Abstract
A combinação de imagens de câncer molecular-alvo e terapia é uma estratégia emergente para melhorar diagnóstico de câncer e minimizar os efeitos colaterais dos tratamentos convencionais. Aqui, nós geramos uma proteína recombinante, EC1-glic-p53C, fundindo peptídeo EC1, um ligando artificial de ErbB2, com
Gaussia
luciferase (glic) e um peptídeo de activação de p53, p53C. EC1-glic-p53C foi expressa e purificada a partir de
E. coli
BL21.
In vitro
experimentos mostraram que EC1-glic-p53c ficou estável em atividade luminescente e seletivamente alvo células BT474-superexpressão ErbB2 para imagem de bioluminescência. Além disso, o EC1-glic-p53C internalizado em células BT474 exerceu sua função para reativar p53 e proliferação celular significativamente inibido. Nos ratinhos portadores de tumor, a imagem de bioluminescência alvo-ErbB2 e o efeito terapêutico de EC1-gluc-p53C, também foram observados em tumores BT474 especificamente, mas não em tumores MCF-7, que não sobre-expressa ErbB2. Assim, o presente estudo demonstra EC1-glic-p53C ser um reagente theranostic eficaz segmentação ErbB2 por imagem de bioluminescência e terapia do cancro
Citation:. Han XJ, Sun LF, Nishiyama Y, Feng B, Michiue H, Seno H, et ai. (2013) Protein Theranostic Segmentação ErbB2 para Bioluminescência Imaging and Therapy para o cancro. PLoS ONE 8 (9): e75288. doi: 10.1371 /journal.pone.0075288
editor: Xiaoyuan Chen, NIH, Estados Unidos da América
Recebido: 18 de abril de 2013; Aceito: 12 de agosto de 2013; Publicação: 17 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Han et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por grant-in-aid para Jovens cientistas (B) do Ministério da Educação, Ciência, Desporto e Cultura do Japão (Não: 21790202, http: //www.waseda.jp/rps/en/manual/kaken hi_honbun.html) e por Grant-in-Aid para a Investigação científica da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (Não: 22,00119, http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
ErbB2 é um membro do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) a família de tirosina-quinases receptoras, também chamada família ErbB. A família ErbB inclui quatro membros, ErbB1, ErbB2, ErbB3 e ErbB4. Existem vários ligandos endógenos para os receptores ErbB com a excepção de ErbB2 [1]. A actividade de tirosina-quinase de ErbBs podem ser activados por ligandos endógenos e o homo- ou hetero-dimerização de receptores ErbB, que está envolvido na regulação da proliferação celular e sobrevivência celular [1-3]. Além disso, ErbB2 tem sido implicado na patogénese e progressão do tumor [4-6]. Clinicamente, a sobre-expressão de ErbB2 está associado com cerca de 30% dos cancros da mama, cancros do ovário [7] e outros tipos comuns de cancros, incluindo o pulmão, gástrico, cancros orais e [8]. A sobre-expressão também está associado com a metástase e resistência terapêutica e mau prognóstico de cancro [9-11]. Assim, a ErbB2 pode ser um alvo molecular promissora para a imagiologia e tratamento do cancro utilizando anticorpos monoclonais e vectores de direccionamento peptideo [12,13]. Num estudo de apresentação de fagos, foram identificados vários pequenos péptidos cíclicos artificiais com afinidade específica para ErbB2. CE1, um destes péptidos artificiais, ligada ao domínio extracelular de ErbB2 em células vivas e espécimes congelados frescos humanos de cancro da mama [14]. Além disso, EC1 conjugado com biotina e a proteína recombinante EC1-eGFP retido afinidade para ErbB2 e foram internalizados por células cancerosas que sobre-expressam ErbB2-[14,15]. Recentemente, foram relatados bivalentes e multivalentes formas de EC1 ligando-Fc em lipossomas para melhorar a afinidade para ErbB2 e melhorar a internalização [16]. Assim, peptídeo EC1 pode ser um potencial ligando artificial para a segmentação ErbB2.
