Abstract
Para confirmar o significado clínico da NF-kB e expressão da proteína JNK dos candidatos experimentalmente identificados para predizer o prognóstico para pacientes com tratamento de 5-FU, avaliamos a expressão da proteína de espécimes removidos cirurgicamente. Um total de 79 amostras foram obtidas a partir de 30 gástrica e 49 pacientes com câncer colorretal submetidos à ressecção R0 seguido de pós-operatório 5-FU com base quimioterapia adjuvante. os exames de imuno-histoquímica de NF-kB e de JNK em micromatrizes de tecidos (TMA) revelou que significativamente mais curto o tempo de colocação de recaída (TTR) em ambos NF-kB (+) e JNK (-) subgrupos em ambos gástrica (NF-kB (+) ,
p = 0,0002
, HR11.7 95% CI3 3,2-43,4;. JNK (-),
p
= 0,0302, HR4.4, IC 95% 1,2-16,6) e cólon (NF-kB (+),
p
= 0,0038, HR36.9, IC 95% 3,2-426,0; JNK (-),
p
= 0,0098, HR3.2, 95% CI 1.3-7.7) cancros. Estes padrões de expressão de proteínas também mostram forte poder discriminadamente em pacientes com câncer gástrico para a taxa de sobrevida global, sugerindo um potencial utilidade como marcadores prognósticos ou Chemosensitivity. expressão da linha de base destas proteínas, utilizando linhas celulares de cancro gástrico demonstraram os padrões recíprocas entre o NF-kB e da JNK, ao mesmo tempo de exposição de 5-FU uma destas linhas celulares única induzida de NF-kB, o que sugere que o NF-kB desempenha um papel dominante na resposta ao 5 -FU. siRNA experiências subsequentes confirmaram que o silenciamento de genes de NF-kB aumento da sensibilidade específica 5-FU, ao passo que de JNK não afectou a quimiossensibilidade. Estes resultados sugerem que a expressão destas proteínas pode auxiliar nas decisões envolvidas com quimioterapia adjuvante para cancros do tracto gastrointestinal
citação:. Ishida K, Nishizuka SS, Chiba T, Ikeda H, K Kume, Endo F, et ai. (2012) Molecular marcador Identificação de Previsão Relapse em 5-FU-base Quimioterapia Adjuvante em gástrico e colo-rectal. PLoS ONE 7 (8): e43236. doi: 10.1371 /journal.pone.0043236
editor: Anthony WI. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 22 Março, 2012; Aceito: 18 de julho de 2012; Publicação: 14 de agosto de 2012
Direitos de autor: © Ishida et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por: Fundação de Pesquisa Keiryokai (101) por SSN; KAKENHI (21591676); Grant-in-Aid para a Investigação Científica (C) por S.S.N; e MIAST (Medical Innovation pela Ciência Avançada e Tecnologia) projeto do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, JAPÃO por S.S.N, K.K., N.U., CM, T. S., e G. W. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Embora vários regimes de tratamento padrão foram estabelecidas, existe ainda uma grande necessidade de identificar quimiossensibilidade ou prognósticos marcadores que permitem a previsão da eficácia da quimioterapia do cancro. A aplicação de biomarcadores com alto poder discriminatório pode ajudar os médicos a evitar difíceis regimes de quimioterapia com efeitos adversos desnecessários, bem como permitir uma decisão anterior de utilizar esquemas alternativos. No entanto, apesar da utilização de vários métodos de rastreio de alto rendimento, neste contexto, a identificação de biomarcadores tem sido difícil [1].
Durante a caracterização das características moleculares e celulares de um painel de 12 linhas celulares de cancro humano, nós desenvolvemos um sistema em que um convencional
in vitro
ensaio de quimio-sensibilidade usando drogas clinicamente aprovados combinados com a expressão da proteína quantitativa de perfis usando um array ‘de fase inversa’ lisado (RPA) foi utilizada para identificar proteínas que podem ser relevantes para a actividade dos agentes quimioterapêuticos [2]. Ambas as tecnologias produzir uma saída quantitativa, o que permite a análise de um grande número de combinações entre a potência do fármaco e a expressão da proteína [2], [3]. Além disso, este sistema a hipótese de que o perfil de expressão de uma proteína pode ser um preditor de quimiossensibilidade a um dado fármaco. validação subsequente é então necessária para determinar se os marcadores são clinicamente relevantes em relação a quimio-sensibilidade.
