Abstract

Fundo

níveis de metilação de repetições genômicas, tais como elementos longos intercaladas nucleotídeos (Linha-1) são representativos de metilação mundial status e desempenham um papel importante na manutenção da estabilidade do genoma. O objetivo do estudo foi avaliar LINE-1 estado de metilação no câncer colorretal (CRC) em relação à progressão adenomatosa e malignos, a heterogeneidade do tecido, e TNM-palco.

Metodologia /Principais Achados

DNA foi colhido por microdissecção a laser de captura (LCM) do normal, adenoma, e tecido de câncer de 25 pacientes com TisN0M0 e de 92 pacientes CRC primárias de vários TNM-estágios. As secções de tecido embebidos em parafina foram tratados pela

in-situ

DNA de sódio modificação bissulfito (SBM). LINE-1 índice de hipometilação (LHI) foi medido por análise quantitativa absoluta de alelos metilados (AQAMA) em tempo real PCR; um índice maior indicou hipometilação reforçada. LHI em condições normais, mesenquimal cancro, adenoma, e tecido CRC foi de 0,38 (DP 0,07), 0,37 (DP 0,09), 0,49 (DP 0,10) e de 0,53 (DP 0,08), respectivamente. LHI foi significativamente maior no tecido adenoma comparado com o seu epitélio normal contígua (

P

= 0,0003) e tecidos mesenquimais câncer (

P Art 0,0001). LHI não diferiram significativamente entre adenoma e tecido precoce do câncer de estágio Tis (

P

= 0,20). LHI elevada com maior T-estágio (

P Art 0,04), foi significativamente maior nos gânglios positivos do que os pacientes de CRC linfonodos negativos (

P

= 0,03), e foi significativamente maior em estágio IV do que todas as outras fases da doença (

P Art 0,05).

Conclusão /Significado

usando

célula

SBM e LCM in-situ selecção demonstramos início precoce de lINE-1 desmetilação durante a mudança adenomatosa de células epiteliais colorretais e demonstrou que a progressão desmetilação lINE-1 é linear em relação à progressão TNM-estágio

Citation:. Sunami e, de Maat M, Vu A, Turner RR, Hoon DSB (2011) lINE-1 hipometilação Durante Colon Cancer primária progressão. PLoS ONE 6 (4): e18884. doi: 10.1371 /journal.pone.0018884

editor: Chun-Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 12 de outubro de 2010; Aceito: 24 de março de 2011; Publicação: 14 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Sunami et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os estudos foram apoiados pela Fundação Weil Família (Los Angeles, CA) e da Leslie e Susan Gonda (Goldschmied) Foundation (Los Angeles, CA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Aproximadamente 17-18% do genoma humano é constituído de longa elemento de nucleotídeos intercaladas (lINE-1) repete. Cerca de 500.000 truncado e 3.000 a 5.000 sequências de comprimento total LINE-1 estão presentes ao longo do genoma [1]. Em células somáticas normais, line-1s são fortemente metilado, restringindo as atividades de elementos retrotransposal e, assim, prevenir a instabilidade genômica [2], [3]. seqüências LINE-1 são moderadamente CpG rico, e CpGs mais metilados estão localizados na região 5 ‘e pode se comportar como promotores internos [2]. LINE-1 estado de metilação é pensado para representar o estado de metilação do DNA do genoma, uma vez que as sequências LINE-1 são altamente repetido, retrotransposons humanos amplamente intercaladas. Vários estudos têm mostrado uma relação de eventos genômicas importantes na carcinogênese colorretal em LINE-1 metilação. Por exemplo, 18q perda de heterozigosidade (LOH) (+) cancro colorectal (CRC) mostram uma LINE-1 nível de metilação inferior médio [4]. Uma relação inversa tem sido relatada entre LINE-1 metilação e microssatélites instabilidade (MSI) + /CPG ilha methylator fenótipo mutação V600E (CIMP) + /BRAF CRC [5], [6]. Não foi recentemente relataram uma significativa correlação inversa entre os níveis de LINE-1 metilação e o número total de aberrações cromossómicas, incluindo tanto perdas e ganhos em tumores estromais gastrointestinais (GIST) [7]. No que diz respeito CRC, Bariol et ai. revelou que o nível de DNA hipometilação global, foi maior nas lesões neoplásicas (incluindo pólipos hiperplásicos e adenoma) do que na mucosa normal [8].

