Abstract

fator de crescimento transformante (TGF) de sinalização -β /Smad desempenha um papel importante no desenvolvimento do câncer de cólon, progressão e metástase. Neste estudo nós demonstramos que a família microRNA-130a /301a /454 é regulado para cima em tecidos de cancro do cólon em relação a mucosa normal adjacente emparelhado, que partilham a mesma região 3′-untranslational (3′-UTR) sequência de semente de ligação e são predicado para segmentar Smad4. Em células HCT116 colorectal câncer e SW480, a sobre-expressão de miARN-130a /301a /454 imita aumenta a proliferação e migração celular, enquanto que os inibidores destas miARNs afectar a sobrevivência celular. A função biológica de miRNA-130a /301a /454 em células cancerígenas do cólon é provavelmente mediado pela supressão da Smad4, eo aumento da regulação do miRNAs está correlacionada com Smad4 infra-regulação em cancros do cólon humano. Colectivamente, estes resultados sugerem que miRNA-130a /301a /454 são novos miRNAs oncogênicos que contribuem para a tumorigênese cólon através do controlo do TGF-β /Smad sinalização, que pode ter potencial de aplicação na terapia do cancro

Citation:. Liu L, Nie J, Chen L, Dong G, Du X, Wu X, et al. (2013) O papel oncogênico de microRNA-130a /301a /454 no cancro colorectal humano através Segmentação Smad4 Expression. PLoS ONE 8 (2): e55532. doi: 10.1371 /journal.pone.0055532

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de setembro de 2012; Aceito: 27 de dezembro de 2012; Publicação: 05 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto é apoiada por doações provenientes dos programas nacionais Pesquisa básica (2012CB518103), National Natural Science Foundation da China (31100554, 31270820, 81230061 e 81121004), Fundação Nursery de PLA general Hospital (12KMM48) e Programa Nova Beijing (Z12111000250000). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do cólon é um dos cancros mais frequentes e uma causa comum de mortes relacionadas ao câncer [1]. Devido ao mau prognóstico e invasão distante e migração, a incidência global de câncer de cólon é de aproximadamente 5% ea taxa de sobrevida em 5 anos dos pacientes com câncer de cólon é muito baixo [2]. Assim, a identificação de novos alvos para o desenvolvimento de tratamentos não-convencionais é urgente e vai tirar proveito do progresso na compreensão ampla e profunda da patogênese molecular de câncer de cólon.

Os microRNAs (miRNAs) são uma extensa classe de pequenos RNAs não codificantes (18-25 nt), com um impacto significativo em um número de processos biológicos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, crescimento, metabolismo, e a tumorigénese, por meio de ligação directa à região untranslational 3 ‘(3’-UTR) alvo de ARNm [3] – [5]. MicroRNAs pode regular a expressão génica por dois modos, dependendo do grau de complementaridade com os alvos de ARNm, para suprimir a tradução ou induzir a degradação de ARNm [6], [7]. MicroRNAs podem funcionar como supressores de tumores ou oncogenes base sobre se ou não os miARN alvo especificamente oncogenes ou genes supressores de tumor [8]. Ambos oncogénica miARNs e miARNs supressores de tumores têm sido demonstrados e descritos na carcinogénese do cólon e progressão, tal como supra-regulada de miR-135, miR-21, o miR-17-92, e miR-196a, e regulados negativamente miR-34, o miR-195, e miR-365 [9] – [13]. O perfil de expressão é altamente miARNs tecido e tipo celular específico, demonstrando, assim, a importância funcional biológica de um miARN expressa [14]. No entanto, elucidar as características de expressão e os papéis dos miRNAs em biologia do câncer, especialmente câncer de cólon, continua a ser um processo contínuo.

O microRNA-130ac /301ab /454/721 família tem a mesma semente de ligação 3′-UTR seqüência. Recentemente, miR-130a /301ab tem sido relatada a ser regulada em vários tipos de câncer, como o carcinoma hepatocelular, cancro do pulmão não de pequenas células, leucemia mielóide crônica, câncer de pâncreas, e cancro da mama [15] – [21]; entretanto, o miR-130a /301a é regulada para baixo na leucemia linfocítica crónica e anemia falciforme [22], [23], indicando a complexidade e diversidade dos papéis do miR-130a /301a na tumorigênese. No entanto, o padrão de expressão eo papel de miR-130a /301a /454 na carcinogênese do cólon permanece desconhecida.

