Abstract

células-tronco cancerosas (CSCs) são considerados um subconjunto do tumor maior responsável por iniciar e manter a doença. Vários marcadores celulares de superfície têm sido recentemente utilizadas para identificar os CSCs. Entre aqueles é CD133, que é expressa por células progenitoras hematopoiéticas, bem como células estaminais embrionárias e vários cancros. Recentemente, nós isolamos e CD133 cultivadas positivo [CD133 (+)] células de várias linhas celulares de cancro usando um NASA desenvolveu hidrodinâmica biorreator Focando (HFB) (Celdyne, Houston, TX). Para efeitos de comparação, outro biorreactor, foi utilizado o sistema de cultura de células rotativo (RCCS) fabricado pela Synthecon (Houston, TX). Tanto a HFB e os biorreactores RCCS simular aspectos da hypogravity. No nosso estudo, o aumento do HFB CD133 crescimento celular (+) a partir de várias linhas de células em comparação com o navio RCCS e para o controlo normal da gravidade. Observou-se um sinal (+) a proliferação de 15 vezes o número de CD133 (+) com a fracção celular que as células cancerígenas foram cultivadas durante 7 dias em condições optimizadas. O recipiente RCCS vez produziu um (-) redução de 4,8 vezes na CD133 (+) fracção celular que se refere à HFB após 7 dias de cultura. Curiosamente, nós também descobrimos que o ambiente hypogravity do HFB muito sensibilizados os (+) células cancerosas CD133, que são normalmente resistentes a um tratamento de quimioterapia, para se tornar susceptível a vários agentes quimioterapêuticos, abrindo o caminho para o tratamento quimioterapêutico em menos tóxicos e mais eficazes pacientes. Para ser capaz de testar a eficácia de agentes citotóxicos in vitro antes da sua utilização em ambiente clínico em células de câncer, bem como sobre o câncer de células-tronco pode abrir o caminho para estratégias de quimioterápicos mais eficazes em pacientes. Este poderia ser um importante avanço nas opções terapêuticas de pacientes oncológicos, permitindo regimes de quimioterapia mais direcionados e personalizados, bem como para maiores taxas de resposta

Citation:. Kelly SE, Di Benedetto A, Greco A, Howard CM , Sollars VE, Primerano DA, et al. (2010) Rápido Seleção e proliferação de CD133 (+) Células de câncer de Linhas Celulares: Implicações quimioterápicos. PLoS ONE 5 (4): e10035. doi: 10.1371 /journal.pone.0010035

editor: Annarosa Leri, Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de fevereiro de 2010; Aceito: 16 de março de 2010; Publicação: 08 de abril de 2010

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. Esta pesquisa foi realizada com fundos recebidos em parte pela diferenciação celular e Centro de Desenvolvimento (PDDPB) na Universidade Marshall, NIH- CA138510, NIH-CA140024, NIH-COBRE 5P20RR020180 (para PPC); West Virginia NASA Space Grant Consortium (para S. K. e J.V.V.); WV-INBRE 5P20RR016477 (a D.P.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Neoplasias podem ser visualizados como tecido que consiste de uma população heterogénea de células que diferem em características biológicas e potencial de auto-renovação [1]. A natureza clonal de certos tumores malignos está bem estabelecido [2]. De acordo com o modelo de evolução clonal de células de tumor, cancro é formado através da acumulação de alterações genéticas em células e selecção gradual de clones de [3], [4]. Portanto, o tumor é considerado como tecido anormal que descendem de uma única célula, através da acumulação de erros genéticos contínua e várias alterações epigenética. No entanto, vários experimentos realizados durante as últimas décadas têm mostrado que nem todas as células tumorais é uma célula iniciar tumor (T-IC) e que, como muitos como 10

6 murino ou tumorais humanas células são necessárias para o transplante de um novo tumor um existente [4], [5], [6], [7]. Esta evidência sugeriram a possibilidade de que as células tumorais podem existir num estado hierárquica, na qual apenas um pequeno número de células de tumor possuam potencial de iniciação. Dados recentes a partir de ambas as doenças malignas hematológicas e tumores sólidos têm sugerido que existem populações apenas pequenas de células em cada malignidade que são capazes de iniciação do tumor que são as células estaminais do cancro (CSC) [4], [5], [6], [ ,,,0],7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Estas células parecem ser capazes de divisão assimétrica e de auto-renovação, e são apenas uma fracção menor entre o volume de células mais diferenciadas no tumor [16], [17], [18].