Um problema importante na avaliação de LINE-1 estado de metilação no CRC é que CRC é altamente heterogénea e contém várias células que se infiltram, tais como células do estroma, os linfócitos e os vasos sanguíneos. O componente estromal ea extensão da infiltração de linfócitos varia muito entre os CRCs. Esta heterogeneidade pode confundir análise molecular, especialmente de LINE-1 estado de metilação, como LINE-1 é metilado em células normais. A fim de obter interpretações precisas, por conseguinte, é necessário isolar especificamente células tumorais a partir de amostras de tecido. fase inicial CRC análise tumor primário sem microdissection dirigiu-histopatologia para avaliação do estado de metilação do genoma não é preciso. Isto é particularmente uma questão problemática quando se avalia a progressão CRC e ao comparar adenoma de tecido de câncer. técnicas robustas e precisas para tais análises não existem; Por isso, desenvolvemos uma abordagem prática. Utilizamos microdissecação a laser de captura (LCM), a colheita das células de interesse directamente, sem contaminação de células não-cancerosas. Modificação com bissulfito de sódio (FS) de ADN genómico é um método vulgarmente utilizado para discernir estado de metilação de ilhas CpG [9]. SBM métodos convencionais resultam em 84% a perda de 96% de amostra de ADN [10]. Esta perda significativa de ADN molde necessita de um grande volume de amostra de tecido de partida. Para reduzir a perda de amostra de ADN a partir de células recolhidos pelo LCM, desenvolvemos um

protocolo

SBM in-situ. O DNA foi modificado enquanto que as células capturadas ainda estão ligados na tampa LCM

.

Numerosos estudos têm sido relatados identificar aberrações epigenética CRC-associados, tais como a hipermetilação da região promotora dos genes supressores tumorais. Outra alteração característica no CRC em relação ao estado de metilação do DNA é hipometilação global, [11], [12]. A progressão da Linha-1 hipometilação nível durante o desenvolvimento da malignidade CRC e a progressão da doença não foi rigorosamente avaliada. Determinar a histopatologia associada com o início da perda de LINE-1 metilação ea tendência de LINE-1 metilação ao longo do eixo de progressão estágio da doença poderia esclarecer melhor o papel de LINE-1 hipometilação na doença CRC. Neste estudo, LCM,

in-situ

SBM, e quantificação absoluta de alelos metilados (AQAMA) foram utilizados em combinação em amostras de pacientes com adenomas contendo

in situ

adenocarcinoma invasivo (Tis) e pacientes com CCR mais avançada. Isto permitiu uma análise precisa bem sucedida de LINE-1 níveis hipometilação durante a progressão do tumor primário entre T-estágios progressivos, nódulo positivo versus negativo nó e metastático distante versus local e loco-regional.

Resultados

AQAMA linearidade para lINE-1 nível de metilação avaliação

em primeiro lugar, foi avaliada a precisão dos AQAMA para avaliar vários níveis de lINE-1 metilação. A principal vantagem da AQAMA é que a medição quantitativa de alelos metilados e não metilados é realizado em uma única reacção de PCR, proporcionando um excelente controlo em comparação com duas reacções de PCR separadas para análise alelo metilado e não metilado. A quantificação é absoluta com curvas padrão para determinar o número de cópias. Para um controlo negativo, a reacção de ensaio continha ADN de controlo não metilado universal que foi sintetizado tal como descrito num estudo publicado anteriormente [13]. Para um controlo positivo, utilizou-se ADN de controlo metilado universal extraído a partir de linfócitos de sangue periférico de um dador saudável e tratou-se com

SSSI metiltransferase.

Para este estudo, foram preparadas misturas gradual do padrão de ADNc metilado e não metilado e mediu como amostras com nível de metilação desconhecido. A linearidade do ensaio AQAMA para LINE-1 nível de metilação (Figura 1) foi avaliada pelo coeficiente de linearidade de Pearson: 0,99 (

P Art 0,001), que mostrou alta precisão em LINE-1 diferenças de nível de metilação exigentes.