Uma coleção recente de dados de pacientes individuais de casos de câncer de cólon revelou que a quimioterapia adjuvante baseada em 5-FU fornece uma doença- significativa sobrevivência (DFS) benefício livre através da redução da taxa de recidiva, o que conduz a um benefício de sobrevivência a longo prazo total (oS) [4]. Em países da Ásia Oriental, tem sido bem aceite que o cancro gástrico ressecável, localmente avançado irá beneficiar de quimioterapia adjuvante baseada em 5-FU, como S-1, que é uma fluoropirimidina oral, para OS prolongada e sobrevida livre de recidiva (RFS ) [5], [6]. No entanto, aproximadamente 30-40% dos pacientes apresentam recorrência mesmo após ter recebido uma operação curativa e quimioterapia adjuvante ‘standard’ [7], [8]. Apesar do uso intensivo de 5-FU para cancros gastrointestinais, to-date os marcadores para 5-FU não atingiram o nível-de-prática utilidade [9].
No presente estudo, foram coletadas 79 removido cirurgicamente espécimes de cancro a partir de pacientes com cancro do cólon gástricas e que não tinham recebido qualquer quimioterapia, no momento da operação e mais tarde, receberam 5-FU quimioterapia adjuvante base para determinar se qualquer um dos marcadores foram associados com TTR. Produzimos um tissue microarray (TMA), que representam todos os 79 espécimes sobre uma lâmina de vidro e sondou-os com anticorpos primários [2], que reconheceu uma proteína específica identificada como um marcador candidato para recaída. Para confirmar uma associação direta da expressão da proteína eo efeito anti-tumoral 5-FU, também realizada gene knockdown por siRNA em várias linhas de células cancerosas humanas.
Declaração de Ética Materiais e Métodos
o estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão Institucional da Universidade Medical Iwate em conformidade com a declaração de Helsínquia. Um consentimento por escrito indivíduo foi obtido de todos os pacientes ea confidencialidade absoluta foi preservada mesmo após o paciente morreu. Todas as análises foram realizadas anonimamente pacientes para individuais não foram identificados.
Previsão de proteínas como marcadores candidatos de Prognosis
Em primeiro lugar temos realizado um ensaio de quimio-sensibilidade convencional, onde 144 combinações de 12 fármacos anti-cancerígenos e 12 linhas celulares foram avaliados para a quimiossensibilidade usando uma inibição do crescimento 50% (GI
50) valor (uma matriz, Fig. 1A) [2]. O nível de expressão da linha de base de 50 proteínas no painel de linha celular foi analisada quantitativamente utilizando uma “fase reversa” microarray lisado (RPA) [10], [11], que é uma western blot em formato dot microescala, seguido de imunodetecção quantitativa ( matriz P) [12], em que cada matriz é visualizada com base em-ligação média agrupamento hierárquico (Fig. 1B) [2], [13]. Uma correlação da correlação entre A e matrizes P (AP) da matriz, em seguida, foi estabelecida utilizando o algoritmo relatado por Scherf et ai. [14] (Fig. S1, S2). A matriz AP nos permite prever uma associação entre a expressão da proteína e quimio-sensibilidade. Utilizando este método, foram identificadas oito proteínas com base em 5-FU quimiossensibilidade (Fig. 1C, Tabela S1) [2].