Recentemente, CSCs têm sido estudados em diferentes tipos de tumores primários, a fim de desenvolver terapias específicas CSC-[6], [11], [19], [20], [21]. Curiosamente, determinados tumores são altamente resistentes à quimioterapia e outras formas de tratamento e, embora tratamentos agressivos destruir a maioria das células cancerosas, uma pequena fracção das células sobrevivem e muitas vezes regenerar em ainda maiores massas de células de tumor [22], [23] , [24]. terapias eficazes para pacientes com câncer requer uma compreensão completa dos mecanismos que levam ao desenvolvimento do tumor e resistência aos medicamentos.

A recente descoberta de CSCs tem desempenhado um papel fundamental na mudança de nossa visão de carcinogênese e quimioterapia. CSCs são pensados ​​para ser responsável pela formação e crescimento de tecido neoplásico. Os CSCs são naturalmente resistentes à maioria quimioterapia atual, devido à sua natureza de repouso. Isto pode explicar porque quimioterapias tradicionais podem reduzir inicialmente a maior parte da massa do tumor, mas não conseguem erradicá-lo na totalidade, permitindo a eventual recorrência [1], [11], [17], [18], [22]. CSCs são mais resistentes a terapia, não só secundária à quiescência, mas também devido ao aumento da expressão das proteínas anti-apoptóticas e de transportadores de efluxo de drogas. Câncer tratamentos disponíveis hoje em sua maioria explorar os potenciais de proliferação e metastáticos das células cancerosas; portanto, a maioria dos tratamentos são dirigidos a células que se dividem rapidamente e em alvos moleculares que representam a maior parte do tumor. Isto pode explicar o fracasso de tratamentos para erradicar a doença ou para prevenir a recorrência de câncer. Além disso, se uma droga afecta o crescimento de uma população única de células pequenas, haverá apenas uma diminuição mínima no crescimento do tumor, a curto prazo.

Teoricamente, a identificação e caracterização do CSCs pode permitir o desenvolvimento de modalidades de tratamento que têm como alvo as células-tronco do câncer, em vez de as células que se dividem rapidamente no câncer.

a exposição prolongada dos seres humanos e animais experimentais para as condições gravitacionais alterados de voo espacial tem efeitos adversos sobre diferentes sistemas celulares. Os efeitos do ambiente hypogravity sobre o crescimento do tumor e carcinogênese ainda são desconhecidas e este campo de investigação ainda carece de investigação sistemática sobre a expressão gênica hypogravity induzida, que é a informação chave necessária para finalmente desdobre o mecanismo por trás doenças induzidas pelo hypogravity. Para este fim, temos estudado os efeitos da hypogravity simulada sobre as células de osteossarcoma humano cultivadas no biorreator hydrofocusing NASA-desenvolvido (HFB) e no sistema de cultura celular rotativo (RCCS). Vários modelos de vasos rotativos de parede foram usadas para criar um ambiente de cultura tri-dimensional com tensão de corte variável e hypogravity simulando que no espaço [25]. O HFB (Celdyne, Houston, TX) desenvolvido pela NASA no Centro Espacial Johnson, é uma cúpula cheio de líquido, que gira a uma velocidade especificada e tem um botão rotativo cónico para fornecer uma capacidade hydrofocusing única que permitirá um extremamente baixo cisalhamento ambiente de cultura e uma membrana de transferência de gás de nylon [25]. O RCCS consiste de um recipiente de cultura oxigenado rodado horizontalmente por uma membrana de transferência de gás plana de borracha de silicone [26]. O bioreactor HFB NASA concebida e do RCCS têm sido utilizados com sucesso na Terra e no espaço, para permitir aos investigadores utilizar hypogravity modelado real ou, respectivamente, para estudar o papel da gravidade sobre a formação de modelos tridimensionais de tecido de células de mamíferos e produção de bio-produtos [25], [27], [28], [29], [30], [31].

neste estudo mostram que as células-tronco cancerosas são estimuladas a proliferar quando são cultivadas nas condições hypogravity produzidos pela HFB e que a redução da gravidade simulada no HFB sensibiliza CSCs a agentes quimioterapêuticos.

