Abstract

Objectivos

Excluídos no câncer de fígado 1 (DLC1), um membro de RhoGTPase ativando família de proteínas (GAP), é conhecido por ter atividades supressoras no tumorigenicidade e metástase do câncer. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes de como DLC1 suprime motilidade celular não foram completamente elucidados. Rho-quinase (rock) é um efector a jusante imediata de RhoA na mediação de eventos do citoesqueleto celular e motilidade celular. No presente estudo, teve como objetivo investigar os efeitos do DLC1 na via de sinalização Rho /ROCK no carcinoma hepatocelular (HCC).

Metodologia /Principais Achados

Nós demonstramos que DLC1 regulada negativamente rock- contratilidade actomiosina dependente. Do estudo immumofluorescence, descobrimos que a expressão ectópica de DLC1 revogada Rho /mediada-ROCK reorganização do citoesqueleto incluindo a formação de fibras de stress e adesões focais. Também subregulado fosforilação cortical da cadeia leve de miosina 2 (MLC2). Estes eventos inibitórios por DLC1 foram RhoGAP-dependente, como mutante RhoGAP-deficiente de DLC1 (DLC1 K714E) aboliu esses eventos inibitórios. Além disso, a partir de estudo ocidental, DLC1 inibido relacionadas-ROCK miosina de cadeia leve fosfatase segmentação unidade 1 (MYPT1) fosforilação na Treonina 853. Ao examinar a morfologia das células ao microscópio, verificou-se que a expressão ectópica de rocha dominante-ativa as células de induzida DLC1-lançado colapso do citoesqueleto e encolhimento celular.

Conclusão

Nossos dados sugerem que DLC1 regula negativamente Rho /ROCK /MLC2. Isto implica uma via mediada por ROCHA de DLC1 na supressão de metástase de células de carcinoma hepatocelular e enriquece a nossa compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na progressão do carcinoma hepatocelular

Citation:. Wong CC-L, Wong CM, Ko FC- F, Chan LK, Ching YP, Yam JW-P, et al. (2008) Excluídos no cancro do fígado 1 (DLC1) regula negativamente Rho /ROCK /MLC Caminho no carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 3 (7): e2779. doi: 10.1371 /journal.pone.0002779

editor: Neil Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 20 Abril de 2008; Aceite: 30 de Junho de 2008; Publicado: 23 Julho 2008 |

Direitos de autor: © 2008 Wong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi financiado pelo Conselho Kong Hong Bolsas de Investigação (HKU 7436 /04M), RGC Fundo Reseaarch Collaborative (HKU 1 /06C), Michael e Betty Kadoorie Cancer Genetics Research Program 2004. IOL Ng é Loke Professor Yew em Patologia

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A migração celular envolve ciclos de passos que começam a partir do. formação de protrusão celular na vanguarda. Nos locais de saliência, adesões focais são formados para fixar o citoesqueleto, principalmente actina e miosina, com a matriz extracelular. O citoesqueleto gera a tensão que resulta em contractilidade actomiosina para translocar o corpo da célula. Finalmente, a tensão liberta as aderências de bordo de fuga da célula [1]. A desregulação em qualquer um dos passos envolvidos na migração de células pode resultar em movimento celular aberrante e, em células de cancro, metástase [2]. O carcinoma hepatocelular (HCC) é um dos cânceres mais prevalentes em todo o mundo. metástase intra-hepática é a principal causa de mortalidade em pacientes com este câncer. Por conseguinte, acreditamos que uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares que regulam a migração celular HCC pode lançar luz para o desenvolvimento de novos alvo intervenção terapêutica.

eliminados em cancro do fígado 1 (DLC1), um gene supressor de tumor, foi identificado pela primeira vez no HCC primária como um homólogo p122RhoGAP rat [3]. Em HCC, DLC1, foi encontrada a possuir capacidades supressores de tumor [4] – [6] e é underexpressed principalmente através de deleção do gene de metilação do DNA e [7] – [9]. Subexpressão de DLC1 também está implicado em outros cancros, tais como cancro da mama, pulmão, próstata e [9] – [14]. DLC1 também foi mostrado para ser regulados negativamente em células metastáticas em comparação com células não metastáticas em modelos da mama e carcinoma hepatocelular [15], [16]. A expressão ectópica de DLC1 foi encontrado para suprimir a migração celular e invasão em CHC, cancro do pulmão de não pequenas células, cancro da mama, cancro do pulmão, os modelos de linhas celulares do cancro do ovário [4], [15], [17] – [21], e a sobre-expressão de DLC1 na linha celular de cancro da mama metastático poderia atenuar tamanho e incidência de metástases pulmonares [15]. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a esta supressão do movimento celular e metástase do cancro permanecem obscuros.