Neste estudo foi investigada a expressão e papéis de miR-130a /301a /454 no desenvolvimento do câncer de cólon. Nós mostramos que miR-130a /301a /454 é regulado para cima em tecidos de cancro do cólon humanos clinicamente ressecados e linhas celulares de cancro do cólon, e esses miRNAs exibem propriedades oncogênicas no cólon células cancerosas

in vitro

e

in vivo

. Os mecanismos subjacentes os papéis de miR-130a /301a /454 no desenvolvimento do câncer de cólon também foram investigados. Assim, nossos dados destacam a importância do miR-130a /301a /454 /família na patogênese do câncer e sugerem uma potencial aplicação na terapia do cancro.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras de tecido

tecidos de câncer de cólon cirurgicamente removido e-emparelhados tecidos da mucosa normais adjacentes foram coletados de 35 pacientes com câncer de cólon no Hospital Geral do PLA (Pequim, China), e foram usados ​​para reversa quantitativa reação em cadeia de polimerase (qRT- PCR), e análise de imunotransferência. Os tecidos cirurgicamente ressecados foram rapidamente congeladas em azoto líquido até à análise. Todas as amostras foram obtidas com o consentimento informado dos pacientes e os experimentos foram aprovados pelo Comitê do Hospital Geral do PLA de Ética. Todos os participantes forneceram consentimento por escrito para participar neste estudo informou.

extração de RNA e qRT-PCR

O RNA total, incluindo miRNA, foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante . Para a análise de miARN, utilizou-se poli-A em tempo real de qRT-PCR. O ARN poliadenilado foi isolado utilizando poli-A polimerase (New England Biolabs) de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, o ARN poli-A cauda foi transcrito inversamente usando IMPROM da transcriptase reversa (Promega), seguindo o protocolo do fabricante, e miR-iniciador de RT (Invitrogen). O iniciador de miR-RT foi: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG (T) 18VN-3 ‘. PCR em tempo real foi realizado utilizando o kit de Mistura de SYBR verde de PCR (Qiagen), de acordo com o protocolo do fabricante [12], com os seguintes iniciadores: miR-130a, 5’-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3 ‘; miR-301a, 5’-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3 ‘; miR-454, 5’-ACCCTATCAATATTGTCTCTGC-3 ‘; iniciador universal, 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 ‘; U6-F, 5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 ‘, U6-R, 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’. O nível relativo de expressão de miR-130a /301a /454 foi normalizada para o controle interno (U6), utilizando o 2

-ΔΔCt ciclo método limiar.

Cultura de células e transfecção

o cólon humano linhas celulares de cancro HCT116, HCT15, HT29, LoVo e SW480 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC), e mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), penicilina e estreptomicina, numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 a 37 ° C. Os imita miARNs e inibidores de miARN foram sintetizados por GenePharma (Xangai, China). transfections miRNAs foram realizadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Análise da viabilidade celular

O

in vitro

viabilidade celular das células HCT116 ou SW480 foi avaliada utilizando o Kit celular Contagem -8 (CCK-8, Dojindo, Japão) método. Resumidamente, o meio gasto foi substituído com meio fresco contendo 10 ul de reagente de CCK8 indicada no períodos de tempo após transfecção. As células foram então incubadas a 37 ° C durante 1 h e o número de células viáveis ​​foi avaliado por medição da absorvância a 450 nm.