Lote de medidas (caixas) e esperada (x) os valores mostrando precisão do ensaio do AQAMA lINE-1.

Otimização de

configurações

SBM in-situ

LCM foi realizada a colheita de células de interesse (Figura 2a) para obter uma representação precisa das células em questão para a medição AQAMA bem sucedida. Três áreas de tecido de amostra diferentes de 10

4, 10

5 e 10

6 mm

2 colhidas a partir de 4 mm de espessura de tecido de arquivo incluído em parafina (PEAT) foram testados. Através da análise, constatamos que 2 × 10

5 m

2 de 4 resultados PEAT mm de espessura em cerca de 10

5 números de cópias de LINE-1 DNA. Isto proporcionou níveis reprodutíveis significativos de ADN ensaio metilação LINHA-1. Depois de LCM,

in situ

SBM foi optimizado de um modo semelhante como foi realizada nos estudos anteriores de SBM sobre-lâmina utilizando amplificação sequência genómica específica [14]. As taxas de conversão de DNA modificado por

in-situ

SBM foram 18,4 ± 14,9%, 87,8 ± 7,8% e 94,4 ± 2,1% no ajuste de incubação de 60 ° C durante 2, 4 e 8 horas, respectivamente (Figura 2b). As taxas de conversão aumenta com a duração de incubação, em que depois de 8 horas atingiu cerca de 95%. O rendimento de ADN total (modificado e não modificado do ADN) não diminuiu com o aumento do tempo de incubação até 8 horas (Figura 2C). A partir destes resultados, uma configuração de incubação de 60 ° C durante 8 horas foi escolhida como óptima para

in situ

SBM.

A mostra pick-up específica de células alvo por LCM. B e C mostram resultados para a taxa de conversão de DNA (%) e para conteúdo de DNA (× 10

4 números de cópias), respectivamente, em 8 amostras diferentes em 3 diferentes períodos de incubação.

linha- 1 níveis hipometilação durante CRC progressão

foram selecionados Vinte e cinco pacientes com lesões TisN0M0 com presença de normal, adenoma (baixo ou intermediário grau) e as células cancerosas Tis na mesma secção de tecido. Usando LCM, quatro amostras de tecidos diferentes (mucosa, adenoma, câncer e tecidos normais mesenquimais cancro) foram coletadas de cada paciente.

In-situ

SBM e ensaio AQAMA LINE-1 foram realizados em cada amostra. O nível de LINE-1 hipometilação (LHI) foi calculado como Q

unmeth /(Q

unmeth + Q

meth), onde Q

unmeth e Q

meth são os números de cópias absolutos de não metilado e metilado LINHA-1, respectivamente. Na mucosa normal adjacente às lesões tumorais e mesênquima câncer, o LHI média foi de 0,382 e 0,366, respectivamente. Não houve diferença de LHI entre mesênquima câncer e mucosa normal adjacente ao tumor. LHI foi significativamente maior no adenoma e câncer de tecidos contíguos da fase inicial do que na mucosa normal (média LHI = 0,49, 0,52, e 0,38, respectivamente) (Figura 3). A partir desses resultados, concluímos que LINE-1 hipometilação ocorre na fase inicial do CRC tumorigênese. Além disso, estas experiências demonstraram a necessidade de utilizar procedimentos detalhados para a recolha de ADN quando se analisa LINHA-1 níveis de metilação, tais como o isolamento de células alvo, por LCM. Com base neste, LCM foi utilizado para a coleta de amostra de DNA para todos os experimentos em nossos estudos.

LINE-1 hipometilação e tecido heterogeneidade

Na análise da LHI do normal, mesenquimais cancro, adenoma, e tecido de CRC, foi de 0,38 (DP 0,07), 0,37 (DP 0,09), 0,49 (DP 0,10) e de 0,53 (DP 0,08), respectivamente. Para testar se existe heterogeneidade da Linha-1 hipometilação dentro de um tumor, 20 tumores T3N0 foram selecionados para análise. DNA amostra foi coletada a partir da superfície luminal e o mais profundo local invasional de cada tumor. LHI desses dois loci foram comparadas (Figura 4). A média foi de 0,58 LHI na superfície e 0,54 nos loci mais profunda. LHIs foram semelhantes na superfície e no mais profundo loci e tumor heterogeneidade dos LINE-1 hipometilação não foi observado.

