Abstract

Nos mamíferos, o gerador central de ritmo circadiano consiste em interações entre os genes do relógio, incluindo

Per1 /2 /3

,

Cry1 /2

,

Bmal1

, e

Relógio

. Circadiano perturbação do ritmo pode levar ao aumento do risco de câncer em seres humanos, e desregulamentação dos genes do relógio tem sido implicado em muitos tipos de cancro. Entre estes genes,

Per2

é relatado para ter propriedades supressores de tumor, mas pouco se sabe sobre a correlação entre o

Per2 Comprar e HIF, que é o principal alvo de carcinoma de células renais terapia (RCC) . Neste estudo, a expressão rítmica da

gene Per2

não era detectável nas linhas de células de cancro renal, com a excepção de células Caki-2. Em células Caki-2, HIF1α aumentou a amplitude de

Per2

oscilação diretamente pela ligação ao local de ligação de HIF localizado no

promotor Per2

. Estes resultados indicam que HIF1α pode aumentar a amplitude do

Per2

ritmo circadiano

Citation:. Okabe T, Kumagai M, Nakajima Y, Shirotake S, Kodaira K, Oyama M, et al. (2014) O Impacto da HIF1α no

Per2

ritmo circadiano em linhas celulares de cancro renal. PLoS ONE 9 (10): e109693. doi: 10.1371 /journal.pone.0109693

editor: Shin Yamazaki, University of Texas Southwestern Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de janeiro de 2014; Aceito: 12 de setembro de 2014; Publicação: 21 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Okabe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células renais (CCR) é a mais comum neoplasia do rim adulto, que responde por cerca de 2% dos cancros em todo o mundo [1]. Uma mutação somática do Von Hippel-Lindau (

BVS

) gene é a alteração genética mais frequente observada em RCC [2], e os esforços recentes têm como alvo o fator inducible BVS-hipoxia (HIF) mediada por hipóxia via de gene induzida por terapia RCC [3]. HIFs são fatores de transcrição heterodiméricos com duas subunidades estruturalmente relacionados: uma subunidade HIFα sensíveis ao oxigênio e um HIFß constitutivamente expressa ou receptor de hidrocarboneto aromático translocator nuclear (ARNT) subunidade [4]. Em normoxia, moléculas HIFα são submetidos a um processo de regulação que envolva a hidroxilação enzimática de resíduos prolilo e asparaginilo conservadas, levando a uma rápida degradação e ubiquitinação proteossómica mediada por proteína de VHL [5]. Hipoxia ou mutações no

BVS

inativar genes dessa via. O aumento da actividade HIFα regula positivamente genes envolvidos em muitos aspectos da progressão do cancro, incluindo a adaptação metabólica, resistência à apoptose, angiogénese e [3]. No RCC, redes vasculares tumorais intensa pode ser atribuído à acumulação inadequada de HIFα levando a indução do gene angiogénico. factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um dos factores pró-angiogénicos mais potentes, cuja expressão é transactivado por HIF1α /ARNT através da ligação ao elemento de resposta de hipoxia (HRE)

Vegf

promotor [6] [7]. A expressão aumentada do VEGF também está associada com a progressão maligna e um resultado do tratamento pobre [8]. Portanto, a supressão da via de genes mediada por HIF pode ser uma importante estratégia terapêutica para o tratamento de carcinoma de células renais [3].

Muitos processos fisiológicos, bioquímicos e comportamentais são sob regulação circadiano, que é gerado por um tempo interno mas manter mecanismo referido como o relógio biológico em quase todos os organismos desde bactérias a mamíferos [9], [10]. Os ritmos circadianos são controlados por redes geneticamente determinadas de realimentação de transcrição-tradução laços envolvendo genes do relógio, incluindo

Per1 /2/3

,

Cry 1/2

,

Bmal1

, e

Relógio

[11]. Um tema comum ritmicidade circadiana subjacente é que as oscilações de transcritos do gene do relógio são a consequência de loops de feedback de transcrição-tradução intracelulares. Por exemplo, em mamíferos, a factores de transcrição CLOCK e BMAL1 heterodimerizar e activar a expressão de três

Por genes e dois

Cry

genes

através da ligação a elementos de E-box em seus promotores. Os produtos de proteínas destes genes multimerizar e translocar para o núcleo, onde as proteínas PER e chorar reprimir a atividade transcricional do dímero CLOCK-BMAL1 [12], [13].