DLC1 é um membro da família de proteínas de activação RhoGTPase (RhoGAP) e possui uma actividade específica para RhoGAP [8] RhoA. DLC1 regula negativamente a actividade de RhoA por aumentar a actividade hidrolítica de GTP intrínseca de RhoA, catalisando a conversão de RhoA partir do seu estado activo ligado ao GTP para o estado inactivo ligada a GDP [22]. Rho-quinase (ROCHA) é o efetor a jusante mais conhecido de RhoA [23], [24]. A ligação de RhoA libera ROCHA da sua estrutura autoinhibitory e ativa eventos mediados-rock celulares [23], [25] – [27]. ROCHA é conhecida para regular eventos celulares relacionadas com a motilidade celular. Por exemplo, ROCK foi mostrado para controlar a polaridade da célula, regulando PTEN /Akt sinalização em neutrófilos [28] e controlar a retracção da cauda em monócitos e células de cancro da próstata [29] – [31]. ROCHA contractilidade também reforçada actomiosina, um principal passo da migração de células como descrito anteriormente [32]. É importante ressaltar que o rock é uma quinase que fosforila e ativa muitos substratos a jusante, como LIMK e da cadeia leve da miosina 2 (MLC2). A fosforilação destes substratos é importante na regulação da reorganização do citoesqueleto e a migração de células [33], [34]. Hiperactivação da via de Rho /ROCK é conhecida por estar associada com propriedades mais agressivos do tumor, tais como metástase e invasão [35] – [41]. Desregulação da via Rho /ROCK pode ser, conseqüentemente, relacionados com a sua aberrante via reguladora upstream. Nós já demonstrou que DLC1 é uma proteína RhoGAP e por isso é lógico especular que DLC1 suprime a metástase de células cancerosas através da regulação negativa rearranjo do citoesqueleto mediada por ROCK. No entanto, esta hipótese nunca foi testada experimentalmente e o mecanismo de base de como DLC1 suprime a metástase de células de cancro não foi delineado. Por isso, é estratégica para examinar as possíveis ligações funcionais entre DLC1 e caminho ROCK e suas implicações no HCC.

Neste estudo, demonstramos que DLC1 inibidos eventos do citoesqueleto mediada pelo rock, incluindo formação de fibras de estresse e contato focal rede e fosforilação de MLC2 no córtex célula. Significativamente, estes efeitos inibitórios de DLC1 dependia da sua actividade RhoGAP. Além disso, temos mostrado que DLC1 funcionava como um regulador negativo da ROCHA no controle da morfologia celular. No geral, nós demonstramos que DLC1 regulada negativamente ROCHA em suprimir o movimento celular no HCC.

Resultados

DLC1 abolida formação de fibra de estresse mediada por ROCK e rede de adesão focal

Em primeiro lugar, interrogado se a formação de fibras de stress e adesões focais em células de carcinoma hepatocelular era dependente ROCHA. Descobrimos que, a fibra estresse agregação de matrizes (coradas com corante phalloidin) e adesões focais (Paxillin), particularmente aqueles na região central que estavam ligados ao estresse fibras, foram suprimidos a partir do tratamento inibidor ROCHA (Figuras 1A). Esta descoberta indica que a formação de fibras de stress e as adesões focais em células de carcinoma hepatocelular é dependente de ROCK.