Na patogênese do tumor, várias mutações anormais são encontrados em genes supressores de tumores. Um dos genes supressores de tumores mais conhecidos é
p53
, que é um importante regulador da apoptose e o gene mais frequentemente mutado no cancro [17,18]. Restauração da atividade p53 foi provou ser um meio eficaz de tratamento de células cancerosas com p53 mutações [19,20]. Nos nossos estudos anteriores [21-23], uma p53 recombinante de comprimento completo foi entregue com sucesso em células de glioma humanas malignas, oral e células de cancro da bexiga por meio da fusão com poli-arginina, um péptido de penetração celular (CPP). Verificou-se que o p53 recombinante de comprimento completo teve um efeito inibidor significativo sobre a proliferação de células cancerosas. No entanto, o grande tamanho molecular e rápida degradação pela via da ubiquitina-proteassoma influenciou significativamente a eficiência de transdução de proteína e o efeito de p53 transduzida em células cancerosas [24]. O terminal C da p53 é um domínio rico em lisina sujeito a uma variedade de modificações pós-tradução [25,26]. Um péptido derivado a partir da extremidade C-terminal de ligação activa com p53
In vitro
através de um mecanismo desconhecido [27] de ADN específica. Foi relatado que o peptídeo C-terminal de derivados de p53 (p53C) induziu apoptose rápida em células de cancro da mama com mutações p53 endógenos ou sobre-expresso de tipo selvagem p53 (em peso), mas não era tóxico para as linhas de células humanas não-malignas que contenham em peso p53 [28 ]. Além disso, o peptídeo p53C fundido com CPP inibe a proliferação de células cancerosas, reativando p53 endógena, e aumenta significativamente a vida útil em modelos animais de carcinomatose peritoneal terminal e cancro da bexiga
in vivo
[29-31]. Estes estudos demonstram a reativação da proteína p53 por peptídeo p53C ser um meio promissor para a terapia do cancro.
imagem de bioluminescência está emergindo como uma maneira relativamente simples e de baixo custo e extremamente sensível para monitorar processos biológicos dinâmicos em intacta As células e animais que vivem [32]. Nos últimos anos, a tecnologia desenvolveu-se rapidamente com melhorias na repórteres de luciferase e instrumentação [33]. As luciferases mais comuns para a imagem de bioluminescência incluem
Firefly
luciferase (FLUC),
Renilla
luciferase (RLuc) e
Gaussia
luciferase (glic). Cada luciferase tem propriedades distintas na aplicação da imagem de bioluminescência. Fluc (62 kDa) catalisa a oxidação de luciferina para produzir bioluminescência na presença de O
2, de magnésio e ATP [34]. RLuc (36 kDa) e Gluc (19,9 kDa) catalisar a descarboxilação oxidativa de coelenterazina de emitir luz independente de ATP. No entanto, RLuc tem um rendimento quântico de Fluc inferior, e também a eficiência menos enzimática [35,36]. Glic produz cerca de 200- (
in vivo
) para 1000 vezes (
in vitro
) mais bioluminescência em células de mamíferos do que FLUC e RLuc [37]. Portanto, o seu tamanho molecular pequeno (19.9kDa), a independência da ATP e forte emissão fazer glic muito mais adequado para imagem de bioluminescência
in vitro
e
in vivo
[38,39].
O conceito de “Theranostic” foi originada por Funkhouser em 2002 de um de seus comentários [40]. Theranostics é definido como um material que combina as modalidades de terapia e diagnóstico por imagem, ao mesmo tempo dentro da mesma dose. O objectivo da theranostic é doar materiais com a capacidade de monitorizar o tecido tratado e eficácia no período a longo prazo [41]. reagentes Theranostic foram desenvolvidos rápido na década anterior, especialmente após o surgimento de algumas novas sondas ópticas e biomoléculas potentes para a segmentação e terapia. No presente estudo, uma nova proteína de bioluminescência de metas de ErbB2 foi construído pela fusão EC1 com glic e peptídeo p53C. Duas linhas de células de carcinoma da mama humano, MCF7 sem expressão de ErbB2 e BT474 superexpressão ErbB2, foram utilizados para avaliar o papel da EC1-glic-p53C na imagem de bioluminescência específica e terapia do cancro. Observamos que EC1-glic-p53C não só alvo ErbB2 por imagem de bioluminescência, mas a proliferação celular e tumor de crescimento também seletivamente inibido de BT474
in vitro
e
in vivo
. Os resultados deste estudo indicam que EC1-glic-p53C pode ser um reagente theranostic promissor alvo ErbB2 por imagem de bioluminescência e terapia.