Entre estes genes do relógio,

Per2

é responsável por definir o período de oscilação [14]. Além disso,

Per2

tem propriedades supressores de tumores e é frequentemente mutado ou reprimidos em cancros da mama humanos [15], [16]. No cancro renal, expressão alterada do

gene Per2

está supostamente envolvido no início e progressão da doença, mas o mecanismo molecular responsável permanece incerto [17].

Neste estudo, foram medidos os níveis de

Per2

atividade do promotor e mRNA em oito linhas celulares de cancro renal após o tratamento com dexametasona. O

Per2

atividade do promotor e nível de mRNA oscilou ao longo de um ciclo de aproximadamente 24 h em células Caki-2, que contêm BMAL1, CLOCK e proteínas HIF1α. Nós também descobrimos que HIF1α aumentou a amplitude de oscilação pela directamente vinculativa para o elemento HRE-like localizado no

Per2

promotor. Estes resultados mostram que HIF1α pode afetar a amplitude do

Per2

ritmos circadianos em linhas celulares de cancro renal.

Materiais e Métodos

Células e culturas de células, produtos químicos e enzimas

estabelecida (A704, ACHN, 786-o, A498, 769-P, e Caki-2) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). RCC4 + vector sozinho e RCC4 BVS + foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA). Estas linhas de células renais foram mantidas no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 médio (Bio Kojin, Tóquio, Japão) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), 24 U /mL de penicilina , e 25 ug /ml de estreptomicina (Gibco, Grand Island, Nova Iorque, EUA) numa incubadora humidificada padrão a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2. Nós também utilizado fibroblastos de rato NIH3T3 e modelos de células U2OS osteosarcoma humanos do relógio circadiano autónoma [18], [19]. Estas linhas de células também foram obtidas da ATCC e foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de FBS, penicilina (24 U /ml) e estreptomicina (25 ug /mL). A crisina foi adquirido a Sigma e a sua pureza excedeu 96%. Uma solução de estoque de crisina foi preparada em sulfóxido de dimetilo (DMSO). A crisina foi dissolvido em DMSO a três concentrações diferentes (1, 10, e 100 mM) e adicionados a cada 2 uL a 2 mL de meios de cultura (concentração final: 1, 10, 100 uM). As células foram tratadas com meio de cultura contendo 1, 10, 100 uM ou crisina mesma concentração de DMSO como controlo, durante 2 horas.

O plasmídeo construção

para construir vectores repórter transportando o m

Per2

promotor, o m

Per2

fragmento do promotor (-279 a +112 pb, onde +1 indica o local de início da transcrição putativo) foi polimerase reação em cadeia (PCR) -amplified do /6J genoma do rato C57BL , e clonado no local NheI /XhoI de pGL3 básico (Promega, Madison, WI, EUA). Firefly luciferase (FLUC) foi substituído com o

Nco

I e

Xba

Eu fragmento de pSV40-dFLuc, resultando em m

Per2

-dFLuc. O m HRE-mutante

Per2

repórter promotor foi gerado por PCR inversa utilizando um Kit KOD-Plus-mutagênese (Toyobo, Osaka, Japão).

relatórios em tempo real do gene circadiano-regulada expressão de luciferase usando a bioluminescência

Todas as células foram cultivadas (5 × 10

4 por prato) em uma placa de 35 mm 2 dias antes da transfecção, e o plasmídeo repórter foi transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade apropriada do plasmídeo repórter por cada linha celular foi determinada de acordo com diferenças na eficiência de transfecção entre as linhas de células. Um dia após a transfecção, as células foram tratadas com 100 nM de dexametasona (Nakalai Tesque, Quioto, Japão) durante 2 h, e o meio foi substituído com meio na ausência de vermelho de fenol suplementado com FBS a 10% e 100 ^ M de D-luciferina (Toyobo ). A bioluminescência foi medida a 37 ° C sob uma CO 5%