A migração celular ensaio

transfectantes HCT116 foram privadas de soro durante 12 h em meio RPMI-1640 contendo 0,1% de FBS. células privadas de soro foram tratadas com tripsina e ressuspensas em meio RPMI-1640 contendo 0,1% de FBS, em seguida, 1 × 10

5 células foram adicionadas à câmara superior (8 um de tamanho de poro; Corning) de placas de 24 poços, em meio isento de soro (500 ul). Após incubação durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO

2, as células que migraram na superfície inferior da membrana foram coradas com solução de coloração violeta a 0,1% durante 30 min, e contados utilizando um microscópio invertido.

ensaio de tumorigenicidade em ratinhos nus

Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com o Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de animais de laboratório, com a aprovação do Conselho de Investigação Científica do Hospital Geral de PLA. O ensaio de tumorigenicidade foi realizada como descrito anteriormente [12]. O controlo negativo ou de miR-130a /301a /454 células HCT116 ou SW480 imitam-transfectadas (1 × 10

7) foram suspensos em 0,1 ml de PBS, em seguida injectada subcutaneamente em cada lado do flanco posterior da mesma 4-semana- BALB fêmea de idade /c atímicos ratinhos nus. Oito ratinhos nus foram incluídos em cada grupo e o crescimento tumoral foi medida diariamente utilizando compassos de calibre. O volume do tumor foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: volume = comprimento x largura

2 × 0,5. A expressão de miR-130a /301a /454 em amostras de tumor nos tempos indicados foram detectados utilizando um ensaio de qRT-PCR.

repórter de luciferase 3’UTR ensaio

O humano Smad4 3’UTR plasmídeo repórter de luciferase e o plasmídeo que contém o local alvo de miR-130a /301a /454 eliminado ou mutado Smad4 3’UTR foram construídos como descrito previamente [13]. Todas as construções foram confirmadas por sequenciação de ADN. Os ensaios de repórter de luciferase foram realizados, como relatado anteriormente [13]. Resumidamente, as actividades da luciferase foram medidas às 48 h pós-transfecção usando o Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase (Promega), seguindo as instruções do fabricante. Os dados foram normalizados dividindo

actividade luciferase de vaga-lume

pelo

Renilla

atividade luciferase.

Immunoblotting

Os extratos de proteínas lisadas foram submetidos a dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida electroforese em gel (SDS-PAGE), transferidos para membranas de nitrocelulose, em seguida, transferidas, como descrito anteriormente [24]. O anticorpo anti-Smad4 foi adquirido a Cell Signaling Technology. GAPDH anticorpo e os anticorpos secundários foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology.

A análise estatística

Os dados são apresentados como a média ± S.D. As comparações estatísticas entre grupos experimentais foram analisadas por Student

t

-Testes, e um valor p bicaudado 0,05 foi considerado significativo. A correlação entre o miR-130a /301a /454 expressão e do nível de proteína Smad4 foi analisada utilizando análise do coeficiente de correlação de Pearson, com valores de R e p, conforme indicado.

Resultados

miR-130a /301a /454 é regulado para cima em tecidos de cancro do cólon e linhas celulares

Para explorar o papel de miR-130a /301a /454 no desenvolvimento do cancro do cólon humano, foram detectados os níveis de expressão em 35 pares de câncer de cólon humano e tecidos de mucosa normais adjacentes. De acordo com a análise de qRT-PCR, os níveis de miR-130a /301a /454 expressão estavam significativamente aumentados em tecidos tumorais em comparação com tecidos adjacentes normais da mucosa (Fig. 1A-C). Além disso, o miR-130a /301a /454 foi aumentada em linhas de células de cancro do cólon (HCT116, HCT15, HT29, SW480, LoVo e; A Fig. 1D-F). Além disso, houve uma correlação positiva entre a cada dois miRNAs entre miR-130a /301a /454 (Fig. 1G-I), mostrando um perfil de expressão comum nesta família miRNA no câncer de cólon. Estes resultados sugerem que miR-130a /301a /454 é regulado para cima em células cancerígenas do cólon, o que pode ser relevante para o desenvolvimento do cancro do cólon humano.