resultados

Osteosarcoma células estaminais do tipo proliferam na Hydro-Focando Bioreactor ( HFB), mas não no sistema de cultura de células rotativo (RCCS)

hypogravity modeladas é uma condição na qual as células estão em queda livre constante e em que eles são capazes de crescer de uma maneira independente da ancoragem. Uma vez que os efeitos de hypogravity sobre tumores são desconhecidos, pensamos para investigar os efeitos de hypogravity modelada na ausência de tensão de cisalhamento sobre a capacidade de crescimento de células tumorais de origem embrionária diferente. Usámos um HFB desenvolvido pela NASA no centro do espaço de Johnson, a qual é composta por uma cúpula preenchido 50 ml de fluido que roda a uma velocidade especificada e que tem um botão rotativo cónico interno que hidro-concentra-se a cultura de células que permite um baixo cisalhamento ambiente.

Para nossa surpresa, descobrimos que quando um número conhecido de células Saos-2 foram semeadas no HFB, apenas uma pequena fracção destas células sobreviveram ao tratamento, independentemente da densidade celular inoculadas no biorreactor . A Figura 1A mostra que o número de células viáveis ​​Saos-2 cultivadas durante 5 dias na HFB foi dramaticamente reduzida.

A) contagem de azul de tripano de células de exclusão de células Saos-2 (células de osteossarcoma) e SAOS-2 células cultivadas na HFB, CD133 (+) células Saos-2 e CD133 (+) células Saos-2 cultivadas na HFB, e de CD133 (+) células Saos-2 e CD133 (+) Saos-2 de células cultivadas em condições normais condição de gravidade. barras cinzentas indicam o número de células colocadas no controlo no dia-1. As barras pretas indicam o número de células viáveis ​​recuperadas após 5 dias de cultura em que a condição de cultura. imagem B) campo brilhante de contraste de fase (20 ×) de 3-D de cultura (esferas) formada a partir de células Saos-2 que foram cultivadas na HFB durante 5 dias. Comprimir (superior direito) mostra uma imagem de CD133 coloração de imunofluorescência de 2-SAOS células cultivadas no biorreactor durante 5 dias. C) A citometria de fluxo gráfico da imunofenotipagem CD133 de células SAOS-2. Um anticorpo de isotipo foi utilizado como um controlo. D) tripano contagens azul celulares exclusão de uma experiência otimizada de cultura HFB de células SAOS-2 na HFB após sete dias. CD133 (+) células Saos-2 cultivadas no biorreactor foram seleccionados e proliferaram 15 vezes após sete dias. barra branca indica o número de 2-SAOS células semeadas na HFB. A barra preta indica o número de viável CD133 (+) células Saos-2 recuperados após 7 dias de cultura optimizado no bioreactor. barra a cinzento indicam o número de CD133 (+) células presentes na população parental Saos-2. Os dados são representativos de três experiências separadas que produzem resultados comparáveis.

Curiosamente, células Saos-2 cultivadas no biorreactor formado esferas celulares e parecia ser significativamente menor do que as células Saos-2 cultivadas em pratos e colhidas por tratamento com tripsina (dados não mostrados). A Figura 1B mostra uma imagem de campo brilhante de 20 × esferas formadas a partir de células Saos-2 que foram cultivadas na HFB durante 5 dias. As células foram removidas do reactor de HFB e as fotografias foram tiradas imediatamente usando um microscópio invertido com contraste de fase.