Materiais e Métodos
cultura celular e detecção de expressão ErbB2
as linhas de células MCF7 e BT474 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). células BT474 realizar uma mutação sem sentido (E285K) no gene p53 [42], enquanto que as células MCF7 com sobre-expressão de p53 wt [28]. células BT474 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 ug /ml de penicilina-estreptomicina (P /S). células MCF-7 foram cultivadas em meio DMED suplementado com 10% de FBS e 100 ug /mL de P /S. Os médiuns, FBS e P /S foram de Invitrogen. Todas as culturas foram mantidas num incubador humidificado a 37 ° C com uma atmosfera contendo 5% de CO
2.
A expressão de ErbB2 em células MCF-7 e BT474 foi analisada por Western immunoblotting. Resumidamente, as células MCF-7 e BT474 em 35mm pratos foram lavados uma vez com PBS e raspadas em 1 × tampão de amostra de SDS. Os lisados celulares foram sujeitos a 6% de SDS-PAGE e imunotransferidas com anticorpo de coelho anti-ErbB2 (1: 1000; Cell Signaling) durante a noite a 4 ° C. anticorpo secundário conjugado com HRP (Sigma-Aldrich) foi usado em 1: 2000. sinais immunoblotting foram detectadas pelo sistema de imagens 5000 Versa Doc (Bio-Rad) com um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA).
plasmídeo construção
O plasmídeo pGLuc foi comprado de LUX biotecnologia Ltd (Escócia, Reino Unido). O gene foi amplificado gluc a partir do plasmídeo utilizando um iniciador de sentido directo (5′-GGATCCGAAACCAACTGAAAACAATGAAG-3 ‘) e iniciador anti-sentido (5′-GTCGACATCACCACCGGCACCCTTTAT-3′). O produto de PCR foi ligado ao vector pCR2.1 TOPO (Invitrogen) para a amplificação e novamente clonado no vector pET52b (Invitrogen) para construir-gluc pET52b. foram preparados os seguintes sentido e anti-oligonucleotídeos (Hokkaido sistema de ciência, Japão) com locais de enzimas de resistência apropriados para peptídeo EC1 ou p53C; para EC1; 5’-GGGTGGACTGGCTGGTGCCTGAATCCAGAAGAATCTACTTGGGGATTCTGTACTGGATCTTTCGGTGGAGGTAGTTCAG-3 ‘(sentido, sublinhado indica
Sam
I e
Bam
HI sites) e 5′-GATCCTGAACTACCTCCACCGAAAGATCCAGTACAGAATCCCCAAGTAGATTCTTCTGGATTCAGGCACCAGCCAGTCCACCC-3′ (antisense, sublinhado indica
Bam
HI e
Sam
Eu sites), e para p53C; 5′- TCGACGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAAGGCGC-3 ‘(sentido, sublinhado indica
Sal
Ⅰand
Não
Ⅰsites), e 5′-GGCCGCGCCTTTTTTATGGCGGGAHHTAGACTGACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGTGAGCCCTGCTCCCG-3′ (sentido, sublinhado indica
Não
ⅰand
Sal
ⅰsites). Os oligonucleotídeos para EC1 e p53C foram modificadas por fosforilação em 5 ‘. Os oligonucleótidos de sentido e anti- sentido (10 pmol de cada) foram co-incubadas a 95 ° C durante 10 min, e recozido à temperatura ambiente para formar ADN de cadeia dupla. O DNA de cadeia dupla para EC1 ou p53C foi ligado a glic-pET52b tratada com as enzimas de resistência apropriados para construir EC1-glic-pET52b ou EC1-glic-p53C-pET52b. A mutagénese dirigida foi introduzida a BamHI em EC1-gluc e CE1-gluc-p53C usando um kit QuikChange (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores para a mutagénese eram 5’-GTGGAGGTAGTTCAGGAACCAAACCAACTG-3 ‘(sentido, sublinhado indica o nucleótido mutado), 5′-CAGTTGGTTTGGTTCCTGAACTACCTCCAC-3’ (anti-sentido). Glic, EC1-glic e EC1-glic-p53C foram então subclonados em pGEX-6P-1 entre o
Bam
HI e
Eco
sites de RI para purificação de proteínas. As sequências de plasmídeos construídos foram confirmados usando um sequenciador ABI 3100.