Os valores LHI medidos em tumores T3N0 CRC comparando células obtidas a partir da área do tumor luminal superfície para o tumor invasão profunda área.

lINE-1 hipometilação e CRC estágio

para avaliar a alteração de lINE-1 níveis hipometilação de acordo com a progressão do tumor, foi analisada a correlação entre os estágios duques e LHI. Dukes A (n = 38), Dukes B (n = 18), e Dukes C (n = 29) foram seleccionadas amostras (Figura 5c). O LHI significativo em Dukes A, B e C foi de 0,533, 0,607, e 0,621, respectivamente. Dukes B e C tumores mostraram significativamente maior LHI do que os tumores Dukes A. A relação entre a linha-1 metilação e T-estágio (T1 (n = 24), T2 (n = 21), T3 (n = 21), e T4 (n = 26)) assim como N-estágio (N0 ( n = 57) e N1 (N = 35)) foram analisados. O aumento de LHI de acordo com a invasão do tumor (Figura 5a) e a diferença entre casos de LHIs linfonodo positivos e negativos (Figura 5B) foram avaliadas. A média LHI de T1, T2, T3, e T4 foi de 0,50, 0,58, 0,60, e 0,65, respectivamente. LHI foi significativamente maior (

P

= 0,03) para os casos com linfonodos positivos (LHI = 0,64) do que os linfonodos negativos (LHI = 0,54). A previsão de estado nodal seria o mais clinicamente relevante e, portanto, uma curva de operação do receptor (ROC) foi analisada para distinguir se metástase positivo pode ser um indicador de prognóstico da CRC primário por meio de LHI (Figura 6). T-estágio avanço correlacionadas significativamente com o aumento LHI (

P

= 0,01). Analisamos também os casos com doença à distância spread (Dukes D, n = 6), e esses casos mostraram significativamente maior em comparação com LHI Dukes C CRCs (

P

= 0,05) sozinho e para todas as outras fases Duke (

P Art 0,0001). Um ROC foi construída para exibir a precisão de previsão do envolvimento ganglionar pelo LHI (Figura 6). Esta mostrou que o valor preditivo tinha uma sensibilidade de 0,77 com uma especificidade de 0,62. Houve significativamente menor LHI para do lado direito contra cólon do lado esquerdo (

P Art 0,05). No entanto, não foram observadas diferenças significativas entre LHI para o status de diferenciação ou sexo.

Em A, B e C diferenças são mostrados entre estágio de Duke, T-palco e N-estágio, respectivamente.

o eixo x representa 1-especificidade e a sensibilidade do eixo y. A área sob a curva (AUC) foi calculada a 0,69. P = 0,003.

Estas análises mostraram uma relação linear positiva entre a progressão de LINE-1 hipometilação e progressão fase CRC.

Discussão

A alteração da metilação do DNA padrões tem sido estudada em muitos tipos de cancro [15]. A hipermetilação das regiões promotoras específicas de genes associados ao cancro e hipometilação de DNA global durante a progressão do tumor tenha sido agora demonstrado como uma propriedade significativa de cancros [16], [17]. A hipometilação do ADN da linha de repetição-1 que constitui 20% do genoma tem sido sugerido como um substituto para a hipometilação de DNA global, [5], [18], [19], [20]. Yang et ai. mostrou que a metilação do genoma pode ser estimada por avaliação [21]. repetições Alu são SINEs, mais complexo e diversificado do que linhas. ensaios de metilação confiáveis ​​para estudar Alu não estão bem fundamentadas. Um representante ensaio preciso para fenômeno global de metilação não existe; no entanto, LINE-1 pode servir também como um substituto.