(A) inibidor ROCHA suprimida de fibras de stress e a formação de adesão focal em células de carcinoma hepatocelular. células SMMC-7721 foram semeados em tampa-derrapante um dia antes do tratamento. fibras de stress foram coradas com corante phalloidin (vermelho) e adesões focais com mancha paxilina (verde). fibras de stress pode ser claramente observada como feixes que se estende através das células e adesões focais foram anexados à fibra estresse agregação de matrizes em SMMC-7721 simulada tratados controle. O tratamento com Y27632 inibidor ROCHA em 10 mm para 60 minutos formação de fibras de tensão e da rede de adesão focal suprimida em SMMC-7721. (B) e de fibras de stress DLC1 mediada por ROCHA suprimida (C) e formação de adesão focal em células de carcinoma hepatocelular. células SMMC-7721 (I) e BEL7402 (II) foram transfectadas com plasmídeos de expressão marcada com myc, pCS2 + MT, pCS2 + MT /DLC1, e pCS2 + MT /DLC1 K714E, e reconhecido por anticorpos anti-myc (9E10). fibras de stress e adesões focais foram coradas com faloidina-TRITC e anticorpo anti-paxilina, respectivamente. Do tipo selvagem DLC1, mas não mutante RhoGAP deficiente (DLC1 K714E), suprimiu a formação de fibras de stress e reduziu o número de estresse fibras ligada adesões focais formados em células SMMC-7721. Percentagem de diferentes construções DLC1 transfectadas células que apresentam fibras de stress ou adesões focais foram apresentados em um gráfico de barras em conformidade. Para cada construção, o total de 67-170 células transfectadas foram contados sob o microscópio. As barras de erro representam o desvio padrão (SD) dos dados obtidos a partir de dois experimentos independentes.

Para investigar a função reguladora do DLC1 em fibra de estresse mediada por ROCK e formação de adesão focal na HCC, que transitoriamente overexpressed DLC1 em DLC1 células deficientes em SMMC-7721 e BEL7402 CHC e os seus efeitos sobre a rede de fibras de stress e adesões focais foram estudados. A sobre-expressão de tipo selvagem DLC1 suprimiu significativamente a formação de fibras de stress e em adesões focais destas células, tal como indicado por faloidina (Figura 1B) e as manchas paxilina (Figura 1C-1C-I e II), respectivamente. De forma análoga à inibição ROCHA (Figura 1A), DLC1 abolida principalmente as adesões focais ligados a fibras de tensão localizadas na região central de células (Figura S1A). A perda de adesões focais foi agravado com a expressão ectópica da SAM mutante excluído do domínio de DLC1 (ΔSAM) (Figura S1B), um DLC1 truncado construção que causou um encolhimento celular mais grave e perda de fibras de stress [4]. Em contraste, um mutante deficiente RhoGAP-(DLC1 K714E) foi incapaz de inibir tanto de fibras de stress e a formação de adesão focal (Figuras 1B e 1C). Estes resultados demonstraram que DLC1 inibido ROCHA de fibras de tensão dependente e formação de adesão focal através de sua atividade RhoGAP.

DLC1 abolida cadeia leve de miosina cortical mediada-ROCK 2 fosforilação

Active Rock fosforila especificamente cadeia leve de miosina 2 (MLC2) em Ser 19; Portanto, esta fosforilação específicos de pedra tem sido amplamente utilizada como um marcador substituto de actividade ROCHA [36], [42] – [45]. A fosforilação da Ser19 em MLC2 é importante para a actividade da miosina que é responsável pela contractilidade actomiosina e, portanto, a migração de células [46]. Neste estudo, observou-se que fosfo-MLC2 coloração de células BEL7402 HCC foi especialmente proeminente no córtex celular. No entanto, quando a actividade rocha foi bloqueado quer por Y27632 (Figura 2A) ou expressão ectópica de um mutante negativo dominante ROCHA (Figura 2B), este fosforilação periférica de MLC2 foi completamente abolida e a fosforilação de MLC2 tornou-se um padrão predominantemente citoplasmático. Em contraste, a expressão ectópica de rocha dominante-ativa culminou em um aumento substancial de MLC2 fosforilação em feixes de actina (Figura 2B). Estes resultados indicam que este padrão de fosforilação distintivo de MLC2 no córtex celular é fortemente e positivamente regulada pela atividade ROCK.