Expressão e purificação de proteínas recombinantes
A expressão e purificação de proteínas recombinantes foram realizadas como descrito anteriormente [21]. Resumidamente,
E. coli
BL21 (DE3) transformada com o plasmídeo para Gluc, EC1-gluc ou EC1-gluc-p53C foi cultivado num meio LB contendo 100 ug /ml de ampicilina a 37 ° C. Quando a OD600 atingiu 0,6, a expressão das proteínas fundidas-GST foi induzida pela adição de isopropil 0,2 mM de 1-tio-β-D-galactopiranósido a 25 ° C durante a noite. As proteínas de fusão foram purificadas utilizando uma coluna de glutationa Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Para clivar a GST a partir das proteínas de fusão, as proteínas purificadas foram ainda tratados com protease PreScission (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas recombinantes foram sujeitas a 15% de SDS-PAGE e confirmado por coloração com azul de Coomassie brilhante e imunotransferência com anti-coelho
Gaussia
soro de Luciferase (1: 1000, Nanolight). As proteínas foram finalmente dialisada contra PBS, e as concentrações foram determinadas utilizando um kit de ensaio de proteína (Bio-Rad Laboratories). As aliquotas de proteína foram armazenadas a -80 ° C antes de usar.
Preparação de coelenterazina (CTZ)
O substrato para gluc foi preparado como descrito anteriormente [32]. Resumidamente, CTZ (Nanolight) foi dissolvido em metanol acidificado (1 gota de HCl concentrado (12,4 N) em 10 ml de metanol) a uma concentração de 5 mg /ml. Alíquotas de 100 ul foram armazenadas a -80 ° C. Para imagem de luminescência, as alíquotas de CTZ (5mg /ml) foram diluídas com PBS (contendo 5 mM de NaCl, pH 7,2) para uma maior produção de luz e mais estabilidade.
Ensaios da actividade luminescente e a estabilidade de proteínas recombinantes
para determinar a actividade luminescente das proteínas purificadas, 2 ug de cada proteína foi transferida para uma placa de 96 poços. A bioluminescência foi medida utilizando um luminómetro de placas (Microlumat LB acrescido de 96V, tecnologias Berthold) após a adição de 10 ul de CTZ (20 uM). atividade bioluminescente foi relatada em unidades relativas de luz (RLU) medidos com um tempo de integração de 10 segundos e calculadas como RLU por micromole para cada proteína. Os valores para EC1-glic e EC1-glic-p53C foram normalizados com glic.
A estabilidade das proteínas recombinantes foi avaliada como descrito anteriormente [38]. As aliquotas de proteína foram incubadas com um volume igual de soro de murganho (Sigma) a 37 ° C. Em cada ponto de tempo, retiraram-se amostras para a imagem de bioluminescência e Western blotting. Na análise de estabilidade a bioluminescência, a percentagem da quantidade inicial de RLU em cada ponto de tempo foi representada para cada proteína. Para detectar a degradação de proteínas após a incubação com soro, as amostras retiradas em cada ponto de tempo foram submetidas a electroforese em gel de acrilamida SDS-PAGE a 15%, e coradas imunologicamente com anti-coelho
Gaussia
soro de Luciferase a uma diluição de 1: 1000. anticorpo secundário conjugado com HRP (Rabbit; Sigma-Aldrich) foi usado em 1: 2000
imagem de bioluminescência
in vitro
, Internalização por células que sobre-expressam ErbB2 e WST-1 ensaio
.
Para imagem de bioluminescência células
in vitro
, MCF7 e BT474 foram cultivadas em placas com fundo de vidro de 35 mm. Para melhorar a aderência de células MCF-7 e BT474, todos os pratos de fundo de vidro foram pré-revestidas com laminina (Roche). células MCF-7 e BT474 foram incubadas com 1 uM de cada proteína, durante 24 h. Após três lavagens com DMEM, bioluminescência foi detectada com um Olympus Luminoview LV 200 (Bio-luminescência microscópio) imediatamente após a adição de 1 ug /mL CTZ em DMEM isento de soro. As imagens foram adquiridas e analisadas com o software Metamorph (dispositivos Molecular).
Para examinar a internalização de proteínas EC1-fundidos em ErbB2 superexpressão células cancerosas, as células BT474 foram incubadas com 1 M de glic, EC1-glic ou EC1- glic-p53C. No estudo de bloqueio, as células BT474 foram tratados com anticorpo anti-ErbB2 contra o domínio extra-celular de ErbB2 (galinha, 1,0 ug /mL, Abcam) 1 h antes da incubação com EC1-gluc ou EC1-gluc-p53C. Após 24 h, as células foram lavadas três vezes com PBS e tripsinizadas. O lisado celular foi preparada e submetida a 15% de SDS-PAGE. A internalização da proteína de fusão foi imunologicamente com coelho anti-
Gaussia
soro luciferase. β-actina foi utilizado como um controle endógeno.