LINE-1 hipometilação não é específica para as células cancerosas, e cerca de um terço de LINE-1 é não metilado na mucosa normal e células mesenquimais câncer [22], [23]. A possível contaminação de ADN exemplar que consiste de cancro, juntamente com as células mesenquimais, tais como fibroblastos ou linfócitos, pode, portanto, conduzir a resultados imprecisos. Por esta razão, especialmente a respeito de uma análise LINHA-metilação, isolamento precisa das células alvo é muito importante. Para minimizar a contaminação e obter células de único interesse, LCM temos integrado com sucesso em LINE-1 metilação analisa neste estudo. Avaliamos

in-situ

SBM combinado com LCM como uma abordagem para melhorar a eficiência do ensaio de metilação do DNA, que permite a avaliação de células de histopatologicamente definido regiões alvo específicas do desenvolvimento CRC estágio primário muito cedo. Um estudo recente forneceu alguma evidência de que os resultados são comparáveis ​​se macrodissection ou LCM é utilizado [24]. No entanto, isso é altamente dependente da sensibilidade do ensaio. O conceito de LCM, no entanto, é state-of-the-art e superior a macrodissection quando pequeno espécime de entrada do tecido alvo para a análise de DNA é desejada. Em primeiro lugar, quando as lesões em fase inicial pequeno precisam ser avaliados e apenas pequenas áreas de células cancerosas específicas estão disponíveis para análise, o guiada por microscopia de células pick-up fornece precisão e controle do ADN da amostra de entrada. Em segundo lugar, LINE-1 metilação não é específico do câncer e, como nossos resultados mostram, é encontrado no tecido estromal câncer. Com o entendimento atual do microambiente do tumor e da heterogeneidade do estroma do tumor, é muito importante para realizar a análise LCM para a recuperação de DNA tecido específico. Além disso, LINE-1 metilação seria esperado que variam em células adjacentes “normais” de um tumor primário desde a análise de microscopia de luz patologia não é sempre preciso para identificar a transformação celular câncer em estágio precoce.

In-situ

SBM foi concebido com base em on-slide SBM [14] que foi adaptado a partir de um conceito como relatado por Nuovo et al [25]. No slide SBM é um procedimento poderoso para a análise de metilação usando PEAT; No entanto, depois de corrediça-SBM a amostra torna-se demasiado adesivo para a lâmina de vidro, o que torna difícil para o LCM para capturar eficientemente células alvo, por vezes.

In-situ

SBM elimina as inúmeras isolamento de DNA e etapas de purificação SBM clássico, que são a principal causa da perda de DNA para avaliar pequenas quantidades de DNA a partir do número limitado de células. Nosso estudo descreve

in situ

tratamento de tecidos /células diretamente por ensaio bisulfite integrado com LCM. Uma limitação do ensaio é que a análise do estado de metilação de células individuais continua a ser difícil devido à natureza DNA degradante do protocolo SBM e DNA limitada para análise de metilação.

A combinação de LCM,

in-situ

SBM, e ensaio AQAMA, lINE-1 hipometilação foi demonstrada em baixa a adenoma de grau intermediário, numa fase inicial de desenvolvimento de neoplasias colo-rectal, como mostrado anteriormente [5], [6]. Uma diminuição significativa no LINE-1 metilação foi medida comparando adenoma com o epitélio normal adjacente. Nenhuma diferença significativa foi mostrada quando o adenoma foi comparado com o tecido etapa contíguo canceroso Tis que também foi relatado recentemente em pelo Kwon et al [26]. Este resultado difere de estudos por Ibrahim et ai. e por Irahara et ai. que as diferenças significativas encontradas de LHI entre adenomas colorretais e CRC [24], [27]. É importante notar que estes estudos não especificou o TNM-fase das amostras. A diferença não significativa entre os tecidos de adenoma e câncer em nosso estudo é explicado pelo uso de um grupo heterogêneo de tecidos de câncer a partir da fase mais precoce do cancro (

in situ

carcinoma, Tis). Nossos resultados confirmam que os níveis de LINE-1 metilação variar em diferentes TNM-estágios. Quando LHI em adenomas foram comparados com amostras mais avançada fase CRC no nosso estudo as diferenças foram significativas (dados não mostrados). Isso demonstra que não metilado LINE-1 não podem desempenhar um papel importante durante o processo quando as células de adenoma ganhar a sua primeira atividade invasiva.

