derrubar estudos, que resultaram em redução da atividade transcricional AR , revelam potenciais aplicações terapêuticas da variante de segmentação durante a progressão para CRPC. A presença de variantes truncadas no Pten rato deficiente também é consistente com a observação clínica mantida expressão AR apesar da presença de potentes terapias AR-alvo, tais enzalutamida. No entanto, desde Mar-Va, b e c apresentaram respostas diferenciais em mudanças de expressão à castração ou Casodex em nossos estudos, a contribuição exata (s) de variantes individuais, ea sua cooperatividade potencial no sentido da CRPC continua a ser elucidado e provavelmente dependerá de celular contexto [8]. Futuros estudos de progressão pode considerar localizações celulares Mar-V, interações com outras vias oncogênicas e impacto em

in vivo

progressão.

Os resultados apresentados aqui fornecem evidência para a presença de novas variantes detectável na primária sistema de órgãos de camundongos nulos PTEN geneticamente modificadas com destaque para a expressão variante reforçada durante a progressão nos níveis de castração de andrógenos. estudos terapêuticos futuros podem considerar se segmentação precoce destas isoformas AR identificados podem prevenir ou retardar a progressão para CRPC. Isso Mar-Va e inibição Vc resultou em função AR transcrição reduzida fornece os fundamentos para testes de variantes farmacológicos segmentação AR. Frente aos resultados obtidos, é tentador especular que a introdução de AR-FL voltar para certas células CRPC deficientes PTEN contendo AR Vs pode restaurar essas células para terapia de privação de andrógeno.

Métodos

cultura de células e amostras da próstata do rato

E4, E8, CE1 CE2 [25] [26] e CaP8, linha de células P8 [36] foram estabelecidos a partir da condicional

Pten

modelo -null mouse. células LNCaP e PC-3 foram adquiridos a partir de ATCC. células C4-2B e COS-1 foram um presente do Dr. Baruch Frenkel (University of Southern California, Los Angeles, CA) e Dr. Allen Epstein (University of Southern California, Los Angeles, CA), respectivamente. Os derivados de linhas celulares parentais foram gerados através da cultura de 10% de CSS (carvão despojado-soro, Cellgro) durante até 18 dias. células E8 e CE2 também foram tratadas em meio de manutenção normais com a adição de 10 pM de anti-androgénio, bicalutamida (Sigma-Aldrich) durante 6 dias. tecidos prostáticos foram coletadas de ratos portadores de ADCA ou CRPC tumores, bem como do tipo selvagem queridos em diferentes grupos etários. próstatas dissecados foram processados ​​por congelação rápida em azoto líquido e armazenado em -80 ° C para posterior análise.

Clonagem e construções

Os ARNs totais foram isolados a partir celulares E8 e CE1 por Kit RNAqueous-4PCR (Life Technologies) utilizados como fonte. A detecção de emenda do mouse AR variantes deles foi atingido por Kit GeneRacer com SuperScript III RT e TOPO TA Cloning Kit para Sequencing (Life Technologies) de acordo com os protocolos do fabricante. Resumidamente, os ARN foram extraídos primeiro transcrito reversamente utilizando o iniciador GeneRacer oligo (dT) e o módulo de SuperScript RT III a partir do kit. ADNc pronto para corrida foram submetidos a “amplificação rápida da extremidade de cDNA PCR (3 ‘a 3 RACE-PCR) utilizando um iniciador específico do gene para a frente (SPG) e iniciador GeneRacer 3’ a partir do Módulo GeneRacer reversa. Outro ciclo de PCR aninhado foi conduzido para amplificação posterior, utilizando um iniciador aninhado SPG para a frente e o iniciador inverso interno GeneRacer 3 ‘fornecida no kit. Além disso superTaq polimerase (Life Technologies) foi usado para ambos 3’RACE e PCR com iniciadores internos. Adiante SPG e iniciadores internos ancorados dentro exon1 (S1 Table) para variantes previstas (S2 Tabela) usando a variante primers raça específica (S3 tabela). 3 ‘RACE e produtos de PCR aninhados foram então examinadas por padrão sub clonagem e sequenciação TA usando o Módulo de clonagem TOPO TA. Ape plasmídeo editor foi utilizado neste estudo para analisar os resultados de sequenciamento, prever sequências proteicas e gerar mapas de texto para Marvs (S3 Tabela)