Para avaliar o efeito terapêutico da EC1-gluc-p53C
In vitro
, a viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio de WST-1 como descrito anteriormente [ ,,,0],21]. Após 3,0 × 10
3 MCF7 e 1,0 × 10
4 BT474 células foram semeadas em placas de 96 poços de fundo plano, foram cultivadas em DMEM ou meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino durante 24 h. As células foram, então, suplementadas com 1 uM de proteína ou PBS (day0) e após 96 h em cultura (Day4). A viabilidade celular a partir do dia 0 até ao dia 4 foi medida utilizando o ensaio de WST-1 de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science). Para determinar o efeito dose-dependente de EC1-gluc-p53C sobre a proliferação de células BT474, a proteína foi usada a 0,1 ~ 2,0 ^ M, e o ensaio de WST-1 foi realizado no dia 4.
Ensaio Repórter para transactivação de p53 conduzido
O ensaio de repórter foi realizada como descrito anteriormente [22]. Resumidamente, a luciferase repórter vector pGL2-basic (Promega) contendo um fragmento de 2,4 kbp do p21 humana
WAF1
promotor foi um presente de Drs. T. Akiyama (Universidade de Tóquio) e K. Yoshikawa (Universidade de Osaka). células BT474 cultivadas até 80% confluentes em pratos de 35 mm de diâmetro foram transfectadas com o vector repórter de luciferase por lipofectamina 2000 (Invitrogen). Após 24 h, as células foram incubadas com 1 uM de gluc, EC1-Gluc, EC1-gluc-p53C ou o mesmo volume de PBS durante 24 h, e a cultura prosseguiu em novo meio 2 h antes da colheita celular. O lisado celular foi utilizado para medir a actividade da luciferase com um luminetro e Luciferase Assay System (Promega). A atividade de fundo luciferase foi subtraído em todos os experimentos. Cinco experiências independentes foram realizados para cada condição.
Preparação de ratinhos
ratinhos nus (Balb /c SLC-nu /nu, do sexo feminino, 6 ~ 8 semanas) foram adquiridos a Charlesriver apresentando tumores , Japão. O plano de experiências com animais foi analisado e aprovado pelo comitê de ética em experimentação animal da Universidade de Okayama sob a IDs Oku-2010378, Oku-2.011.400. pelotas 17β-estradiol (0,72 mg; Innovative Research of America) foram implantados 4 dias antes do transplante de células de tumor e manteve-se no lugar até o final do estudo. As células MCF-7 e BT474 cultivadas foram lavadas duas vezes com PBS, typsinized, e colhidas por centrifugação. As células (5,0 x 10
6 células) suspensas em Matrigel (BD Bioscience) foram transplantadas subcutaneamente em ambos os flancos de murganhos anestesiados com injecção intraperitoneal de 5 mg /100 g de solução de pentobarbital, em condições assépticas. Os ratos com tumores desenvolvidos por 10 ~ 14 dias foram utilizados para
In vivo
experimentos. Durante o desenvolvimento do tumor, respiração e atividade comportamental foram monitorados duas vezes por dia para avaliar a dor em camundongos. Os experimentos foram imediatamente interrompido se camundongos pareciam sintoma significativo da dor. Todos os ratinhos foram sacrificados por injecção intraperitoneal de 15 mg de pentobarbital solução /100 g após as experiências.
A expressão de ErbB2 em MCF7 e BT474 xenoenxertos foi confirmada por imunofluorescência (IF) de coloração. fatias embebidos em parafina de tumores foram preparadas com uma espessura de 5 um. Em primeiro lugar, as observações histológicas de tumores xenoenxertados foram feitas utilizando H E de coloração. Se a coloração foi então realizada com anticorpo anti-ErbB2 (01:50; Cell Signaling). O anticorpo secundário foi Cy3-conjugado anti-IgG de coelho (1: 100; Invitrogen, Molecular Probes). O núcleo foi contra-corada com 0,1 ug /ml de Hoechst 33248 (Sigma) durante 5 min. sinais de fluorescência foram observados usando um microscópio confocal a laser (FV300, Olympus).