A expressão de miR-130a /301a /454 foi examinado por qRT -PCR em 35 emparelhado cancro do cólon humano e em tecidos de mucosa normais adjacentes (a, B, C), e em linhas celulares de cancro do cólon, tal como indicado (D, e, F). A expressão de miR-130a /301a /454 foi normalizada para U6 em cada amostra. Os dados são mostrados separadamente em amostras humanas (A, B, C), ou como a média ± S.D. (N = 3) em linhas de células (D, E, F). **,

p 0,01

. (G, H, I) A análise estatística sobre a correlação entre cada dois miRNAs entre miR-130a /301a /454 foi realizada utilizando análise do coeficiente de correlação de Pearson.

r

e

valores p

são mostrados como indicado.

miR-130a /301a /454 aumenta a viabilidade celular e migração em linhas celulares de cancro do cólon

a alta expressão de miR-130a /301a /454 em tecidos de cancro do cólon e linhas celulares nos levou a investigar a função biológica destes miRNAs em câncer de cólon. O ensaio CCK8 mostrou que o restauro de miR-130a /301a /454 aumentou significativamente a proliferação de células HCT116 do cancro do cólon ou SW480 (Fig. 2A e B), enquanto que a sobre-expressão de qualquer inibidor da célula contra o miR-130a /301a /454 reduzida viabilidade em ambas as células de cancro do cólon (Fig. 2C e D) Estes três miARNs exibiu efeitos de promoção de crescimento semelhantes em cancros do cólon, e não há regulamentos mútuos entre o miR-130a /301a /454 foram observados (Fig. 2E e F). Além disso, o miR-130a /301a /454 promoveu a migração celular em células HCT116, tal como analisado pelo ensaio de migração de células Transwell (Fig. 2G, painel esquerdo). Em contraste, o knockdown de miR-130a /301a /454 motilidade celular suprimida em células cancerígenas do cólon (Fig. 2G, painel da direita). Estas observações sugerem que miR-130a /301a /454 promove o crescimento de células de câncer de cólon e de migração, agindo assim como miRNAs oncogênicos em câncer de cólon.

células (A, B) HCT116 O cancro do cólon e SW480 foram transfectadas com RNA de controle ou miR-130a /301a /454 mímica como indicado. A viabilidade celular foi detectado nos pontos de tempo indicados após a transfecção utilizando ensaios CCK8. *,

p Art 0,05. (C, D) O inibidor de miR-130a /301a /454 foi transfectado em células HCT116 e SW480, e a viabilidade celular foi detectado nos pontos de tempo indicados utilizando ensaios CCK8. *,

p Art 0,05. (E, F) Os níveis de expressão de dois em dois miARNs entre o miR-130a /301a /454 foram detectados por ensaios de qRT-PCR, quando a mímica ou outro inibidor da miARN foi transfectado em células HCT116. (G) células HCT116 foram transfectadas com RNA controle, miR-130a /301a /454 mímico, ou inibidor de miR-130a /301a /454. O número de células que migraram foi calculado e mostrado. Os dados são apresentados como a média ± S.D. (N = 3) de uma experiência representativa. Resultados semelhantes foram obtidos a partir de três experiências independentes. *,

p

. 0,05

miR-130a /301a /454 promove tumorigenecity

in vivo

Nós confirmamos ainda mais o tumor efeitos -a promoção de miR-130a /301a /454

in vivo

. RNA controle negativo, miR-130a /301a /454 mímico ou inibidor de células cancerígenas do cólon transfectadas, foram injetadas em oito ratinhos nus, como descrito. Como mostrado na Fig. 3, miR-130a células HCT116 e SW480 /301A /454-transfectadas apresentaram formação rápida do tumor em comparação com os transfectantes de controlo negativo, enquanto knockdown de miR-130a /301a /454 causou a formação de tumores atrasado (Fig. 3A-F). Os níveis de miR-130a /301a /454 expressão foram validados por ensaios de qRT-PCR a partir de amostras de tumores nos tempos indicados (Fig. 3G e H). Estes resultados indicam que miR-130a /301a /454 significativamente reforçada tumorigenicidade de células de câncer de cólon em um rato modelo de xenotransplante nu.