construções de plasmídeos usados ​​neste estudo incluiu:. Rat AR full-length (Dr. Robert Matusik, da Universidade Vanderbilt, Nashville, TN), AR full-length humana (Dr. Jeremy Jones, City of Hope, Duarte, CA) e PSA-luciferase repórter e pcDNA3.1-myc (Dr. Parkash Gill, Universidade do Sul Califórnia, Los Angeles, CA). pCR4-TOPO foi comprado na TOPO TA Cloning Kit para Sequencing (Life Technologies).

CDS (que codifica sequências) para MARVA, Vb e Vc foram amplificados por PCR a partir de ADNc de E8 e CE1 utilizando os conjuntos de iniciadores que encerram toda a grelha de leitura aberta (ORF), e sub-clonado em pcDNA3.1-myc-hisC. Para gerar as construções ARVA-myc e ARVC-myc, reverse primers foram re-projetado para ser ancorado a montante de suas próprias códons de parada e em enquadrado com a ORF de vetor de expressão. Hifi AccuStart Taq DNA polimerase (Quanta Biosciences) e Taq DNA polimerase HotStar (Qiagen), foram aplicados na clonagem por PCR. As sequências de iniciador utilizado para clonar Va, Vb, Vc, Va-myc e VC-myc foram fornecidos na Tabela S4.

PCR quantitativa e PCR em tempo real

Os ARNs totais foram extraídos a partir celulares todas as linhas de células derivado parental ou de outro e depois de transcrição reversa utilizando oligo de primer (dT) e SuperScript III First-Strand Synthesis (Life Technologies). As amostras de ARN utilizadas para vários ensaios foram isolados a partir de células com diferentes lotes. PCR convencional foi realizada em ADNc utilizando o mesmo iniciador directo ancorado dentro exon1 emparelhado com o iniciador inverso específico para Mar-Va, b, c e AR-FL, respectivamente (Tabela S5). Quantitative PCR em tempo real e análise de dados foram descritos previamente. Os conjuntos de iniciadores em tempo real projetado especificamente e exclusivamente para amplificar cada ARV e AR-FL foram listadas na Tabela S6.

transfecção e luciferase repórter ensaio

1-2 dias antes da transfecção, as células foram colocadas em meio contendo soro despojado com carvão (CSS). Para todas as transfecções, piscinas de células foram transfectadas utilizando Lipofectamine Plus (Invitrogen) com o plasmídeo vazio vetor de controle, o plasmídeo AR full-length, ou plasmídeos AR variante de processamento, juntamente com as construções responsivos aos andrógenos luciferase ou PSA-luciferase de pirilampo MMTV-pirilampo [28 ] eo controle Renilla luciferase andrógeno-insensitive pRL-SV40 (Promega). plasmídeo de controlo de vector vazio foi utilizado para equilibrar DNA total em todas as transfecções. No dia seguinte, as células foram colocadas em placas em quadruplicado com fármacos em placas de 96 poços. 24 horas mais tarde, as actividades da luciferase foram quantificados (Dual kit de ensaio de luciferase, Promega) num leitor de placas (Tecan) e o sinal de pirilampo normalizados para o sinal de Renilla para controlar o número de células.

Ensaio

Co-imunoprecipitação

células COS foram transfectadas com MARVA-myc ou mARVc-myc de rato, juntamente com AR-FL utilizando (Life Technologies) Lipofectamine 2000 de acordo com o protocolo do fabricante. Cerca de 48 horas.