retenção site de Tumor de EC1-glic-p53C em xenoenxertos tumorais
Em seguida, 30 mL de EC1 glic-p53C proteína (0,5 ug /uL) foi injectada em intratumoral xenoenxertos MCF-7 e BT474 em ratinhos nus. A 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a injecção, os ratinhos foram sacrificados. Os tumores foram excisados e imediatamente fixados em paraformaldeído a 4%. fatias embebidos em parafina de tumores MCF-7 e BT474 foram preparadas a 10 mM. imunofluorescência foi realizada para analisar a distribuição de EC1-glic-p53C em tumores. A imunofluorescência foi realizada de acordo com as instruções que acompanham o coelho anti-
Gaussia
soro luciferase. O anticorpo secundário foi IgG de coelho conjugado com FITC (1: 100, Molecular Probes, Invitrogen). sinais de fluorescência foram observados usando um microscópio confocal a laser (FluoView, Olympus, Japão).
imagem de bioluminescência
in vivo
Para imagem de bioluminescência
in vivo
, 30 jil de proteína EC1-gluc-p53C (0,5 ug /uL) foi injectada em intratumoral os xenoenxertos MCF-7 e BT474 estabelecidos em ratinhos nus. No 6, 8, 12 e 24 horas após a injecção, os ratinhos foram fotografadas por injecção através de uma veia da cauda com 100 uL de solução de CTZ (a 3 mg /kg) sob anestesia utilizando uma câmara CCD arrefecida (IVIS Lumina-II, Caliper Life Sciences ), tal como descrito anteriormente [39]. A intensidade bioluminescente da região selecionada sobre o tumor foi registrado como fótons máximas s
-1 cm
-2 steradian
-1.
Efeito da EC1-glic-p53C no crescimento do tumor xenotransplantes
MCF7 e BT474 em ambos os flancos de ratinhos nus foram autorizados a crescer até um volume médio de ~ 100 milímetros
3 ± 10 milímetros
3 foi obtido antes da injeção de proteína. Em seguida, 30 uL de proteína recombinante purificada (0,5 mg /mL) ou 30 uL de PBS foram injectadas intratumoralmente em MCF7 e BT474 xenoenxertos todos os dias durante 5 dias. Os ratinhos foram monitorizados diariamente e o volume do tumor foi medido utilizando calibradores de Vernier, duas vezes por semana digitais. Durante todo o curso da terapia no experimento carga tumoral nenhum rato morreu. O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula: Volume do tumor = L x W
2 × 0,5 (G é o diâmetro mais longo, W é o diâmetro mais curto)
A análise estatística
de dados. são apresentados como a média ± SD ou média ± EPM Os dados foram analisados utilizando o teste t de Student para comparar duas condições ou ANOVA seguido por comparações planejadas de várias condições, e P 0,05 foi considerado significativo
Resultados
Purificação e caracterização bioquímica de. as proteínas recombinantes
as três construções de proteína de fusão com o GST foram expressos em
E. coli
BL21 e purificada utilizando uma coluna de glutationa Sepharose 4 Fast Flow. Após purificação, o marcador GST foi clivado pela protease PreScission para colher Gluc, EC1-gluc e CE1-gluc-p53C, como mostrado na Figura 1A. Glic e EC1-glic foram utilizados como proteínas de controle. Azul de Coomassie brilhante coloração revelou a pureza de todos os três proteínas para ser 80%. Os tamanhos moleculares de gluc, EC1-gluc e CE1-gluc-p53C foram de aproximadamente 20, 23, e 25 kDa, respectivamente (Figura 1B). Na transferência de Western, as principais bandas de gluc, EC1-gluc e CE1-gluc-p53C e bandas menores adicionais correspondentes às proteínas fundidas-GST foram observados (Figura 1C). Além disso, uma perda de actividade bioluminescente foi induzida pela fusão de EC1 e péptido p53C com gluc. Uma redução de aproximadamente 30% e 50% foi detectada na actividade bioluminescente da EC1-gluc e CE1-gluc-p53C comparação com glic, respectivamente (Figura 1D).