O aumento da heterogeneidade encontrada em lesões maiores, avançados é uma indicação de que existem subgrupos de CRC que são capazes de manter a metilação da Linha-1. Por outro lado, observou-se que dois casos Dukes estágio D tinha um LHI de 0,9 que só foi visto neste subgrupo. A heterogeneidade é um problema clínico conhecido como a evolução da doença varia amplamente para pacientes de CRC com o mesmo TNM-palco. A diversidade dos LHIs dentro das várias fases do nosso estudo podem refletir isso. Os mecanismos que controlam a manutenção de LINE-1 metilação e como elas influenciam a progressão do tumor ainda é desconhecida.

Em um grande estudo por Baba et al [28], uma relação com o estágio da doença tem sido descrita com maior LINE- 1 desmetilação em mais avançado da doença, embora as diferenças fossem muito menores. Além disso, de acordo com os resultados do estudo, os níveis de metilação LINHA foram maiores no doença em estágio II em relação à fase I. Este estudo analisou as secções de tecido inteiro sem usar microdissection. Uma das razões para que as diferenças eram pequenos e fase II mostrou maior LINHA 1-metilação pode ser o grau de contaminação de ADN de células mesenquimais no DNA da amostra. Os nossos resultados demonstraram que não só a mucosa normal adjacente, mas também as células mesenquimais em cancro, mostra cerca de um terço da Linha-1 hipometilação. Isto suporta nossa ênfase que o isolamento de células-alvo específico é necessário. Valor prognóstico da linha de 1 níveis de metilação no CRC tem sido relatada [29]; No entanto, a variação entre a tumores pode ser um resultado da contaminação componente do estroma /mesenquimais [30].

O nosso estudo mostra uma relação linear clara positiva por passos de perda de LINHA 1-metilação para T, N, quanto bem como M-fase. Os níveis de LINHA-1 desmetilação pode, portanto, ser úteis em diversas situações clínicas. análise pré-operatória de material de biópsia CRCs que pode prever T-estágio (Tis vs. T1 ou T1 vs. T2) pode ser útil para decidir se a ressecção endoscópica (ie transanal excisão da mucosa retal) pode ser tentada versus cirurgia de ressecção aberta, que está associada com taxas de morbidez /mortalidade muito mais elevadas. predição N-fase poderia ser usado para seleccionar os pacientes de CRC para testar a eficácia da terapia neoadjuvante. Além disso, a previsão de M andares pode ser utilizado como um biomarcador para a prossecução imagem pré-operatória metastático com PET-CT, para além do padrão de trabalho para cima. Para avaliar se material de biópsia pré-operatória do tumor do lado luminal é representativa, avaliamos a heterogeneidade do tumor. A comparação entre a parte mais profunda e a superfície do tumor revelou que a heterogeneidade do tumor de LINE-1 estado de metilação é relativamente sutil. Os resultados sugerem que CRC biópsias recolhidas durante a colonoscopia são representativos e pode ser usado para avaliação da análise de estado de metilação de um tumor LINE-1. A média LHI diferiram significativamente entre o nó positivo e nó CRCs negativos; segundo o qual a análise ROC mostrou resultados discriminatórios. Houve sobreposição dos valores LHI entre a N + e categorias N0 e a sensibilidade e especificidade foram relativamente baixos. Isso também foi observado para T e discriminação M-fase. Maiores estudos são necessários para determinar a utilidade de LHI como um único biomarcador ou combinação com outros biomarcadores.

Em conclusão, o estudo demonstrou que estado de metilação LINE-1 correlaciona-se com estágio patológico da CRC. Além disso, a sua análise precisa com técnicas LCM ou equivalente é necessário, como células tumorais tecido circundante mesenquimais de apoio claramente pode influenciar os resultados. O início da LINHA-1 desmetilação ocorre muito cedo, quando mucosa colorretal normal, se desenvolve em um adenoma com baixo ou intermediário displasia. Os resultados mostraram uma correlação linear clara e significativa de progressão da perda de metilação do elemento de linha-1 a progressão da doença de CRC (Figura 7) em relação aos linfócitos T, assim como N- e M-fase. Estes achados sugerem contínua perda de metilação do genoma durante o desenvolvimento do CRC, o que indica que os altos eventos epigenômicos e assim genômicas são as principais características de progressão tumoral.