2 atmosfera e integrada durante 1 min, com intervalos de 10 min, utilizando um tipo de prato de luminómetro, AB-2550 da Kronos Dio (ATTO, Tóquio, Japão) [20], [21]. A bioluminescência actividade foi expressa como unidades relativas de luz (RLU). Cada experiência foi repetida, pelo menos, quatro vezes. As células foram cultivadas no luminómetro durante pelo menos 4 dias, enquanto o instrumento contado sua bioluminescência. Os dados brutos obtidos (10 min bins) foram suavizadas por um ponto 10 movendo método de média e retificada subtraindo uma média móvel de 12 h a partir de dados suavizados [21].

Análise dos ritmos circadianos usando a bioluminescência

para testar a significância da ritmicidade circadiana e calcular parâmetros circadianos (ou seja, período, amplitude, e acrofase), foi realizada a análise de dados informatizada no software Cosinor descarregado a partir do ritmo circadiano Laboratory (Walterboro, SC, ) home page EUA software (https://www.circadian.org/software.html) [22], [23]. parâmetros circadianos foram calculados utilizando dados de 1-5 dias após o tratamento com dexametasona.

captura de imagem automatizada e análise

células NIH3T3 foram semeadas (5 × 10

4 por poço) em 6- se placas de um dia antes de transfecção, e o plasmídeo de expressão foi transfectado usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Um dia após a transfecção, as células foram tratadas com 100 nM de dexametasona (Nakalai Tesque), durante 2 h, e o meio foi substituído com meio na ausência de vermelho de fenol suplementado com FBS a 10%. As células foram coradas com 0,1 ug /ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante 1 hora e analisadas utilizando ArrayScan XTI (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA).

A quantificação de ARNm por em tempo real de RT-PCR

Todas as células foram colhidas em intervalos de 4 h a partir de seis placas em cada ponto de tempo começando 24 h após o tratamento com dexametasona. O ARN total a partir destas células foi extraído utilizando ISOGEN (Nippon Gene, Tóquio, Japão) e reversamente transcrito.

Per2

e

GAPDH

transcritos foram quantificados utilizando um ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A PCR foi realizada utilizando o One Step Kit SYBR PrimeScript RT-PCR (Takara Bio, Quioto, Japão) com os seguintes parâmetros de ciclos térmicos: 94 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 20 s e 62 ° C durante 1 minuto. O

GAPDH

transcrição foi usado para normalizar a expressão de cada transcrição. significado ritmicidade circadiana foi analisada utilizando o software Cosinor (ritmo circadiano Laboratory) [22], [23]. Primers para cada gene foram concebidos com base na informação disponível a partir do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI). As sequências dos iniciadores PCR foram as seguintes:

Per2

(GenBank não, NM_022817; amplicon, 85 pb.): Sentido 5′-CACACACAGAAGGAGGAGCA-3 ‘e iniciador anti-sentido 5’- AGTAATGGCAGTGGGACTGG-3 ‘

GAPDH

(GenBank não, M33197; amplicon, 185 pb.):. iniciador com sentido 5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′ e iniciador anti-sentido 5′- GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3 ‘.

luciferase ensaio

As células transfectadas NIH3T3 foram utilizados para ensaios de luciferase. Um dia antes da transfecção, as células foram semeadas (5 × 10

4 por poço) em placas de 24 poços contendo meio DMEM suplementado com FBS a 10%, penicilina (24 U /ml) e estreptomicina (25 ug /mL). As células foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Para cada amostra, o ADN transfectado foi adicionado a cada poço. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e interrompida com 100 mL de tampão de lise passiva (Promega). A actividade de luciferase foi determinada utilizando um Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase (Promega) e um luminómetro Ascent FS II (Thermo Scientific).