a) do esquema de purificação de EC1-gluc -p53C com o sistema de expressão de GST. O marcador GST foi clivado pela protease PreScission após purificação. b) coloração com azul brilhante de Coomassie de proteínas purificadas após 15% de SDS-PAGE. Pista 1 ~ 4 são marcador, glic, EC1-glic e EC1-glic-p53C, respectivamente. c) As proteínas purificadas após 15% SDS-PAGE foram detectadas utilizando Western blot com coelho anti-
Gaussia
soro luciferase. Lanes 1 ~ 3 são glic, EC1-glic e EC1-glic-p53C, respectivamente. d) As actividades bioluminescentes das proteínas purificadas. Cada proteína (2 ug) foi avaliada utilizando um luminómetro de placas. Os valores bioluminescentes de EC1-glic e EC1-glic-p53C foram normalizados com glic. n = 6 cada, * p . 0,01
A estabilidade da glic, EC1-glic e EC1-glic-p53C foi avaliada por incubação em soro de ratinho a 37 ° C. A estabilidade de gluc foi melhorada pela fusão de EC1 e p53C. A meia-vida da actividade luminescente de gluc foi determinada como 18,6 horas, enquanto que a de EC1-gluc e CE1-gluc-p53C era 189,5 e 216 horas, respectivamente (Figura 2A). Como resultado, a actividade bioluminescente da EC1-gluc-p53C atingiu 92% do que gluc a 3 h após a incubação em soro (Figura 2b). Além disso, a degradação das três proteínas no soro também foi examinado por transferência de Western utilizando anticorpo anti-gluc. Todas as três proteínas estavam estáveis contra a degradação quando incubado em soro a 37 ° C (Figura 2c). Estes resultados sugerem que a actividade bioluminescente e estabilidade de EC1-glic-p53C para ser adequado para aplicação tanto
in vitro
e
in vivo
.
Proteínas incubadas com um volume igual de soro de rato a 37 ° C foram retiradas nos pontos de tempo indicados para avaliação da actividade bioluminescente (a) e Western blotting (c). b) A actividade bioluminescente da EC1-gluc-p53C e gluc foi examinada 3 h após incubação em soro. Os valores bioluminescentes de EC1-glic-p53C foram normalizados com glic. n = 6 cada.
EC1-glic-p53C alvos ErbB2 por imagem de bioluminescência
in vitro
Duas linhas celulares de carcinoma da mama humano, MCF7 e BT474, foram utilizado para avaliar a imagem alvo-ErbB2
in vitro
. A sobre-expressão de ErbB2 em BT474 foi confirmada por transferência de Western, enquanto que a expressão de ErbB2 em células MCF-7 foram indetectáveis (Figura 3a). Para detectar o alvo bioluminescência-ErbB2, células MCF-7 e BT474 foram tratadas com 1 uM de proteínas recombinantes. Um sinal forte foi detectada em células BT474-superexpressão ErbB2 incubadas com EC1-glic e EC1-glic-p53C (Figura 3b, a figura S1). Em contraste, nenhuma bioluminescência significativa foi observada em células MCF7 foram incubadas com cada (Figura 3b, Figura S1) da proteína. Além disso, a internalização das proteínas recombinantes foi também observada em células incubadas com EC1 BT474-gluc e CE1-gluc-p53C, e a internalização das proteínas fundidas-CE1 foi principalmente indetectável, quando o domínio extracelular de ErbB2 foi bloqueada por anti- ErbB2 (Figura 3c). Estes resultados sugerem que EC1-glic e EC1-glic-p53C reter afinidade para ErbB2, e são internalizados em células que sobre-expressam ErbB2
in vitro
.
a) A expressão de ErbB2 em MCF7 e BT474 células. O lisado celular das duas linhas de células foi sujeito a 6% de SDS-PAGE e imunotransferidas com anticorpo anti-ErbB2. β-actina foi utilizado como um controle endógeno. b) imagem de bioluminescência
em
vitro
. As células incubadas com 1 uM de CE-gluc-p53C foram lavadas com meio de cultura sem soro. As imagens foram adquiridas com um microscópio bioluminescência imediatamente após a adição de 1 ug /mL CTZ. I e III, as imagens bioluminescência; II e IV, imagens de contraste de fase. Barra = 100 um. c) A internalização de proteínas EC1-fundidas em células BT474 que sobre-expressam ErbB2. As células foram incubadas com 1 uM de proteína durante 24 h, Pista 1: gluc; pista 2: EC-glic-p53C; pista 3: EC-glic; pista 4: anti-ErbB2 + EC1-glic-p53C; pista 5: anti-ErbB2 + EC-glic. A internalização da proteína de fusão foi imunologicamente com coelho anti-
Gaussia
soro luciferase. β-actina foi usado como um controle endógeno.