Devido à sua aparente mudança na morfologia e capacidade de formação de esferas no ambiente HFB e porque os outros demonstraram a presença de CD133 (+) células dentro sarcomas ósseos primários, bem como as linhas de células de osteossarcoma MG-63, SO-521, 0S-01-187, SO-99-01, e Saos-2 e a linha celular de condrossarcoma de CS-828 [ ,,,0],32], [33], a hipótese de que as células HFB selecionados foram CD133 (+). Para testar esta hipótese, foi immunophenotyped estas células com um anticorpo dirigido contra CD133 (Miltenyi, Alemanha), e descobriram que as células HFB seleccionado eram 100% positivo para a CD133, um marcador de células estaminais típico de origem mesenquimal (Figura 1B, o painel de inserção e a Figura 1C ). Uma vez que as células Saos-2 recuperados a partir do bio-reactor foram todos CD133 (+) (98,8%) (Figura 1C), queríamos determinar se o CD133 (+) células não só sobreviveu, mas também proliferaram no ambiente hypogravity. Para este fim, foram selecionados CD133 (+) a partir das linhas de células Saos-2 ou de células HOS utilizando um sistema MACSorting e desafiados estas células CD133 (+) para a 5 dias de execução na HFB. Curiosamente, Saos-2 ou as células HOS MACSorted com um anticorpo contra CD133 e cultivadas no biorreactor durante 5 dias aumentados em número em duas vezes (Figura 1A). A Figura 1A mostra a contagem de Trypan Blue celulares exclusão de CD133 (+)-2 SAOS células viáveis ​​recuperadas após 5 dias de cultura no biorreator.

Depois de alguns ensaios de otimização de cultura de células, fomos capazes de alcançar um aumento de 15 vezes na proliferação de CD133 (+) de cancro de células estaminais do tipo das parentais células Saos-2 ao longo de um período de sete dias com a paragem do reactor a cada 24 horas e misturando suavemente a cultura 10 vezes de um modo ortogonal ao longo de um período de um minuto, o que permitiu a redistribuição dos meios de comunicação na cúpula e mistura do nutriente com as células em proliferação (Figura 1D). A Figura 1D mostra que após um protocolo optimizado de cultura de células na HFB, é possível seleccionar a proliferar e uma população específica contida na linha celular parental Saos-2. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando várias outras linhas celulares de cancro de origem do tecido diferente e que expressam uma quantidade variável do marcador CD133 (HOS, U2OS, T98G, U87MG, DU145, LNCap, WI38, H23, Hep3B, Hela, MEWO, HO-1 células, HN12 e HN30), ver Tabela 1, e os dados não mostrados.

Outra bioreator que simula hypogravity, o mL sistema de cultura de células 50 rotativo (RCCS) [26] fabricado pela Synthecon (Houston, TX), foi usado para comparar os resultados gerados utilizando o HFB. Em uma experiência paralela em que foi semeado um número igual de células Saos-2 no mesmo incubador de cultura de tecido com condições idênticas de velocidade de rotor, CO2, a temperatura e o volume do reservatório (50 mL), a HFB aumento CD133 crescimento celular (+) a partir de células Saos-2 em comparação com o navio RCCS e para o controle da gravidade da terra. 5 × 10∧6 células Saos-2 foram semeadas nos biorreactores HFB ou RCCS dos quais 350.000 (7%) foram CD133 (+) e 4.650.000 CD133 (-) (Tabela 2). meios de cultura, oxigenação, velocidade, temperatura e CO

2 foram mantidas consistentemente constante para os dois sistemas de cultura e na mesma incubadora para um 7-dias prazo. Depois de um prazo de 7 dias, os vasos foram colhidos e as células foram feitas reagir com um anticorpo contra CD133 fluoresceína (Miltenyi, Alemanha) e contadas usando um BD Facs Aria citómetro de fluxo. Um anticorpo de isotipo foi utilizado como controlo. A partir da comparação das duas culturas de biorreactor, que mostrou que um (+) aumento de 15 vezes em células CD133 (+) número de células (5,370,960 CD133 + células) foi conseguida usando o HFB em um de 7 dias de execução. Nenhuma proliferação de células CD133 (+) foi observada na cultura derivada a partir do vaso de cultura RCCS. O vaso de cultura em vez RCCS mostrou uma redução drástica na população de células CD133 (+) [(-) 4,8 diminuição dobra] a partir do número de CD133 (+) células cultivadas em biorreactores em dia 0 (Tabela 2). Na verdade, o número de CD133 células Saos-2 (+) diminuiu de 350.000 para 72.800 em um 7-dia correr na RCCS, enquanto o HFB crescido SAOS-2 CD133 (+) células aumentou de 350.000 para 5.370.960, durante um período equivalente de tempo.

por causa desta diferença dramática no crescimento de células Saos-2 CD133 (+) nos dois biorreatores hypogravity geração (HFB e RCCS), quisemos verificar se o pH pode ser um variável que os efeitos sobre o crescimento celular observada. Portanto, foi medido o pH dos meios de comunicação do HFB e biorreactores RCCS mantidos no mesmo incubador com um nível