Materiais e Métodos

Medição da LINE- 1 hipometilação

O estado de metilação de lINE-1 foi avaliada por ensaio AQAMA para uma avaliação precisa do CPG níveis ilha de metilação [31]. Antes de realizar o ensaio de AQAMA LINHA-1 estado de metilação, SBM foi aplicado em cada amostra de DNA, como previamente descrito [32]. AQAMA requer uma directo e um iniciador reverso que vai amplificar a sequência-alvo independente do estado de metilação, como aqueles para a frente e reverso conjuntos de iniciadores não contêm qualquer CpG. O estado de metilação é avaliada por dois (MGB) molécula contendo sondas de ligação a-sulco menor (Applied Biosystems): uma metilação específicas e uma unmethylation específicos. O ‘, iniciador 3′ do iniciador, sonda específica de 5-metilação e a sonda específica do unmethylation são listados como se segue: 5’-GGGTTTATTTTATTAGGGAGTGTTAGA-3 ‘(para a frente), 5′-TCACCCCTTTCTTTA ACTCAAA-3’ (inverso), FAM-5 ‘ -TGCGCGAGTCGAAGT-3′-MGB-BHQ e VIC-5′-TGTGTG AGTTGAAGTAGGG-3’-MGB-BHQ. A mistura de reacção para cada AQAMA PCR consistiu em molde de ADN, 0,4 umol /L do iniciador em sentido directo e reverso, 1,4 unidades de

iTaq

DNA polimerase (Bio-Rad, Hercules, CA), 350 umol /L de cada trifosfato de desoxinucleótido e 0,025 pmol de cada sonda MGB com 5 mmol /L Mg

2 +. A amplificação por PCR foi realizada com activação por calor de pré-ciclo da DNA polimerase a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 60 seg. O número de cópias absoluta em cada amostra foi determinada utilizando uma curva padrão estabelecida por meio da amplificação de seis alíquotas duplicados de modelos com números de cópias conhecidos (10

* 6-10

* 1 cópias). Nós descrevemos anteriormente para os métodos de síntese de a amostra padrão do número de cópias conhecido no ensaio AQAMA [31]. Para um controlo negativo, a reacção de ensaio continha ADN de controlo não metilado universal que foi sintetizado tal como descrito num estudo publicado anteriormente [13]. Para um controlo positivo, utilizou-se ADN de controlo metilado universal extraído a partir de linfócitos de sangue periférico de um dador saudável e tratou-se com

SSSI

metiltransferase. Resumidamente,

SSSI metiltransferase

tratada, bissulfito modificado, doador DNA PBL foi amplificado por PCR com o conjunto de primers para criar a amostra padrão para LINE-1 totalmente metilado. Para a construção da amostra padrão para LINE-1 não metilado foi utilizado DNA controle não metilado universal, preparado como descrito anteriormente [13]. O produto de PCR completamente metilado e não metilado foi ligado num pCR 2.1-TOPO vector de clonagem (Invitrogen); os clones foram transformados em

Escherichia coli

DH5-a células; e as culturas foram expandidas como descrito anteriormente [33]. Os plasmídeos contendo o gene-alvo foram purificados e quantificado por espectrofotometria de UV. Este foi usado para fazer uma série de diluição de número de cópias conhecido para construir curvas padrão para quantificação absoluta. Todos os ensaios de PCR quantitativas foram realizadas de um modo cego sem conhecimento da identidade da amostra. Os valores médios foram calculados a partir de reacções em triplicado. LINE-1 índice de hipometilação (LHI) de cada amostra foi calculada da seguinte forma: LINE-1 LHI = número de cópias não metilado /(número de cópias metilado + número de cópias não metilado)

LCM

LCM era. utilizado para a coleta de amostra de DNA para todos os experimentos em nosso estudo. Princípios e base de LCM técnica são descritos em detalhe por Expulsa-F et al. [34]. As células foram coletadas com o sistema LCM que abriga um sistema de câmera digital que detecta as células selecionadas. Isso permite que a mesma quantidade de micrômetros quadrados de células pode ser pego para cada amostra.