(a) com base num ensaio de quimio-sensibilidade de um painel de linha celular de cancro, o A ( atividade) × C (células) = matriz de AC foi criado. (B) a expressão da proteína de dados quantitativa de cada linha de células foi determinada por “fase reversa” microarray lisado gera o C × P (proteína) = matriz CP. (C) Um mapa de calor com representação agrupamento hierárquico da matriz AP, o qual é gerado a partir de matrizes de CA e CP. (D) colorações imuno-histoquímica de marcadores candidatos para tratamento de 5-FU.
removido cirurgicamente espécimes
Setenta e nove espécimes retirados cirurgicamente, incluindo 30 gástrica e 49 casos colorretais, foram coletadas de pacientes que não receberam quaisquer agentes anticancerígenos no momento da cirurgia. Todos os casos cirúrgicos foram realizados no Departamento de Cirurgia da Iwate Medical University Hospital entre 1997 e 2008. Após a cirurgia, todos os casos foram confirmados para cumprir os critérios para a quimioterapia adjuvante baseada em 5-FU em conjunto com um diagnóstico clínico-patológico final (Tabela 1) .
TMAs
uma área rica em tumor de cada amostra de tecido foi marcado em uma hematoxilina e eosina (H e) secção corada sob um microscópio. O cilindro central de uma área rica em tumores a partir de cada amostra foi perfurado para fora do bloco de parafina utilizando um microprocessador tecido manual (KIN-1, Azumaya, Japão) com uma agulha de aço que tem um diâmetro interno de 2 mm [15]. Os núcleos cilíndricos foram dispostos em blocos de parafina receptor. secções de TMA (4 mm de espessura) foram obtidos utilizando uma preparação padrão. No presente estudo, um núcleo foi perfurado para cada amostra no bloco de parafina, mas algumas seções adjacentes de amostras positivas ou negativas também foram examinados para avaliar para qualquer considerável heterogeneidade.
Imunohistoquímica
As amostras de tecidos foram incubadas a 97 ° C em EDTA 1 mM, pH 9,0 durante 30 minutos num forno de micro-ondas para a recuperação de antigénio. Eles foram, em seguida, incubadas com os anticorpos primários p65 de NF-kB (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) e JNK /SAPK1 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) durante a noite a 4 ° C. A imunocoloração foi realizada usando um sistema de DAKO Envision + (DakoCytomation, Dinamarca) e um Autostainer. Para a avaliação da coloração de NF-kB, amostras com coloração nuclear clara mais de 10% foram designadas como positivas (Fig. 1D). Para avaliação coloração JNK, primeiro dividiu a força coloração em 4 graus, e, posteriormente, dividiu-os em dois grupos (positivos e negativos). A avaliação de coloração foi focada no núcleo para o NF-kB, e no citoplasma de JNK, em ambos os componentes epiteliais para colorações [16]. Informação sobre os anticorpos primários utilizados no estudo é apresentado na Tabela S2. A pontuação final coloração foram tabulados de forma binária para análises estatísticas.
Análise Estatística
As associações entre características clínicas e dados imunohistoquímicos foram utilizados para avaliar a significância entre as variáveis categóricas pelo teste exato de Fisher ou χ
2 de teste. TTR e OS foram calculados a partir da data da operação, quer a data de recaída, morte ou censurar com estimativa de Kaplan-Meier, agrupando pontuações de expressão de proteínas. Um estimador de Kaplen-Meier entre grupos de graus de imuno-histoquímica foi comparado com um teste de log-rank. A análise multivariada subconjunto utilizando um modelo de risco proporcional de Cox foi realizada para explorar a interação entre TTR /OS e identificar fatores independentes. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando JMP 7.0 (SAS Institute, Cary, NC).
Molecular marcador de indução por 5-FU
Cinco linhas celulares de cancro gástrico humano (GSS, HuG1-PI, KATOIII , KE39, e MKN45) foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. Os níveis de expressão de proteína da linha de base dos marcadores identificados (NF-kB /p65 e JNK) foram medidos por western blot. As células foram tratadas com tripsina para a preparação do ligado celular de acordo com um protocolo publicado [17]. membranas de nitrocelulose foram em seguida incubadas com os anticorpos primários utilizados para a imuno-histoquímica, seguido por desenvolvimento de sinal quimioluminescente (SuperSignal West Pico, Thermo Scientific, EUA). Para determinar se os respectivos níveis de proteína foram aumentada por 5-FU, duas concentrações diferentes de 5-FU (50 e 100 pM) foram adicionados no meio de cultura durante quatro horas. Imunocitoquímica também foi realizado nas lâminas de cultura de células de quatro câmaras utilizando os mesmos anticorpos primários descritos acima seguido por Alexa488 ou anticorpos secundários conjugados 564, respectivamente. Um microscópio de fluorescência padrão foi utilizada para examinar a localização celular das proteínas.