2 CO fixado em 5% e a uma temperatura constante de 37 ° C antes e depois de um período de 7 dias. Nós comparamos o pH do meio do HFB e os vasos RCCS com os meios condicionados de células de controlo cultivadas em uma placa de Petri em condições de gravidade terra contra a meio D-MEM não gasto. Não houve diferença estatisticamente significativa foi encontrada entre as diferentes condições de cultura celular, repetindo os experimentos três vezes. Na verdade, a forma não gastas apresentava um pH de 7,82 ± 0,04. Meio de controlo SAOS-2 células cultivadas numa placa de Petri em condições normais de gravidade apresentava um pH de 7,96 ± 0,23; forma a partir de 2-SAOS células cultivadas na HFB tinha um pH de 7,71 ± 0,23; e meio a partir de 2-SAOS células cultivadas no biorreactor RCCS apresentava um pH de 7,9 ± 0,11, demonstrando que a diferença de crescimento de CD133 (+) células Saos-2 observados entre o RCCS e vasos HFB não era devido a alterações no pH na meios de cultura.

células de osteossarcoma morrem por apoptose no biorreator Hydro-Focando (HFB)

uma vez que apenas uma pequena fração do osteossarcoma SAOS-2, bem como as células HOS colocado na célula HFB sistema de cultura foram recuperados após 3 ou 5 dias de cultura, foi testado se estas células estavam a ser eliminado a partir da população inicial, fazendo com que eles se submeter a apoptose. Portanto, foram comparadas as taxas de apoptose de células Saos-2 cultivadas na HFB para 3 e 5 dias para MACSorted CD133 (+) células cultivadas na HFB para 3 e 5 dias.

Para este fim, têm analisados ​​Saos-2 de células cultivadas durante 3 dias ou 5 dias no biorreactor e descobriram que as células Saos-2 cultivadas na HFB durante 3 ou 5 dias morrem por apoptose como demonstrado por um ensaio de citometria de fluxo de Anexina-V e de propídio coloração com iodeto de amostras (Figuras 2 B e D). 24% das células foram encontrados em apoptose após 3 dias de cultura na HFB. Curiosamente, a fracção de células que morrem por apoptose aumentou para 62% após 5 dias de cultura na HFB, confirmando a observação inicial (Figura 1). Mais importante, as amostras de CD133 (+) células crescidas na HFB durante 5 dias não mostram um tal aumento na apoptose por coloração com anexina V MACSorted quando comparado com a amostra de controlo (Figura 2E e F). Nas mesmas condições de cultura do HFB, o CD133 (+) células proliferam enquanto que o CD133 (-). As células morrem por apoptose em vez

A) Anexina V-coloração de células Saos-2 cultivadas em 1-L por 3 dias. A análise permite fazer a distinção entre o diagrama em células vivas (quadrante inferior esquerdo), células apoptóticas precoces (quadrante inferior direito), as células apoptóticas (quadrante superior direito), e de células necróticas (quadrante superior esquerdo). B) Anexina V-coloração de células Saos-2 cultivadas na HFB durante 3 dias. C) A coloração por anexina-V de células Saos-2 cultivadas em 1-L durante 5 dias. D) A coloração por anexina-V de células Saos-2 cultivadas na HFB durante 5 dias. E) A coloração por anexina V-CD133 de (+) MACSorted células Saos-2 que foram cultivadas em 1-L durante 5 dias. F) A coloração por anexina V-CD133 de (+) MACSorted células Saos-2 que foram cultivadas na HFB durante 5 dias. L) Relativa a actividade da caspase-3 de células Saos-2 (população total) cultivadas durante 5 dias na HFB em comparação com células Saos-2 (população total) cultivadas em condições estáticas 1G.

Temos também investigou este fenómeno por medição da actividade de caspases, utilizando um kit de caspases colorimétricos que mede a actividade de caspases-3 nas amostras. De acordo com os dados apresentados descobriu-se que as células Saos-2 (população total) cultivadas na HFB durante 5 dias mostraram um aumento de 1,6 vezes na actividade de caspases-3 detectada (figura 2 g), que é uma medida da apoptose índice nestas células.