EC1-glic-p53C inibe selectivamente a proliferação de células BT474-superexpressão ErbB2
ensaio de WST-1 foi utilizado para avaliar o efeito do proteínas recombinantes sobre a proliferação de células MCF-7 e BT474. EC1-glic-p53C inibiu significativamente a proliferação de células MCF-7 BT474, mas não no dia 3 e 4 (Figura 4a). As proteínas de controlo, gluc e CE1-Gluc, não teve nenhum efeito significativo sobre a proliferação de qualquer das linhas de células (Figura 4a). Além disso, o efeito de EC1-gluc-p53C sobre a proliferação de BT474 foi dependente da dose (Figura 4b). Além disso, os resultados do ensaio de repórter de luciferase dirigido por transactivação de p53 indicou que o péptido p53C era activa e reactivada p53 endógeno quando internalizados em células BT474 (Figura 4c). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o efeito inibitório de EC1-gluc-p53C sobre a proliferação de células cancerosas tem uma propriedade de direccionamento ErbB2 e é devido à eficácia de péptido p53C na proteína de fusão.
a) Tempo alterações dependentes da proliferação de células MCF7 (painel superior) e BT474 células (painel inferior). As células foram suplementadas com 1 uM de cada proteína recombinante ou PBS (controlo) no dia 0 e após 96 h em cultura (dia 4). A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio de WST-1 a cada 24 h. ♦, PBS (controlo); ■, glic; ▲, EC1-glic; ×, EC1-glic-p53C. n = 6 cada. * P 0,05 e ** P 0,01 vs controlo. b) efeito dose-dependente de EC1-gluc-p53C sobre a proliferação de células BT474. células BT474 foram tratados com EC1-gluc-p53C em várias concentrações ou PBS (Cont.), e o ensaio de WST-1 foi realizada no dia 4. n = 6 cada. *, P 0,05; **, P 0,01. c)-driven p53 atividade transcricional com o p21
WAF1
ensaio de repórter luciferace. BT474 transfectadas com o vector repórter de luciferase foram incubadas com 1 uM de gluc, EC1-Gluc, EC1-gluc-p53C ou PBS durante 24 h. p21
WAF1
atividades repórter da luciferase nas células foram medidas com Luciferase Assay sistema. Os dados são apresentados como a média ± S.E.M.
n
= 5 em cada grupo; ** P 0,01.
EC1-glic-p53C alvo ErbB2 por imagem de bioluminescência
in vivo
Para os experimentos
in vivo
, preparamos ratos com MCF7 e BT474 tumores xenoenxertados em ambos os flancos. As observações histológicas dos tumores foram feitas utilizando H E a coloração (Figura S2a). Alta expressão de ErbB2 em tumores BT474 também foi confirmada pelo IF coloração (Figura S2B). Para avaliar a propriedade de metas de ErbB2 de EC1-glic-p53C
in vivo
, a retenção de EC1-glic-p53C em tumores após injecção intratumoral foi examinado por coloração IF com um anticorpo anti-glic. EC1-gluc-p53C era detectável em tumores BT474 durante até 24 h após a injecção. Em contraste, EC1-gluc-p53C foi apenas fracamente detectada em tumores MCF7 até 6 h após a injecção (Figura 5). O resultado sugere que o tempo de retenção de EC1-gluc-p53C para ser muito maior do que os tumores em BT474 MCF7. Com base no tempo de retenção de EC1-gluc-p53C em tumores, as imagens foram adquiridas bioluminescentes 6, 8, 12 e 24 h após a injecção de proteínas. O sinal foi detectado nos tumores BT474 durante até 24 h, enquanto que não foi detectável nos locais tumorais MCF7 8 h após a injecção da proteína (Figura 6). Estes resultados sugerem que a propriedade de metas de ErbB2 de EC1-glic-p53C facilita a sua retenção em tumores BT474 e imagem de bioluminescência
in vivo
.
Nos pontos de tempo indicados após a injeção intratumoral de EC1-glic -p53C, os ratinhos foram mortos e os tumores foram excisados. Os tumores foram então imediatamente fixadas com PFA a 4%. fatias embebidos em parafina de tumores foram preparadas com uma espessura de 10 um.