Western blotting

Todas as células foram sincronizadas com 100 nM de dexametasona para o tratamento 2 h. Em seguida, o meio foi substituído com meio fresco. Após 24 h de incubação, estas células foram lisadas em MT-lítico celular (Sigma). Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 15000 rpm a 4 ° C durante 10 min. Os sobrenadantes foram armazenados como extractos celulares inteiros a -80 ° C até à sua utilização. Para Western blot, 20 ug de proteína foram resolvidos em 7,5% de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida (SDS-PAA) géis e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As membranas foram bloqueadas com solução salina tamponada com Tris (TBS), Tween contendo 5% de leite seco não gordo. As proteínas foram detectadas utilizando anticorpos contra HIF1α (diluição, 1: 500; BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, EUA), PER2 (diluição, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), Cry1 (diluição, 1:2000; Santa Cruz Biotechnology), relógio (diluição, 1:1000; Thermo Scientific), GAPDH (diluição, 1:10000; Sigma) e BMAL1 (diluição, 1:100 anticorpo monoclonal gerado em nosso laboratório). Realizamos quatro replicar Western blot; uma mancha representativo é mostrado

ensaio ChIP

experimentos ChIP foram realizadas utilizando um kit comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante (Magna-chip; Millipore, Bedford, MA, EUA).. Resumidamente, as células Caki-2 foram plaqueadas em placas de 100 mm de diâmetro (5 × 10

4 células por prato); Após 24 horas, as células foram incubadas com formaldeído (concentração final, 1%) durante 10 min a 37 ° C a proteínas de ligação cruzada com o ADN. formaldeído que não reagiu foi extinta com 1 ml de 10 × glicina. A placa foi lavada duas vezes com PBS gelado, e os peletes foram recolhidas em 1 mL de PBS com um cocktail inibidor de protease e reunidas num tubo de 1,5 mL. A cromatina reticulado foi cortada por sonicação 20 vezes durante 1 min de cada vez com 1 minuto de arrefecimento em gelo entre impulsos utilizando um Branson 2510 Ultrasonic Cleaner (Branson, Danbury, CT, EUA). A imunoprecipitação (IP) foi realizada com 5? G de anticorpo anti-HIF1α (diluição, 1: 500; Novus Biologicals Inc., Littleton, CO, EUA) ou anticorpo anti-IgG (Millipore) como um controlo negativo. As lavagens e eluição do ADN PI foram realizadas de acordo com o protocolo Magna-Chip (Millipore). Dez por cento (10%) do ADN cromatina original é cortada de forma semelhante foi inverter reticulado e purificada, e o DNA recuperado foi usado como um controle de entrada. A PCR foi realizada com iniciadores que flanqueiam a sequência de HRE-como dentro da região do promotor do humano

Per2

gene (-476 a -284 pb, sentido: 5′-ACGCCGGAAGTGGATGAGAC -3 ‘e anti-sentido: 5’- CGACTCCGTCTCATCTGCATACAT -3 ‘) com os seguintes parâmetros térmicos ciclagem: 94 ° C durante 3 min, seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 20 s, hibridação a 59 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 30 s.

a análise estatística

Cada experimento foi repetido pelo menos quatro vezes. Os dados estão expressos como médias ± erros padrão. Para avaliar a significância das diferenças, Estudante de

t

-test foi realizada. Nós usamos uma análise de uma via de variância (ANOVA) para comparações entre os grupos de concentração da droga, seguido de aplicação de testes de Tukey. Para todas as análises, o nível de significância foi estabelecido em

P Art 0,05. O software Cosinor (Laboratório ritmo circadiano) [22], [23] foi utilizado para analisar ritmicidade circadiana.

Resultados

expressão circadiana da

gene Per2

no cancro renal linhas celulares

Para explorar a oscilação da transcrição do

Per2

, todas as linhas de células foram transfectadas com um gene repórter luciferase conduzida pelo

Per2

promotor e uma monitorização em tempo real ensaio foi realizado usando Kronos Dio (AB-2550; ATTO). Um promotor ligado a luciferase nas células Caki-2 apresentada ritmos circadianos depois de 2 h de tratamento com dexametasona (Fig. 1A, Tabela 1), mas não foi detectada ritmicidade nas outras linhas de células (Fig. S1). Cada experiência foi repetida quatro vezes e estes resultados foram consistentes. 24 h após o tratamento com dexametasona,

PER2

níveis de mRNA tinha um ritmo circadiano em Caki-2 células (Fig. 1B, Quadro 1). Estes resultados mostraram que a ritmicidade circadiana da

gene Per2

não era detectável em linhas celulares de cancro renal, excluindo as células Caki-2.