gene alvo knockdown
Cinco linhas celulares de cancro gástrico humano foram cultivadas até 70% de confluência em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS em uma placa de 96 poços. As células foram então tratadas com um reagente catiónico-lipofecção (
Trans IT-TKO
Transfection Reagent, Mirus, WI) na presença de siRNA específico para qualquer um de NF-kB p65 ou JNK transcritos de genes (Signal silêncio, Cell Signaling Technologies, MA) durante 48 h. Após a transfecção siRNA, cada droga (5-FU, cisplatina, docetaxel, e paclitaxel) foi adicionado a uma concentração que inibia 50% do crescimento celular (GI
50) para cada linha celular [2] e, em seguida, incubou-se durante um adicional 48 h para o ensaio inibidor do crescimento (WST-1, Dojindo, Japão). O efeito de NF-kB na supressão do crescimento foi avaliado se o crescimento foi reduzido para menos de 50% por ARNip com uma concentração de fármaco no GI
50. O efeito de ARNsi de JNK foi avaliado se o crescimento das células foi superior a 50% do controlo. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Para verificar o efeito específico gene de siRNA, temos também realizou um experimento usando diferentes siRNAs segmentação p65 e JNK (SignalSilence siRNAI e siRNAII para NF-kB e SAPK /JNK, respectivamente; Cell Signaling Technology). A mesma tendência foi obtido para ambos os siRNAs. As amostras de controlo foram correspondentes linhas celulares com siRNA transfecção sem drogas anticâncer.
Resultados
Os pacientes
A idade média dos 79 pacientes foi de 68 anos (variação, 37-83 anos ), com 30 cancro gástrico e 49 pacientes com câncer colorretal. Todos os 79 pacientes foram submetidos a qualquer uma gastrectomia ou colorectomy com dissecção de linfonodos. A curabilidade operacional havia tumor residual (R0) para todos os casos. achados patológicos revelou que todos os tumores invadiram além do mascularis propria. Vinte e seis (33%) dos pacientes tinham metástases patologicamente negativos nódulos linfáticos regionais, enquanto que nenhum dos pacientes mostrou metástases à distância. Todos os pacientes satisfeitos os seguintes critérios para a quimioterapia adjuvante baseada em 5-FU: confirmado histologicamente gástrica ( Etapa II) ou colorretal ( T2) de câncer com a cirurgia R0 aparente; não hepática, peritoneal, ou metástases à distância; idade do paciente entre 20 e 85; sem quimioterapia prévia; ea função dos órgãos adequados. A quimioterapia foi considerado para ser concluída, se um paciente foi capaz de continuar regimes baseados o seguinte 5-FU: (i) S-1 (60 mg /m
2 /corpo) durante 1 ano por câncer gástrico; e (ii) quer doxifluridina (800-1200 mg /dia), 5-FU (370 mg /m
2 /dia), ou UFT-E grânulos (300 mg /m
2 /dia) durante seis meses para o câncer colorretal. Sessenta (76%) pacientes de quimioterapia concluída, 15 (19%) pacientes suspensa tratamento e 4 (5%) pacientes apresentavam falta de informação.
O tempo mediano de observação após a operação foi de 3,41 e 5,04 anos no estômago e cólon , respectivamente (variação de 1.41-7.00 anos no estômago, e 0.99-10.24 anos no cólon). Em casos não reincidente, o tempo mínimo de observação foi de 2,43 e 2,36 anos no estômago e cólon, respectivamente. A TTR média foi de 1,56 e 1,52 anos no estômago e cólon, respectivamente (intervalo, 0.72-3.33 anos no estômago; e 0,27-4,47 no cólon). Entre 77 casos dos quais status de sobrevivência foi confirmada, a taxa de sobrevida global de 3 anos nos grupos recaíram e não-recaída foi de 0,60 e 0,65 no estômago e 0,97 e 0,96 no cólon, respectivamente. Os parâmetros clínico com base em status de recaída são apresentados na Tabela S3.