Stem marcador de células expressão aumenta na sequência cultura no biorreator Hydro-Focando

Talvez o mais intrigante capacidade conferida pela rotação sistema de biorreator, baixo cisalhamento é a oportunidade de estudar , sob condições controladas, a interacção das células de um determinado tipo ou a interacção de uma célula com um outro tipo, quando as células em suspensão são livres para formar as suas próprias associações. Quisemos analisar os níveis de vários marcadores relacionados com o desenvolvimento de células estaminais mesenquimais de expressão de origem. A expressão de CD133, CD34, CD38, osteocalcina, Sparc, Sox-9, RUNX-2, Stro-1, CD117 /c-Kit, OCT3 /4, Endoglin, e Integrina-SS1 foi examinado por citometria de fluxo. A Figura 3A mostra a percentagem de células fluorescentes dos diferentes marcadores analisados ​​em células Saos-2 cultivadas em condições estáticas e após cultura na HFB durante 5 dias. Os níveis de expressão e o número de células que expressam os marcadores analisados ​​aumentada após 5 dias de cultura no recipiente de HFB em comparação com células cultivadas em condições normais de gravidade. Interessantemente, as células Saos-2 cultivadas em vaso HFB mostrou o maior aumento relativo no número de células positivas para Sox-9, CD133, osteocalcina, Integrina-SS1, Sparc, RUNX-2, e Endoglin (94,7%, 89,3% , 82%, 81,8%, 81,3%, 79%, e 76%, respectivamente), quando comparado com SAOS-2 As células cultivadas sob condições normais de gravidade. OCT3 /4, CD117, Stro-1 e CD34 também mostraram um aumento do número do número de células positividade (75,9%, 67,5%, 47,6%, 22,36%, respectivamente) comparando 1G-crescimento contra células Saos-2 cultivadas em simulado hypogravity durante 5 dias. Não foi encontrada nenhuma mudança no número de células positivas para CD38, nas mesmas condições. A experiência foi repetida 5 vezes com resultados comparáveis ​​e os desvios padrão foram calculados e são reportados no diagrama como barras de erro. A Figura 3B mostra um exemplo de imunofluorescência e positividade das células SAOS-2 para CD133, Sox-9, Sparc, e CD117 /c-Kit após um crescimento no vaso HFB durante 5 dias.

A) Diagrama os níveis de expressão de vários marcadores biológicos. barras alfazema indicam a percentagem de células que expressam níveis basais dos vários marcadores de células parentais em SAOS-2 cultivadas em condições de gravidade 1-L normal (controlo). barras roxas indicam a percentagem de células que expressam os diferentes marcadores em CD133 (+) MACSorted células Saos-2 que foram isoladas a partir de células Saos-2 parentais em cultura em condições normais de gravidade 1-G. as barras amarelas indicam a percentagem de células que expressam os diferentes marcadores em CD133 (+) MACSorted células Saos-2 que foram cultivadas em condições hypogravity. Luz barras azuis indicam a percentagem de células que expressam os diferentes marcadores em células parentais Saos-2 que foram cultivadas em condições hypogravity durante 5 dias, resultando numa população de selecionado e proliferaram CD133 (+) células Saos-2. B) imunofluorescência (40 vezes) e positividade da SAOS-2 células para CD133, Sox-9, SPARC, e CD117 /c-Kit após um crescimento no biorreator para 5 dias.

CD133 (+) células crescem tridimensionalmente na Hydro-Focando biorreator e formam esferas

a SAOS-2 CD133 (+) enriquecido células de osteossarcoma proliferam e montar tridimensionalmente como sarcospheres após 3 dias de cultura no biorreator , que é ainda outra característica de crescimento de células estaminais. Figuras 4 A e B mostra em 10 e 40 × poder de ampliação, respectivamente, os sarcospheres crescido no biorreator depois de 3 dias de cultura em hypogravity simulado. Curiosamente, o CD133 (+) células Saos-2 que foram cultivadas em hypogravity simulada foram capazes de restabelecer a linha celular parental (constituída por cerca de 10% ± 6,8 CD133 (+) células e 90% ± 6,8 CD133 (-) células ) depois de um período de uma semana, quando semeadas em placas de cultura tratadas, o que permite as células aderentes para anexar ao ambiente de plástico. Figura 4 C e D (10 × 40 × e, respectivamente) mostram a CD133 (+) células proliferaram e seleccionados com a HFB que foram subsequentemente cultivadas em placas de cultura de tecido anexando Saos-2. Na cultura de células reconstituído algumas células não-aderentes foram perceptível; estes poderiam ser células-tronco-like, também conhecidas como células-tronco do câncer.