Efeito do miR-130a /301a /454 na tumorigenicidade em um rato modelo de xenotransplante nu. Controlo de ARN, miR-130a /301a /454 130a miR-/301A /454 células HCT116 do cancro do cólon transfectadas com inibidores de imitar ou (, B, C A) e SW480 células (D, E, F) foram injectadas subcutaneamente em ambos os lados de no flanco posterior dos mesmos ratinhos nus, respectivamente (n = 8 por grupo). A curva de crescimento do tumor é apresentado como indicado. *,

p Art 0,05. (G, H) Os tecidos tumorais foram recolhidas a partir de dois ratinhos de cada grupo nos tempos indicados, e os níveis de expressão de miR-130a /301a /454 foram analisadas por ensaios de qRT-PCR.

miR-130a /301a /454 reprime diretamente a expressão de Smad4

Com base na previsão alvo miRNA (https://www.targetscan.org), mais de cem genes são genes alvo putativos para miR-130a /301a /454. Como estes miARNs são capazes de aumentar a tumorigenecity de células de cancro do cólon in

in vitro

e

In vivo

, o gene alvo regulada pela miR-130a /301a /454 pode funcionar como um supressor do tumor. Entre os genes alvo putativas, Smad4, um supressor de tumor importante envolvido na sinalização de TGF-β /BMP, foi mostrado para conter um putativo miR-130a /301a /454 local alvo conservado com base na previsão TargetScan (Fig. 4A). Para determinar se ou não Smad4 está diretamente alvo de miR-130a /301a /454 expressão, construímos plasmídeos repórter luciferase contendo Smad4 3′-UTR ou portadores de deleção /mutação do miR-130a /301a /454 local alvo putativo. Por co-transfecção com o miR-130a /301a /454 mímico, que mostrou que a actividade da luciferase do repórter Smad4-3’UTR tipo selvagem foi suprimido, enquanto que o local alvo suprimido ou mutado repórter não conseguiu ser alvo de miR-130a /301A /454 co-transfecção (Fig. 4B). De nota, a análise de imunotransferência mostrou que o miR-130a /301a /454 reduziu marcadamente o nível de expressão da proteína endógena de Smad4 comparação com ARN de controlo negativo em células HCT116 e SW480 (Fig. 4C). Smad4 actua como um transdutor central do factor de crescimento transformante (TGF) proteína morfogenética óssea e -β (BMP) de sinalização, porque R-Smad forma um complexo heteromérico com Smad4 e transloca-se para o núcleo para regular a transcrição de gene. Por isso, procurou-se identificar se ou não estes miRNAs influenciar TGFp e BMP actividades de sinalização. miR-130a /301a /454 inibidor foi introduzido em células HCT116 transfectadas com o TGF-β repórter CAGA12-lux ou o repórter BMP BRE-lux. Como mostrado na Fig. 4D, o miR-130a /301a /454 inibidor marcadamente aumentou as respostas de TGF-p e BMP quando a forma constitutivamente activa de /BMP-receptor de TGF-β I (TβRI-CA /BMPRI-CA) foi co-expressa, acompanhada de Smad4-regulação , sugerindo que o miR-130a /301a /454 pode suprimir TGF-β de sinalização /BMP inibindo a expressão Smad4

.

(a) Smad4 humano pode ser um alvo molecular de miR-130a /301a /454. Os alinhamentos de sequência de miR-130a /301a /454 e seus sites de destino em 3’UTR de Smad4, descarregado a partir TargetScan (https://www.targetscan.org) são mostrados. (B) As células HCT116 foram co-transfectadas com humano Smad4 3’UTR

Firefly luciferase

plasmídeo repórter, miR-130a /301a /454 locais alvo suprimido ou mutado construção repórter, em conjunto com os plasmídeos RL, ARN de controlo, ou miR-130a /301a /454 mímica, como indicado. Após 48 h,

pirilampo atividade luciferase

foi medida e normalizada pela

Renilla

atividade luciferase. células HCT116 e SW480 (C) foram transfectadas com RNA controlo ou miR-130a /301a /454 mímico. Após 48 h, Smad4 humana e GAPDH controlo interno foram detectados por imunotransf erência (painel superior), e os níveis de miR-130a /301a /454 expressão foram medidos por ensaio de qRT-PCR (painel inferior). A relação de densitometria para immunoblotting foi mostrado. (D) As células HCT116 foram co-transfectadas com o repórter CAGA12-lux TGFp ou o repórter BMP BRE-Lux, em conjunto com o plasmídeo RL, ARN de controlo ou inibidor de miR-130a /301a /454, e TβRI-CA ou BMPRI-bis , como indicado. Após 48 h,