Todas as linhas celulares de cancro renal (A) foram transfectadas com o repórter promotor Per2 (2 ug) e a bioluminescência foi então medida utilizando um ensaio de monitorização em tempo real. monitoramento em tempo real da actividade da luciferase do

Per2

promotor mostraram que a atividade oscilou ao longo de um ciclo de aproximadamente 24 h. As actividades de luciferase de quatro amostras replicadas são mostradas. Estas culturas mostraram ritmos circadianos significativa (Tabela 1). (B) os níveis de ARNm de

Per2

foram determinadas por PCR em tempo real para seis placas em cada ponto de tempo. O ARN total foi extraído a cada 4 horas, começando 24 h após o tratamento com dexametasona para um ciclo de 24 h, e

PER2

transcritos foram quantificados. As barras de erro indicam os erros padrão dos valores médios (

n

= 6). Os dados de um único 24 horas após o tratamento com dexametasona foram analisados ​​utilizando o software Cosinor para ritmicidade (Tabela 1). (C) A estrutura do

Per2

promotor e uma análise dos potenciais de transcrição motivos de ligação ao fator nessa região. A região de 2994 pb contém uma sequência de E-semelhante a uma caixa (CACGTT) e uma sequência de HRE-like (ATGTG), semelhante à sequência de consenso HRE (ACGTG) localizado a montante do local de início da transcrição (SAT). (D) A comparação de seqüências: linha superior, a sequência de ratinho; A linha inferior, sequência humana. A sequência de nucleótidos de potenciais motivos de ligação de factor de transcrição para a sequência-E-caixa como e sequência HRE-like são 100% conservada entre rato e humano.

Análise da

Per2

promotor região

um estudo anterior demonstrou que uma sequência-e-caixa como (CACGTT) e sua região a jusante são essenciais para a oscilação da transcrição do

Per2

, um componente crucial de relógios moleculares [24]. Estamos focados em esta região-E-caixa como e HRE. Os motivos de ligação de factor de transcrição localizados no

promotor Per2

em ratos e seres humanos foram analisados ​​utilizando software MatInspector (Genomatix, Munique, Alemanha). A análise da sequência do

Per2 e região promotor revelou alta homologia entre ratos e seres humanos. A análise da sequência revelou também uma sequência E-semelhante a uma caixa (CACGTT) e uma HRE-como sequência (ATGTG), semelhante à sequência de consenso HRE (ACGTG) [25] localizado a montante do local de início da transcrição (SST) (Fig 1C. ). Estas sequências foram 100% conservada entre murganhos e seres humanos (Fig. 1D). Um ensaio de monitorização em tempo real (Fig. 1A) indicou que a região do promotor clonada que é suficiente para produzir oscilação transcricional circadiano em linhas celulares humanas.

A expressão de genes do relógio em linhas celulares de cancro renal

Para examinar a diferença entre Caki-2 e outras linhas celulares, examinamos a expressão de BMAL1, CLOCK, PER2 e proteínas cry1. células Caki-2, 786-O, A498 e proteína expressa BMAL1. Todas as linhas celulares de cancro renal expressa CLOCK e proteínas Cry1, mas não expressam a proteína PER2 (Fig. 2A). blots de comprimento completo e PER2 bmal1 além de um controlo positivo, são apresentados na Figura S2, S3.