A) HFB crescido células SAOS-2 de osteossarcoma (CD133 +) são capazes de proliferar e montar tridimensionalmente como sarcosheres após 3 dias de cultura em o bioreactor (10 x de ampliação). B) HFB células de osteossarcoma SAOS-2 cultivadas (CD133 +) são capazes de proliferar e montar tridimensionalmente como sarcosheres após 3 dias de cultura no bioreactor (ampliação de 40 ×). C) HFB células de osteossarcoma SAOS-2 cultivadas (CD133 +) semeadas numa placa de cultura de plástico irradiados, reconstituir o fenótipo anexado normal das células parentais Saos-2 após uma semana de cultura (10 x de ampliação). As setas indicam a CD133 (+) células Saos-2 que mostram um fenótipo fracamente arredondada e fixação. D) HFB células de osteossarcoma SAOS-2 cultivadas (CD133 +) semeadas numa placa de cultura de plástico irradiados, reconstituir o fenótipo anexado normal das células parentais Saos-2 após uma semana de cultura (40 x de ampliação). Arrow pontos em CD133 (+) células SAOS-2 mostrando um fenótipo arredondado e fracamente anexando.

Sabe-se que as células estaminais-como irá formar esferas de células quando cultivadas em placas de ultra-baixa anexando. Por isso, testou a capacidade de CD133 (+) SAOS-2 células para formar grupos de células MAC-ordenadas, se colocadas em placas de ultra-baixa anexando. A sua capacidade para formar agregados era menos eficiente quando comparado com as células que foram cultivadas no biorreactor hydrofocusing, mas que ainda eram capazes de formar esferas. Figura 5 A e B mostram esferas formadas por CD133 (+), as células em pratos de ultra-baixa anexando Saos-2. Nós também testou a capacidade da SAOS-2 CD133 (+) MACSorted e células enriquecidas para fixar a placas de cultura de tecidos e para reconstituir a linha celular parental Saos-2. Como esperado, o MACSorted CD133 (+) células enriquecidas colocado em fixar placas de cultura de tecido após ter sido cultivadas em pratos de ultra-baixa fixação de duas semanas, reconstituída a linha celular parental Saos-2 após uma semana de cultura, anexando para o prato, manifestando um fenótipo achatada e diferenciada ao longo do tempo. A Figura 5C e D mostra células aderentes Saos-2 derivadas de CD133 (+), as células cultivadas em placas de cultura de tecido aderente MACSorted. Figura 5 E mostra a linha de células Saos-2 reconstituído após 10 dias de inoculação de CD133 (+) células enriquecidas em pratos de cultura de tecidos aderentes.

células SAOS-2-A) MACSorted CD133 (+) montar três dimensionalmente como sarcosheres após 2 semanas de cultura em placas de ultra-baixa anexando (20 × ampliação). B) Um outro exemplo de MACSorted CD133 (+) células Saos-2 que formam Sarco-esferas após 2 semanas de cultura em placas de ultra-baixa fixação (10 x ampliação). células C) de osteossarcoma SAOS-2 derivadas a partir de culturas tridimensionais cultivadas em pratos de ultra-baixa anexando semeadas em pratos de fixação mostram um aderente um fenótipo diferenciado após 3 dias. células D) Saos-2 osteossarcoma derivados a partir de culturas tridimensionais cultivadas em pratos de ultra-baixa anexando semeadas em pratos de fixação mostram um aderente um fenótipo diferenciado após 5 dias. E) Saos-2 células de osteossarcoma decorrentes de culturas tridimensionais cultivadas em placas de ultra-baixa anexando semeadas em anexando pratos mostram um fenótipo aderente e diferenciada após 10 dias.