linha (A) BEL4702 HCC células tratadas com controle simulada ou inibidor ROCHA (Y27632) foi sondado com anticorpo monoclonal de rato anticorpos contra fosfo-MLC2 (Ser 19). A fosfo-MLC2 (verde) foi detectada principalmente no córtex celular de células BEL7402 (como indicado pelas setas) e este padrão de coloração cortical foi abolida por tratamento com Y27632 inibidor de ROCK. (B) BEL7402 células foram transfectadas com a rocha dominante negativo marcado com myc ou construções Active Rock dominantes e detectado com anticorpo policlonal de coelho contra o epitopo myc (A14) (vermelho). Color activo (DA) ROCHA causada intensa fosforilação de MLC2 (Ser 19), os feixes de actina (PRECENTAGE de células que exibem este fenómeno: 94,0% das células DA ROCK-transfectadas em comparação com 0% das células transfectadas vector). As setas apontam para os feixes de actina da célula ROCHA transfectadas activa dominante, onde fosforilação de MLC2 (Ser 19) foi reforçada. Negativo dominante (DN) ROCHA suprimida fosforilação cortical do MLC2 (Ser 19) (percentagem de células que exibem este fenómeno: 87,5% das células DN ROCK-transfectadas em comparação com 7,3% das células transfectadas vector). As setas apontam no córtex celular da célula transfectada ROCHA negativo dominante quando a fosforilação de MLC2 (Ser 19) foi perdido. Como mostrado, foram necessário um regulamento apertado e um nível óptimo de actividade ROCHA para manter a fosforilação cortical de MLC2 (Ser 19) em BEL7402 células.

A seguir, investigou se DLC1 poderia abolir esta MLC2 específico-ROCK padrão de fosforilação nas células CHC. Em primeiro lugar, avaliaram se o padrão de coloração cortical fosfo-MLC2 estava relacionada com os níveis de expressão endógenos de DLC1 em diferentes linhas celulares. Observou-se visível a coloração fosfo-MLC2 no córtex célula em SMMC-7721, BEL7402, e linhas WRL HCC celulares (Figura 3C), e a linha de células HeLa cervicais de células de cancro (Figura 3C), o qual tinha nenhuma expressão de DLC1 (Figura 3A). Por outro lado, HepG2 e Hep3B, as duas linhas celulares de carcinoma hepatocelular com expressão DLC1 (Figura 3A), exibida coloração citoplasmática difusa fosfo-MLC2 sem qualquer fosforilação cortical distinta de MLC2 na periferia da célula (Figura 3B).

a expressão de ARNm e proteína DLC1 (a) em linhas celulares de carcinoma hepatocelular. (B) e expressão DLC1 (C) foi associado com padrão de coloração fosfo-MLC2. imagens representativas de células DLC1-positivos e DLC1-negativo, respectivamente. DLC1 positivo Hep3B e HepG2, exibido fosforilação difusa de MLC2, enquanto DLC1 não expressar BEL7402 e HeLa, exibido pronunciada fosforilação cortical de MLC2 no córtex celular.

Para verificar se a inibição da cortical fosfo-MLC2 estava diretamente relacionada ao DLC1, nós então expressa transitoriamente do tipo selvagem DLC1 e mutante DLC1 RhoGAP deficiente (K714E), respectivamente, em células BEL7402 DLC1 nulo. DLC1 tipo selvagem reduziu substancialmente o número de células com coloração de fosfo-MLC2 cortical (Figuras 4A 4B), significando a função supressora de DLC1 na actividade ROCHA. Por outro lado, mutante DLC1 RhoGAP-deficiente (K714E) foi incapaz de suprimir coloração cortical fosfo-MLC2 (Figuras 4A 4B). Por conseguinte, a nossa observação sugeriu DLC1 inibido MLC-2 fosforilação específica-ROCK em células do CHC, através da sua actividade RhoGAP.

(A) pCS2 + vector MT sozinho, pCS2 + MT DLC1 e pCS2 + MT DLC1 K714E, respectivamente , foram transfectados para células BEL7402. O reconhecimento das células transf ectadas foi realizada por células com c-myc o anticorpo (A14) de coelho, seguido de coloração com anticorpo anti-coelho conjugado com vermelho do Texas sondagem. As células transfectadas com vector de pCS2 + MT isolado demonstrou fosforilação cortical pronunciada de MLC2 como indicado pelas setas. As células transfectadas com DLC1 exibida perda de fosforilação de MLC2 cortical. As células transfectadas com DLC1 K714E, o mutante deficiente em RhoGAP, ainda exibido fosforilação cortical pronunciada de MLC2 como indicado pelas setas. (B) Percentagem de diferentes construções DLC1 expositoras fosforilação cortical de MLC2 em Ser 19 foi calculada e apresentada em um gráfico de barras. Para cada constructo, 80-100 células transfectadas foram contadas e cortical fosforilação MLC2 foi gravado. As barras de erro representam o desvio padrão (SD) dos dados obtidos a partir de três experimentos independentes.