Todas as linhas celulares foram lisadas e recolhidas 24 h após a sincronização por 2 h-tratamento com dexametasona. Realizamos quatro replicar Western blot; uma mancha representativo é mostrado. (A) As transferências de Western de extractos de células inteiras de câncer renal (20 ug) com BMAL1, CLOCK, PER2, Cry1 e anticorpos GAPDH são mostrados. blots de comprimento completo e PER2 bmal1 além de um controlo positivo, são apresentados na Figura S2, 3. (B) Western blots de extractos de células completas de cancro renal (20 ug) com HIF1α anticorpos e de GAPDH são mostrados.

a expressão da proteína HIFα em condições de normóxia em linhas celulares de cancro renal

Uma vez que a proteína HIF1α pode ser geralmente sobre-expressos em RCC, nós também analisou a expressão da proteína HIF1α. Em Caki-2 e RCC4 + vector sozinha, proteína HIF1α foi sobre-expresso (Fig. 2B). Considerando os resultados que o

Per2

ritmo circadiano foi mostrado apenas em Caki-2 células, que continham BMAL1, CLOCK, e proteína HIF1α, é possível que HIF1α está relacionado com o

Per2

circadiano ritmo em linhas celulares de cancro renal.

o impacto da HIF1α em

Per2

atividade transcricional

Para analisar o impacto da HIF1α em

Per2

atividade transcricional, células NIH3T3 e U2OS foram transfectadas com um gene repórter de luciferase dirigido por o

Per2

promotor e co-transfectada com

Hif1α

e

Arnt

vector de expressão. A co-transfecção com HIF1α /ARNT aumentou a amplitude de oscilação e não teve nenhuma influência sobre o período de oscilação ou acrofase nestas linhas celulares (Fig. 3A-D, Tabela 2). Os mesmos resultados foram observados em células Caki-2 (Fig. 3E, F, Quadro 2).

células NIH3T3 (A) foram co-transfectadas com o

Per2

repórter promotor (400 ng ) e os plasmídeos de expressão indicados (300 ng) para HIF1α /ARNT ou vector pcDNA3 vazio (600 ng) como um controlo. A bioluminescência foi então medida utilizando um ensaio de monitorização em tempo real. Controlo, transfectadas com vector vazio pcDNA3 (controlo não clonados do vector); + HIF1α /ARNT, transfectadas com os plasmídeos de expressão. as actividades da luciferase de quatro amostras replicadas são mostradas. (B) bioluminescência Destendenciada é mostrado. Período, amplitude e acrofase das oscilações foram medidos nos dias 2 a 5 utilizando o software Cosinor (Ritmo Circadiano Laboratory). Amplitude aumentou significativamente (média ± SEM,

n

= 4) em relação ao controle (

p Art 0,01, Estudante de

t-

teste). Ver o quadro 2. As células U2OS (C) foram co-transfectadas com o

Per2

repórter promotor (400 ng) e os plasmídeos de expressão indicados (300 ng) para HIF1α /ARNT ou vector pcDNA3 vazio (600 ng) como um controlo. A bioluminescência foi então medida utilizando um ensaio de monitorização em tempo real. Controlo, transfectadas com vector vazio pcDNA3 (controlo não clonados do vector); + HIF1α /ARNT, transfectadas com os plasmídeos de expressão. as actividades da luciferase de quatro amostras replicadas são mostradas. (D) Destendenciada bioluminescência é mostrado. Período, amplitude e acrofase das oscilações foram medidos nos dias 2 a 5 utilizando o software Cosinor (Ritmo Circadiano Laboratory). Amplitude aumentou significativamente (média ± SEM,

n

= 4) em relação ao controle (

p Art 0,01, Estudante de

t-

teste). Ver o quadro 2. As células (E) Caki-2 foram co-transfectadas com os

Per2

repórter do promotor (2 ug) e os plasmídeos de expressão indicados (1,5 ug) para HIF1α /ARNT ou vector pcDNA3 vazio (3 ug ) como um controlo. A bioluminescência foi então medida utilizando um ensaio de monitorização em tempo real. Controlo, transfectadas com vector vazio pcDNA3 (controlo não clonados do vector); + HIF1α /ARNT, transfectadas com os plasmídeos de expressão. As actividades de luciferase de quatro amostras replicadas são mostradas. (F) Destendenciada bioluminescência é mostrado. Período, amplitude e acrofase das oscilações foram medidos dos dias 2 a 5 utilizando o software Cosinor (Ritmo Circadiano Laboratory). Amplitude aumentou significativamente (média ± SEM,

n

= 4) em relação ao controle (

p Art 0,01, Estudante de

t

-teste). Ver Tabela 2.