Uma indicação adicional de que duas populações distintas são identificáveis ​​na linha de células Saos-2 é a evidência de que a CD133 (+) MACSorted células Saos-2 foram melhorada capacidade para crescer em agar mole, quando comparados às células parentais. As células foram plaqueadas em placas de 6 poços que executam 6 repetições de cada ponto experimental. O mesmo número de células Saos-2 e de CD133 (+) células Saos-2 (5 x 10

3 células /poço) foram semeadas em 6 réplicas em um prato de seis poços. A eficiência de CD133 (+) células Saos-2 para crescer em agar mole e de montar em estruturas tridimensionais é muito maior do que o das células parentais Saos-2. Seiscentos e quarenta e ± 240 colónias foram contadas a partir das-ágar macio placas de 6 poços semeados com o CD133 (+) SAOS-2 enriquecido células em comparação com apenas 20 ± 12 colónias, contados a partir os pratos soft-agar semeado com o CD133 (- ), as células Saos-2. Curiosamente, 120 ± 80 colónias foram contadas a partir dos pratos de soft-agar semeadas com as progenitoras de células Saos-2, o que sugere que a capacidade de formar colónias em soft-agar pode ser devido à presença de uma fracção (consistentemente, cerca de 10% ± 6.8) de células-tronco como no interior da linha de células Saos-2 que tem no nosso laboratório (Tabela 3). A Figura 6 mostra um exemplo de um ensaio de agar mole realizado com a linha celular de tumor parental (Figura 6A) ou com o CD133 (+) fracção enriquecida de células Saos-2 (Figura 6B). As células parentais SAOS-2 esferas, mas com uma eficiência muito baixa quando comparado com o CD133 enriquecido (+) células formadas.

A) microscopia de contraste de fase de um ensaio de agar suave de células parentais SAOS-2. B) A microscopia de contraste de fase de um ensaio de agar mole de HFB CD133 (+) proliferaram células Saos-2. C) propídio fluxo de iodeto de análise de citometria de células Saos-2 cultivadas em cultura de 1 L classificados por seu estado CD133 mostrando duas populações distintas: o CD133 (+) e CD133 (-) células com um perfil de ciclo celular diferente. D) Imunofenótipo de 2-SAOS células cultivadas em 1-L versus cultura HFB que mostra que as células Saos-2 cultivadas durante 5 dias na hypogravity simulado conter a maior parte das células coradas para o Ki-67 e, por conseguinte, na fase S do ciclo celular

Outra evidência de que há duas populações distintas na linha de células Saos-2, o que parece ser composto de CD133 (+) e (-). as células, é que estes duas populações diferentes têm um perfil de ciclo celular distinta. Foi realizada uma citometria de fluxo de 2-SAOS células cultivadas em cultura 1G e descobriram que SAOS-2 CD133 (+), as células, que foram classificados por seu estado CD133 e coradas com iodeto de propídio, tinha um perfil de ciclo celular diferente no que diz respeito ao CD133 (+) população. A Figura 6C mostra um ensaio de citometria de fluxo representativas de SAOS 2-células demonstram que o CD133 (-) Saos-2 população tinha 13,8% de células na fase G2 /M do ciclo celular, enquanto que as células CD133 (+) mostraram uma maior fracção (49%) de células em fase G2 /M do ciclo celular. Resultados comparáveis ​​foram obtidos em experiências em paralelo e repetidas.

Curiosamente, células Saos-2 cultivadas no biorreactor durante 5 dias e coradas com um anticorpo anti-CD133 (Miltenyi, Alemanha) e o marcador de proliferação anti-Ki-67 revelou um aumento da proliferação das células em comparação com as células Saos-2 cultivadas em culturas em 1G. A Figura 6D mostra um fluxo representativo ensaio de citometria de células Saos-2 que demonstram que as células cultivadas na HFB proliferam a uma velocidade diferente do que a população total de células Saos-2. Na verdade, a fracção de CD133 (+) células Saos-2, que são também positivo para Ki-67, aumentou de 14,27% a 53,98% de células comparando cultivadas in 1G-crescimento contra essas células em cultura durante 5 dias em HFB simulado condição hypogravity , respectivamente. Foram obtidos resultados comparáveis ​​em experiências paralelas e repetidas.

hypogravity simulado aumenta a apoptose e sensibiliza células-tronco cancerígenas à quimioterapia

CSCs são pensados ​​para ser responsável por iniciar e manter a doença. Alguns tipos de tumores são altamente resistentes à quimioterapia e outras formas de tratamento.