DLC1 atenuada atividade da fosfatase da miosina, reduzindo fosforilação de miosina fosfatase subunidade alvo 1 (MYPT1) em Thr 853

para além da fosforilação da miosina, Rock, também aumenta a fosforilação da miosina por fosforilação da miosina fosfatase subunidade alvo 1 (MYPT1) em Thr 696 e Thr 853 e, assim, inactivando-o. Embora Thr 696 de MYPT1 pode ser fosforilada por outras cinases de proteína, Thr 853 de fosforilação, por outro lado, é regulada selectivamente por Rock [32]. Além disso, MYPT1 Thr 853 fosforilação tem sido demonstrado ser um marcador substituto promissor que inversamente correlacionada com a actividade da fosfatase da miosina [36], [42] – [45]. Neste estudo, verificou-se que, mediante Y27632 tratamento, os níveis de fosforilação de MYPT1 (Thr 853) foram reduzidos em todas as linhas celulares de carcinoma hepatocelular testadas (Figura 5A), enquanto que os níveis totais de MYPT1 manteve-se inalterada. Da mesma forma, a sobre-expressão de DLC1 atenuada fosforilação de MYPT1 em Thr853, indicando a perda de actividade ROCHA (Figura 5B). Inactivação de fosfatase de miosina (tal como reflectido pelo aumento da fosforilação MYPT1) e ativação de MLC2 são efeitos do rock combinados, e estes efeitos poderiam ser suprimidos DLC1, levando a uma diminuição total de fosforilação da miosina e uma redução da contratilidade celular.

(a) Y27632 inibidor ROCHA suprimida MYPT fosforilação em Thr 853 em todas as linhas de células de carcinoma hepatocelular. (B) DLC1 suprimida MYPT fosforilação em Thr 853 em 293 T células. intensidade da banda foi analisada por AlphaEaseFC ™ eo percentual foi calculado a partir comparação com seu controle de acordo.

inibidor ROCHA suprimida HCC motilidade celular

Por expressão ectópica de DLC1 na linha de células de carcinoma hepatocelular, nós anteriormente mostraram que DLC1 reprimida significativamente a migração celular HCC invasividade e [4]. Para comprovar nossa hipótese de que DLC1 suprimida a migração de células através de atividade ROCHA regulação negativa, que examinou o efeito do inibidor ROCHA sobre a migração celular HCC com transpoço ensaio. Observou-se que o inibidor Y27632 ROCHA suprimida a migração de células de carcinoma hepatocelular, SMMC-7721 (Figura 6A painel da esquerda) e BEL7402 (Figura 6B painel da esquerda), como demonstrado pela diminuição do número de células que migraram em ensaio Transwell. Este resultado indica que a atividade ROCHA é crucial para a migração celular HCC. Para eliminar qualquer interpretação errada devido a morte celular causada pela toxicidade da droga, foi realizada ensaio de proliferação celular nas células CHC. ensaio de proliferação celular demonstraram que Y27632 não afetou o crescimento das células que confirmou que a inibição da ROCHA só afetou a migração celular HCC (Figura 6A e 6B painel da direita).

Y27632 inibidor ROCHA suprimida migração celular HCC. Y27632 diminuição do número de migrou (A) células SMMC-7721 (

P Art 0,0001,

t

-teste) e (B) BEL7402 células (P 0,0001,

t

-test). As barras de erro representam o desvio padrão (SD) dos dados obtidos a partir de três campos microscópicos. As experiências foram repetidas três vezes. ensaio de proliferação celular foi mostrado no direito de comparar a taxa de crescimento das células de controle mock e Y27632 células tratadas.