Imunohistoquímica
As pontuações de positividade de todas as proteínas candidatos foram avaliados (Fig. 1D e Fig. S3). NF-kB mostraram coloração nuclear distinto que foi espalhados por todo os núcleos e não formam aglomerados. Algumas células apresentaram coloração citoplasmática, mas não foi tão distintas como aqueles com coloração nuclear. A coloração de JNK não foi tão forte como a do NF-kB, mas estava claramente localizada no citoplasma. Os seis proteínas candidatas restantes e três proteínas de interesse foram em seus locais subcelulares esperados (Fig. S3). Depois de determinar a localização subcelular das proteínas, a força de coloração foi marcado de forma binária.
correlação entre a expressão de proteínas e Achados clínicopatológicos
A análise dos parâmetros de contingência de cada proteína em termos de recaída revelou que os níveis de proteína de NF-kB e JNK foram significativamente associados com a recaída no estômago (
p
= 0,0004 e 0,029 para a NF-kB e JNK, respectivamente; Tabela S4). Quando a expressão destas duas proteínas foi combinada, a análise de contingência demonstrado um forte poder discriminador de cada proteína individual.
Com base numa análise de Kaplan-Meier, e os níveis de expressão de JNK do NF-kB foram associados com as diferenças significativas na a taxa de não-recaída (Fig. 2). Um teste de log-rank da análise Kaplan-Meier mostrou uma diferença significativa nas taxas de não-recaída entre a JNK (+) e JNK (-) grupos em ambas estômago (
p
= 0,0302, HR4.4 , IC 95% 1,2-16,6) e cólon (
p
= 0,0098, HR3.2, IC 95% 1,3-7,7); e também entre o NF-kB (+) e NF-kB (-) grupos em ambas estômago (
p = 0,0002
, HR11.7, IC 95% 3,2-43,4) e cólon (
p
= 0,0038, HR36.9, 95% 3,2-426,0 IC, Fig. 2). Interessantemente, no estômago, todo o NF-kB casos (+) foram JNK (-), enquanto que 58% da JNK (-) eram casos de NF-kB (+). A probabilidade de recaída quando estes marcadores foram combinados mostraram maior diferença do que usando os marcadores individuais, tanto estômago e cólon (Fig. 2).
p53 também blindado, timidina Sintetase e MDR-1 expressão em amostras reunidas estômago e cólon, porque tem-se sugerido que estas proteínas ou genes que codificam podem ser associados com 5-FU a potência da droga [18], [19], [20], [21]. . No entanto, não foi observada associação significativa entre a taxa de recaída eo nível destas proteínas (Fig. S4) expressão
da taxa OS 3 anos de câncer gástrico, NF-kB (-) e (+ ) casos foi de 0,94 e 0,77, respectivamente, e 0,82 e 1,00 para a JNK (-) e (+), respectivamente. Da taxa de SO 3 anos de cancro do cólon, o NF-kB (-) e (+) casos foi de 0,79 e 1,00, respectivamente, e 0,72 e 0,90 para a JNK (-) e (+), respectivamente. No entanto, houve uma diferença significativa na taxa OS pela estimativa de Kaplan-Meier no câncer gástrico (NF-kB (+), HR 7,9, IC 95% 2,1-30,3; JNK (-), HR 0,25, 95% CI 0.06- 1,09, Fig. S5).
a análise de subgrupos
Para identificar relações gerais entre os marcadores e os achados clínico-patológicos, uma análise de subgrupo foi realizada com estômago e amostras reunidas colorretal. Houve uma associação significativa entre o estado de NF-kB e T-fator /Stage para TTR (Fig. S6), mas não foi observada associação significativa entre o estado JNK e todas as variáveis para TTR (Fig. S7). Curiosamente, no entanto, houve uma associação significativa entre o status combinado marcador: e T-fator /Stage para TTR e status de conclusão de quimioterapia para OS (Fig S8, S9.). A associação entre o sistema operacional e o status de cada fator também foi analisada de acordo com sexo, idade, as lesões, as classificações TNM e o status de conclusão de quimioterapia (Fig. S10, S11). A análise multivariada revelou que a expressão de NF-kB e do fator T foram fatores independentes para ambos recidiva e sobrevivência.