HIF1α não tem nenhum efeito no número de células NIH3T3

Para determinar se HIF1α aumentar a amplitude de oscilação do

Per2

actividades promotoras pelo aumento do número de células, foi realizada contagem de células utilizando ArrayScan XTI (Thermo Scientific). A co-transfecção com HIF1α /ARNT teve nenhuma influência sobre o número de células NIH3T3 (Fig. 4). Isto indica que HIF1α /ARNT aumentou a bioluminescência de

PER2

actividades promotoras que não afectem o número de células.

células NIH3T3 foram co-transfectadas com o Per2 repórter promotor (400 ng) e o indicado plasmídeos de expressão (300 ng) para HIF1α /ARNT ou pcDNA3 vector vazio (600 ng) como um controlo. As placas foram lidas no ArrayScan XTI (Thermo Scientific) para contagem de células tempo indicado após tratamento com dexametasona. Número de células viáveis ​​não foram afetados pela HIF1α /ARNT em todos os momentos (média ± SEM,

n

= 6,

t

-teste de Student).

HIF1α se liga directamente para a sequência HRE-like dentro do

Per2

promotor

para determinar se HIF1α afetada

Per2

transcrição através do elemento HRE-like, um HIF1α- putativa sequência de ligação, foram examinados os efeitos de HIF1α /ARNT em

Per2

expressão utilizando um ensaio de luciferase em células NIH3T3. HIF1α /ARNT aumentou

Per2

atividade transcricional, mas não teve efeito sobre HRE-mutante

Per2

promotores (Fig. 5A, B). CoCl

2 tratamento induz a expressão HIF1α por ligação ao domínio PAS, resultando no bloqueio das HIF1α-pvhl de ligação e, assim, a estabilidade HIF1α [26], [27]. Para investigar o efeito da CoCl

2 induzida HIF1α superexpressão em

Per2

atividade transcricional, as células foram tratadas com CoCl

2. CoCl

2 regulada

Per2

transcrição, mas não teve efeito sobre o HRE-mutante

Per2

promotor (Fig. 5C). Estes resultados sugerem que a sequência HRE-like no

promotor Per2

clonamos respondeu a HIF1α superexpressão. Para investigar se HIF1α se liga directamente para a sequência HRE-like no

Per2

promotor

in vivo

, um ensaio ChIP foi realizada. Cross-linked Caki-2 As células foram imunoprecipitados com anticorpo de coelho anti-IgG de coelho ou HIF1α normal. Os imunoprecipitados resultantes foram analisados ​​por PCR usando primers flanqueando as sequências HRE-like (-476 a -284 pb) do

promotor Per2

. Um aumento notável na intensidade da banda de DNA foi observada para os anti-HIF1α anticorpo de coelho (Fig. 5D, pista 3) mas não para a IgG de coelho normal (Fig. 5D, pista 2). Estes resultados indicaram que HIF1α pode aumentar

Per2

atividade transcricional pela directamente vinculativa para o elemento HRE-like e melhorar a amplitude de oscilação da

Per2

actividades promotoras.

(A ) representação esquemática do mouse

Per2

promotor. A área superior representa o rato do tipo selvagem

Per2

promotor e a área inferior representa o HRE-mutante

Per2

promotor. (B) HIF1α /ARNT potente induzida

Per2

atividade do promotor. O

Per2

promotor e o HRE-mutante

Per2

repórter promotor (60 ng) foram co-transf ectadas com os plasmídeos de expressão indicados (+; 50 ng).

Per2

actividades promotoras foram significativamente aumentados (média ± SEM,

n

= 4,

p Art 0,01,

t

teste de Student) em comparação com o controlo (sem o plasmídeo de expressão), mas o HRE-mutante

Per2

promotor não foi afectada. (C) Vinte e quatro horas após o tratamento com CoCl

2 (10, 30, 100 uM durante 6 horas), a actividade da luciferase foi medida.