ROCHA reverteu a alteração morfológica celular de DLC1

Nós já demonstrou que DLC1 foi capaz de induzir alterações morfológicas de células com a formação de fibras de tensão reduzida em células de carcinoma hepatocelular e fibroblastos [4]. Desde ROCHA é um chefe modulador na sinalização do citoesqueleto e organização do citoesqueleto é um factor determinante da morfologia celular, nós especulamos que as alterações morfológicas de células induzidas por DLC1 foram via ROCK. Para este fim, observou-se a morfologia celular de células co-transf DLC1 e rock por imunofluorescência. Nós também contado o número de células que exibiram colapso das células ou encolhimento causado pelo colapso da rede do citoesqueleto (Figura 7C), como descrito noutro local [4], [47] – [49]. Neste estudo, observou-se que a superexpressão de DLC1 em células COS7 induzida colapso do citoesqueleto ou encolhimento celular (Figura 7A-i), semelhante ao nosso achado anterior [4]. encolhimento celular foi intensificada pela expressão ectópica da SAM mutante excluído do domínio de DLC1 (ΔSAM) (Figura 7B-i). Co-transfecção de vazio vector pEGFP não poderia resgatar mudança morfológica celular induzida por DLC1, mas células com Active Rock dominante conseguiu superar a regulação inibidora de DLC1 (Figura 7A-ii) e até mesmo DLC1ΔSAM (Figura 7B-ii) e células de DLC1 lançado encolhimento celular induzida. Esta experiência mostrou que o rock é um dos efectores a jusante de DLC1 de coordenação das alterações morfológicas em células do CHC.

células COS7 foram co-transfectadas com (A) DLC1 e ROCK ou DLC1ΔSAM (B) e rock, respectivamente . As células transfectadas com pCS2MT DLC1 ou pCS2MT DLC1ΔSAM apareceu vermelho, enquanto as células transfectadas com pEGFP ou pEGFP ROCHA apareceu verde. induzida por DLC1 colapso do citoesqueleto celular ou encolhimento da célula (A-I), o qual foi adicionalmente melhorada e claramente demonstrado pela construção SAM-suprimidos, pCS2 + MT DLC1ΔSAM (B-I). ROCHA foi capaz de células de contração induzida por DLC1 celular (A-II) e até mesmo de induzida por DLC1ΔSAM encolhimento celular intensa (B-ii) restauração. células (C) Co-transf ectadas foram contadas e as suas morfologias gravada. O número de células co-transfectadas exibem encolhimento da célula (colapso das células observáveis) foi dividido pelo número total de células co-transfectadas contadas, para calcular a percentagem de células em que são visualizadas encolhimento conforme mostrado no gráfico de barras. Para cada coluna, 150-200 células co-transfectadas foram contadas. As barras de erro representam o desvio padrão (SD) dos dados obtidos a partir de três experimentos independentes.

Discussão

Um dos papéis importantes da DLC1 é a sua capacidade de reprimir a migração de células cancerosas e invasão. Neste estudo para elucidar os mecanismos subjacentes na regulação da migração celular HCC e invasão de DLC1, temos mostrado que DLC1 suprimida migração celular HCC através da regulação da contração citoesqueleto e actomiosina. Além disso, temos mostrado que DLC1 funcionava como um regulador negativo da ROCHA no controle da morfologia celular.

DLC1 negativamente regulado ROCHA mediada contratilidade actomiosina

O movimento contrátil das células cancerosas é gerado por contrações consecutivas de feixes actomiosina compostas de actina e miosina chamado actomiosina. Estes pacotes actomiosina, visualizadas como fibras de stress, esticar todo o corpo celular e criar uma tensão para gerar contração celular para dirigir o movimento celular através da ligação com as moléculas de adesão focal [50]. Com base no estudo anterior sobre o efeito inibitório do DLC1 em fibras de stress, aqui que encontramos ainda que a formação de fibras de stress e de rede adesões focais era dependente DLC1 RhoGAP e actividade rocha em células de carcinoma hepatocelular. Esta descoberta ainda esclarece que as fibras de estresse e adesões focais trabalhar lado a lado, como descrito por Hall A. [51], e sua formação é interdependente e fortemente regulada por RhoGAP de DLC1 ea atividade ROCK. Além disso, DLC1 diminuiu a fosforilação mediada por ROCK-de MYPT1 (Thr853) e fosforilação de MLC2 (Ser19) e, por consequência, levar a uma diminuição da fosforilação total de miosina e como consequência uma redução da contractilidade de fibras de stress [46]. Todas estas linhas de evidência convergiram para explicar que DLC1 controlada um dos mecanismos fundamentais migratórios, contracção actomiosina, semelhante a outro membro da família RhoGAP,