In-situ

SBM otimização ensaio

Para medir LINE-1 índice de hipometilação após microdissecção usando LCM, desenvolvemos o

in-situ procedimento

SBM baseada na técnica SBM on-slide previamente introduzido.

In-situ

SBM foi concebido para analisar estado de metilação de genes em pequena quantidade de ADN obtido a partir de formalina fixada turfa.

In-situ

SBM visa eliminar passos de isolamento e purificação de ADN que são realizados antes da SBM real no procedimento clássico que é a principal causa da perda de DNA.

In-situ

SBM contém três etapas; desnaturação do DNA, SBM e coleta de DNA modificado. Em primeiro lugar, as células foram microdissecadas a partir de secções de tecido desparafinizadas e reidratadas em que furam a tampa usada em LCM são incubadas em 0,2 mol /L de NaOH à temperatura ambiente durante 15 min. Em seguida, as amostras sobre a tampa são incubadas em solução de bissulfito de sódio /L 3 moles com 0,5 mmol /L de hidroquinona (pH 5), no escuro. Três configuração de incubação foram testados em relação às taxas de conversão (a taxa de modificação da citosina em uracilo) e os rendimentos de ADN modificado e configuração de incubação de 60 ° C durante 8 horas foi escolhida como óptima (ver secção Resultados). Após a incubação, as amostras sobre a tampa foram enxaguadas com água destilada, embebido em 0,3 mol /L de NaOH durante 15 min para desulfonate as citosinas modificados, e, em seguida, removido o sal em água destilada a 60 ° C durante 2 horas. Finalmente, 50 de tampão de lise uL contendo 4 ug de proteínase K, 2,5% de Tween 20, 50 mmol /L de Tris, e 1 mmol /L de EDTA foram adicionados no tampão e incubou-se a 50 ° C durante 24 horas seguida por desactivação calor de proteinase K a 95 ° C durante 10 min. Em cada reacção AQAMA posterior, 1-2 ul ligado foi usado como um modelo sem purificação DNA.

Declaração de Ética

amostras de turfa de CRC foram obtidos de pacientes que foram submetidos a colectomia ou proctectomy entre 1995 e 1998, no Centro de Saúde /Instituto do Câncer John Wayne de São João, Santa Monica, CA. O estudo foi revisado e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional São João do Centro de Saúde /John Wayne Cancer Institute ‘(IRB) e IRB ocidental. Foi obtido consentimento escrito dos pacientes.

espécimes PEAT CRC

Todas as amostras de tecido foram fixados em formol 10% tamponado por 24 horas e parafina-embedded. Para LCM seguido de

in-situ

SBM e análise de metilação LINE-1 por AQAMA, seções (4 mm) foram cortadas com um micrótomo de cada bloco de turfa. As células foram recolhidas com o sistema automatizado Veritas® LCM (Life Technologies). Uma das vantagens deste sistema é que ele permite o controlo dos micrómetros quadrados de células que são apanhados para cada amostra. Para avaliar as diferenças de LINE-1 estado de metilação entre mucosa normal, adenoma, câncer e tecido conjuntivo mesenquimal câncer, 25 amostras de início CRC em adenoma (TisN0M0) foram selecionados por um patologista (RRT) especializada no CRC que continha todos esses quatro Categorias de tecido. Para estudar a alteração maligna, 94 espécimes CRC cirurgicamente ressecados foram adquiridos para investigar a alteração de LINE-1 estado de metilação de acordo com a progressão do câncer. LCM foi realizada em ambos os grupos de estudo. A correlação entre estágio clínico-patológico tal como o estágio T, estado nodal e estágio Dukes e LINE-1 índice de metilação foram analisados.

A análise estatística

Todos os dados são expressos como média +/- SD, e percentagens, conforme apropriado.