pirilampo atividade luciferase

foi medida e normalizada pela

Renilla

atividade luciferase. A expressão endógena de Smad4 e GAPDH foram detectados por imunotransf erência. TβRI-ca, a forma constitutivamente activa do receptor de TGF-β I; BMPRI-ca, a forma constitutivamente activa de-receptor BMP I. expressão (E) Smad4 no vetor pCDNA vazio ou Smad4-expressando plasmídeo células HCT116 estavelmente transfectadas foram detectados por immunoblotting. As células HCT-116 estavelmente transfectadas (F, G) controlar ou Smad4 foram transfectadas com ARN de controlo, o miR-130a /301a /454 mímico (F), ou inibidor de miR-130a /301a /454 (L), tal como indicado. A viabilidade celular foi detectada 96 h após a transfecção utilizando ensaios CCK8. *,

p

. 0,05

Além disso, determinou-se ou não os efeitos promotores do crescimento de miR-130a /301a /454 são principalmente através do direcionamento de expressão Smad4. plasmídeo que expressa Smad4 células HCT116 estavelmente transfectadas foram preparados, que transcrito de ARNm Smad4 sem a sequência de 3 ‘UTR. Nestas células, a expressão Smad4 foi confirmado para ser aumentada em comparação com células de controlo (Fig 4E.); entretanto, o miR-130a /301a /454 não está mais direcionada expressão Smad4, uma vez que estas células transcrito mRNA Smad4 sem a 3’UTR. Notavelmente, os efeitos do aumento de crescimento de miR-130a /301a /454 foram significativamente suprimida em células HCT116 Smad4-transfectadas (Fig. 4F). Além disso, o miR-130a /301a /454 inibidor não conseguiu suprimir a viabilidade celular nestas células (Fig. 4G). Estes resultados demonstraram ainda que as funções de promoção do crescimento de miR-130a /301a /454 eram principalmente através da inibição da expressão Smad4.

correlação clínica entre miR-130a /301a /454 níveis e expressão Smad4

Para entender o significado clínico de miR-130a /301a /454 e seu alvo no cancro do cólon, foram determinados os níveis de miR-130a /301a /454 e expressão da proteína de Smad4 em 14 pares de combinados espécimes de cancro do cólon por qRT- PCR e imunotransferência, respectivamente (Fig. 5A e B). Como esperado, a análise de Pearson coeficiente de correlação sugeriu que a expressão Smad4 foi inversamente correlacionada com miR-130a /301a /454 expressão em tecidos de câncer de cólon (Fig. 5C-E). Estes dados apoiam a noção de que a sobre-expressão de miR-130a /301a /454 conduz a regulação negativa Smad4, inibindo, assim, a supressão do crescimento celular mediada por sinalização de TGF-β, o que contribui para o desenvolvimento de cancro do cólon.

(a, B) Expressão de Smad4 e GAPDH em amostras de cancro do cólon combinados e tecidos de mucosa não neoplásicas foram detectados por imunotransf erência (a). miR-130a /301a /454 expressão foi examinada por qRT-PCR (B). Quatro casos representativos são mostrados. (C) O nível relativo de Smad4 ou miR-130a /301a /454 expressão foi normalizada para o GAPDH interno ou expressão U6. A análise estatística foi realizada utilizando análise do coeficiente de correlação de Pearson. Normalizados miR-130a /301a /454 e proteína Smad4 níveis de expressão são mostrados como valores padronizados.

r

e

valores p

são mostrados como indicado.