DLC1 aboliu a formação de adesão focal P190-RhoGAP [52]. E igualmente localizada a adesão focal complexa

Uma questão intrigante desta descoberta sobre o efeito inibitório do RhoGAP em moléculas de adesão focal tenha surgido. DLC1 e vários membros das proteínas RhoGAP incluindo p122-RhoGAP e RC-GAP72 foram encontrados para ser localizada nas adesões focais [47], [49]. Na verdade, os outros e que têm relatado anteriormente que DLC1 também localizada para adesões focais e interagiu com os membros da família tensina [18], [53], [54]. Neste estudo, descobrimos que DLC1 reprimida estresse formação de adesão focal ligados com fibra pela sua actividade RhoGAP. A partir de estudo de imunofluorescência, observou-se que, em uma porção de células DLC1 transfectadas, DLC1 exibiu um padrão de adesão focal localização (Figura S1A); enquanto em algumas outras células DLC1 transfectadas, especialmente aqueles que são visualizadas extensa encolhimento celular, uma perda intensa de adesões focais estresse fibra ligados foi observada (Fig. 1C). DLC1 localização para adesões focais e o seu efeito inibidor sobre adesões focais não são mutuamente exclusivos. Especulamos que efeito de dosagem pode ser um dos factores envolvidos. Quando uma célula foi transfectado com uma dose elevada de DLC1, DLC1 se extinguir todas as fibras de stress e as adesões focais ligados a fibras de stress e resultar em grande colapso das células (Fig. 1C). Por outro lado, quando a célula foi transfectado com uma dose mais baixa de DLC1, DLC1 se extinguir a maior parte das fibras de tensão e stress adesões focais ligados a fibra mas poupar algumas adesões focais não ligado ao estresse fibras e resultar num colapso das células mais leves ( Figura S1A). Outra especulação era de que semelhante ao RC-GAP72 [47], DLC1 pode localizar a adesão focal a desintegrar-se os complexos de adesão focal.

colapso induzido encolhimento celular Citoesqueletal eo impacto da DLC1 no colapso do citoesqueleto

adesões focais e fibras de stress actomiosina sempre funcionam de forma interdependente e eles juntos construir um andaime para apoiar uma morfologia intacta da célula [47]. As interrupções da rede supracitada causada por DLC1 levou a um colapso do citoesqueleto da célula intensiva resultando em encolhimento celular. Este achado foi semelhante ao Barberis D

et al. O estudo de

em p190RhoGAP que a perda de adesões focais induzidas por p190RhoGAP precedida encolhimento celular [48]. Observou-se que a perda de adesões focais e de fibras de stress teve lugar uma hora após a inibição por ROCHA Y27632, mas as células não entrou em colapso imediato (Figura 1A) até que o tratamento prolongado de Y27632 até 24 horas (Figura S2). A partir desta observação, supomos que o colapso de células causada por Y27632 tratamento foi se seguiu à perda de adesão focal e rede de fibra stress. Após a inibição da rocha por Y27632, as redes do citoesqueleto não pode ser formado e as células já não poderia suportar a perda de rede do citoesqueleto e eventualmente sofrer colapso das células, o que foi observado como encolhimento da célula (Figura 8). O presente estudo mostrou que o colapso do citoesqueleto induzidas por DLC1, um RhoGAP que a sua regulação baixa está associada com a progressão da HCC, poderia ser parcialmente revertida por ROCHA ativa, ainda que implica que DLC1 regulada negativamente ROCHA no controle da contratilidade actomiosina, morfologia celular e migração celular sequencialmente . Nosso estudo anterior relatou que DLC1 não apenas suprimiu a migração de células, mas também celulares invasão que envolveu barreira matriz extracelular. Sahai E

et al.

Informou que linhas celulares de cancro podem possuir diferentes modos de motilidade celular e as linhas celulares de cancro morfologia arredondadas foram mais sensíveis ao inibidor da rocha em matriz 3-dimensional [55]. No entanto, se este modelo é aplicável às células de carcinoma hepatocelular e se outras vias proteolíticas extracelulares coorperate com o DLC1 /Rho /ROCK /via MLC ainda são desconhecidos e esperou ser abordado.