Per2

actividades promotoras foram significativamente aumentados (média ± SEM,

n

= 4,

p Art 0,05, ANOVA one-way, seguido por testes de Tukey) concentração -dependently em relação ao controle, mas o HRE-mutante

Per2

promotor não foi afetada. (D) HIF1α interage especificamente com a sequência HRE-like dentro do

promotor Per2

. células Caki-2 foram reticulado, lisadas, e imunoprecipitadas com anticorpo anti-IgG de coelho ou HIF1α normal (controlo negativo). O ADN precipitado foi submetido a PCR com iniciadores específicos para a região do alvo (-476 /-284). Uma aliquota de ADN de entrada foi usado como um controlo positivo. produto de PCR foi observada no anti-HIF1α chip (pista 3) e de ADN de entrada 10% (pista 4). pistas substancialmente menor foi detectada na nenhum chip anticorpo (pista 1) e de coelho normal IgG chip (pista 2).

O efeito de inibir HIF1α no

Per2

ritmo circadiano

a crisina é um flavonoide natural, que é conhecido por inibir a expressão HIF1α reduzindo a síntese de proteínas e, assim, diminui a estabilidade HIFα sem afectar a viabilidade das células [28]. Para examinar o efeito de inibição da proteína de HIF1α em

Per2

ritmo circadiano, as células foram pré-tratadas com diferentes concentrações de crisina. A expressão da proteína HIF1α foi suprimida de forma significativa após a 2 horas de incubação com 100 uM crisina nas células Caki-2 (Fig. 6A, B). A amplitude do ritmo circadiano da

Per2

actividade do promotor diminuiu significativamente após 2 horas de incubação com 100 uM em crisina Caki-2 células (Fig. 6C, D, Tabela 3). Com base nestes resultados, HIF1α podem aumentar os ritmos circadianos de

Per2

ao nível promotor.

(A) células Caki-2 foram cultivadas até 60-70% de confluência. As células foram tratadas com DMSO como um controlo, ou concentrações chrysin diferentes (1, 10, 100 uM) durante 2 h. (B) os níveis de proteína HIF1α foram medidos em valores de densidade óptica normalizada para o respectivo controlo GAPDH carga, então a média ± SEM, e representada graficamente (expressão relativa) para semiquantitativamente comparar os níveis de proteína (

N

= 4). HIF1α expressão foi significativamente suprimida por 100 nM crisina em comparação com o controlo incubada com DMSO (

P

0,05, ANOVA de uma via seguida por teste post hoc de Tukey). células (C) Caki-2 foram transfectadas com o

Per2

repórter promotor (2 ug). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram incubadas com 100 uM crisina ou DMSO durante 2 h. A bioluminescência foi então medida utilizando um ensaio de monitorização em tempo real. As actividades de luciferase de quatro amostras replicadas são mostradas. (D) Destendenciada bioluminescência é mostrado. Período, amplitude e acrofase das oscilações foram medidos nos dias 2 a 5 utilizando o software Cosinor (Ritmo Circadiano Laboratory). Amplitude diminuiu significativamente (média ± SEM,

N

= 4) em comparação com o controlo (

P

0,05). Veja a Tabela 3.

Discussão

Neste estudo, a expressão rítmica do

gene Per2

foi observada em células Caki-2. No entanto,

Per2

actividades promotoras e os níveis de mRNA não têm ritmos circadianos em quaisquer outras linhas celulares. Podem existir algumas diferenças entre Caki-2 e outras linhas de células de cancro renal. Porque

Per2

transcrição do gene é activada pelo factor de transcrição heterodimerizado BMAL1 /CLOCK por ligação à sequência-e-caixa como [24], examinámos a expressão de proteína BMAL1 e CLOCK nestas linhas celulares. células Caki-2, 786-O, e A498 expressas BMAL1, e todas as linhas de células de proteínas CLOCK contido. Além disso, todas as linhas celulares de cancro renal proteína expressa Cry1, mas não expressam a proteína PER2. Em células Caki-2, também examinámos a expressão de proteína PER2 em intervalos de 4 h começando 24 h após o tratamento com dexametasona. No entanto, não foi detectada proteína PER2 em todos os pontos de tempo (Fig. S4).