Discussão

No presente estudo, mostramos que miR-130a /301a /454 é regulado para cima no câncer de cólon, e demonstrou ainda mais o efeito de promoção da proliferação de miR-130a /301a /454 em células cancerígenas do cólon. MicroRNA-130a /301a /454 é indicado como miRNA oncogênicos no desenvolvimento do cancro do cólon e progressão, o que é consistente com papéis em outros tipos de câncer, como o carcinoma hepatocelular, cancro do pulmão não de pequenas células, leucemia mielóide crônica, câncer de pâncreas, e cancro da mama [15 ] – [21]. No entanto, o miR-130a é regulada negativamente na leucemia linfocítica crónica, e pode modular a sobrevivência celular através da inibição do programa autofagia [22]. Além disso, o nível plasmático de miR-301a é regulada para baixo em pacientes com anemia de células falciformes, em comparação com os controlos normais, que está relacionado com o PAI-1 supressão [23]. Os padrões de expressão conhecidos, alvos potenciais, e funções biológicas desta família miR-130a /301a /454 encontram-se resumidos na Tabela 1 [15] – [23], [25] – [29]. As características de expressão diferentes de miR-130a /301a podem reflectir as diversas funções da família miR-130/301 em diferentes tipos de cancro. Assim, a desregulamentação de miR-130a /301a /454 existe em diferentes tipos de câncer, e os papéis desta família miRNA na carcinogênese e progressão não pode ser simplesmente concluiu como um supressor de tumor ou oncogene. Explorando os perfis de expressão e os papéis de miR-130a /301a /454 em câncer de cólon irá expandir nossa compreensão para esta família miRNA importante na tumorigênese.

A via de sinalização TGF-β desempenha um papel essencial em numerosas processos biológicos. Smad4, o transdutor central do TGF-β e via de sinalização de BMP, actua como um supressor tumoral importante. Smad4 mutações ou deleções foram amplamente observado em diferentes tipos de cancro, tais como colorrectal, pancreático, e cancros da mama [30] – [32]; No entanto, o mecanismo detalhado do Smad4 inactivação é limitada. Nós demonstramos que miR-130a /301a /454 reprime a expressão Smad4 através de ligação direta a 3’UTR, enquanto nós também observou que existem outros sites de consenso miRNA no Smad4 3′-UTR (por exemplo, sites de miR-34a, miR- 146a, e miR-199, que foram identificados como reguladores negativos da Smad4 em cancro gástrico e glioblastoma) [33] – [35]. Portanto, não se pode descartar a possibilidade de que esses miRNAs também participam do down-regulação da expressão Smad4 no desenvolvimento de câncer de cólon. Além disso, não podemos excluir a possibilidade de que outros potenciais alvos de miR-130a /301a /454 pode governar vias adicionais do cancro e promover o desenvolvimento de câncer de cólon, como um único miRNA é conhecido para direcionar vários mRNAs. Estas hipóteses indicam a necessidade de mais estudos para revelar toda a “targetome” da família miR-130/301/454 na carcinogênese do cólon e progressão.

induzidas células-tronco pluripotentes (iPSCs) podem ser gerados por expressão forçada de factores de transcrição, incluindo Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc [36]. miARNs específicos têm sido mostrado para ser envolvido na geração CIPS, tais como o miR-290 e miR-302 [37] – [39]. Recentemente, Pfaff et al. [25] mostraram que a família miRNA (miR-130/301/721) funciona como um importante regulador da indução iPSC, visando o fator homeobox transcrição, Meox2. A geração de iPSCs envolve um processo de mesenquimais-epiteliais de transição (TEM), devendo os factores de indução de MET ou bloqueando o epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) através da inibição de TGF-β sinalização desempenham um papel essencial na reprogramação de células [40] . Nós descobrimos um novo alvo da família de miR-130/301/454 (Smad4), que tem a função chave na sinalização de TGF-β, proporcionando a possibilidade de que a família de miR-130/301/454 pode controlar a reprogramação através da supressão de TGF-β atividade /Smad4. Assim, nossos estudos têm uma nova luz sobre o mecanismo molecular e crosstalk de regulação de células-tronco e tumorigênese.

Em conclusão, nossos resultados confirmam que a família miR-130a /301a /454 é um determinante crítico em diferentes tipos de desenvolvimento e progressão do câncer. Assim, o miR-130a /301a /454 família pode representar um alvo molecular promissor para a detecção precoce do câncer.