(A) fibras de stress foram conectados a adesões focais que formam uma rede. fibras de stress esticado em toda a célula para fornecer a célula de uma morfologia intacta. (B) DLC1 RhoGAP ou perda de actividade ROCHA induzida a perda de fibras de stress e adesões focais. Algumas adesões focais e feixes de fibras de estresse permaneceram. (C) Uma prolongada ou grave perda de fibras de stress e a rede de adesão focal provocado por DLC1 RhoGAP ou supressão da actividade ROCHA iria resultar em colapso do citoesqueleto intensiva. Todas as fibras de stress e adesões focais foram abolidas.

Nosso estudo demonstrou que inibidores da ROCK, Y27632, não afetou a proliferação celular HCC a uma dose eficiente que suprimiu a migração celular HCC. inibidores da ROCK têm sido amplamente utilizados em modelos animais, tais como modelos de ratos e ratinhos, sem causar grande toxicidade para os animais em dosagens eficientes [35], [56]. Takamura et ai. demonstrou que Y27632 poderia inibir metástase intra-hepática da HCC [35] e, recentemente, outro inibidor da ROCK, fasudil, tem sido aplicado com sucesso em ensaios clínicos para pacientes com doenças cardiovasculares [57]. Estes estudos demonstram que a toxicidade dos inibidores da ROCK para as células é limitada [35]. Acumular conhecimento indica que o rock está jogando um papel importante na metástase do câncer, eo presente estudo tem enriquecido o conhecimento sobre a via de sinalização de rock em HCC. inibidores de rock, como Y27632 pode ser útil para a intervenção quimioterápico na supressão de metástase intra-hepática, uma das principais causas de mortalidade em pacientes com CHC, sem causar muito efeitos adversos para os doentes. Além disso caracterização das eficácias de inibidores Rock e terapias anti-rock no tratamento da HCC ainda se aguarda.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e plasmídeos

SMMC-7721 e BEL7402 foram presentes de Shanghai Institute of Cell Biology, Academia chinesa de Ciências; 293T, as células COS7, HepG2 e Hep3B foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). 293T, BEL7402, SMMC-7721, e as células COS7 foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com glucose elevada de soro de bovino fetal a 10%; Hep3B e HepG2 foram cultivadas em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com soro bovino fetal a 10%. construções de expressão marcada com myc (pCAG) transportando humano de tipo selvagem do rock, rocha ativa dominante (1-725 aa), e dominante mutantes ROCHA negativo (K105A, I1009A) foram gentilmente cedidas por S. Narumiya (Faculdade de Medicina da Universidade de Kyoto) [27]. O domínio ROCHA quinase humana (ROCHA 76-338 a.a.) foi amplificado por PCR e clonado no vector pEGFPC3 usando sites de digestão KpnI e XhoI e foi usado como forma activa dominante do ROCK. De tipo selvagem e DLC1 RhoGAP deficientes em mutantes foram clonados como descrito anteriormente [4].

tratamento da toxicodependência e transfecção

Y27632 inibidor específico da rocha foi obtido a partir de Calbiochem (Darmstadt, Alemanha). Para o tratamento, as células foram adicionadas Y27632 a 10 uM e incubou-se durante 1 hora a 37 ° C. Para a transfecção, 1 × 10

5 as células foram semeadas em lamelas em placas de 35-mm um dia antes da transfecção. plasmídeos indicados foram transfectados em células com FuGene 6 reagente (Roche, Basileia, Suíça) de acordo com as instruções do fabricante.

Microscopia de imunofluorescência

anticorpo monoclonal de ratinho contra fosfo-miosina de cadeia leve 2 (Ser 19) foi adquirido a Cell Signaling Technology (Danvers, MA). anticorpo monoclonal de ratinho contra a paxilina foi obtido a partir de Upstate (Lake Placid, NY). Monoclonal de ratinho (9E10) e soro policlonal de coelho (A14) anticorpos contra c-myc foram obtidas a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). conjugado com corante de cabra AffiniPure Texas Red anti-rato IgG e de fluoresceína (FITC) -conjugated IgG anti-coelho de cabra AffiniPure foram adquiridos a Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Para a coloração de imunof luorescência, as células foram fixadas em paraformaldeído, permeabilizadas com Triton X, bloquearam-se com albumina de soro bovino e em seguida incubadas com anticorpos primários e secundários indicados.