respostas moleculares por 5-FU
a expressão da proteína de linha de base de NF-kB e JNK foi medido por western blot. Curiosamente, o padrão de expressão foi recíproco; linhas de células com elevada expressão de NF-kB mostrou relativamente baixo de expressão de JNK (Fig. 3A). O padrão de expressão recíproca foi concordante com a direcionalidade destas proteínas como biomarcadores. Nós também testou a indução de proteína por 5-FU. expressão de NF-kB foi induzida e aumento na fracção de proteína total por 5-FU de uma forma dependente da dose (Fig. 3B). Análise imunocitoquímica subsequente revelou que nuclear de NF-kB foi proeminentemente visualizados após exposição de 5-FU, enquanto JNK não exibem uma notável mudança na localização (Fig. 3C).
(A), a expressão da proteína da linha de base de NF-kB e JNK em cinco linhas celulares de cancro gástrico. Tublin foi utilizado como um controlo de carga. (B) Indução de biomarcadores candidatos em resposta ao tratamento com 5-FU em diferentes concentrações em MKN45 e KE39. (C) A análise da localização de proteínas por imunocitoquímica fluorescentes usando MKN45. (D) Aumento do efeito inibidor do crescimento por agentes anticancro em linhas celulares de cancro do estômago, após a transfecção de siRNA para p65 de NF-kB e JNK transcritos. As amostras de controlo são as linhas de células correspondentes transfectadas com os ARNsi indicados, sem agentes anticancerígenos. Abreviaturas são: CIS, cisplatina; DTX, docetaxel; e PXL, paclitaxel; e 5-FU, 5-fluorouracilo. *
p
. 0,05, Student
t
-test
O Efeito da p65 NF-kB e JNK Gene Knockdown no crescimento celular
Quatro em cada cinco linhas celulares (GSS, KATOIII, KE39 e MKN45) apresentaram supressão do crescimento significativo após NF-kB siRNA transfecção e tratamento de 5-FU (
p Art 0,05, Student
t
-test; A Fig. 3D, Fig S12).. A supressão do crescimento de 5-FU-dependente, estatisticamente significativa foi observada na GSS, KATO-III, e MKN45. tratamento de JNK siARN era esperado para induzir um efeito anti-apoptótico com base em estudos anteriores [22], que foi levantada a hipótese de aumentar a taxa de crescimento na presença de fármacos anti-cancerígenos. Quatro em cada cinco linhas de células tratadas com ARNsi de JNK demonstrada a indução do crescimento de 5-FU-mediada ou nenhuma mudança. Estes experimentos de siRNA revelou que NF-kB e JNK parecem ter papéis recíprocos em termos de supressão de crescimento de 5-FU-mediada.
Discussão
Embora a escolha da quimioterapia adjuvante após ressecção de câncer gástrico é ligeiramente diferente entre países, 5-FU, foi mostrado ser a opção de tratamento mais eficazes. Validação de quimioterapia pós-operatória e cirurgia sozinha demonstrou taxas de SO 3 anos de 80,1% e 70,1%, respectivamente, no Japão [23]. chemoradiotherapy pós-operatório (CRT) tem sido conduzido nos Estados Unidos para o cancro gástrico avançado, eo SO após a TRC tem sido relatada a ser de 50%, enquanto a de cirurgia isoladamente foi de 41% [24]. Na Europa, o ensaio MÁGICA revelou a eficácia da quimioterapia perioperatória e demonstraram que a OS 5 anos foi de 36,3% e 23,0% na quimioterapia e cirurgia grupos sozinhos perioperatórios, respectivamente [25]. Por outro lado, foi mostrado quimioterapia adjuvante (5-FU /LV) para o cancro colo-rectal avançado para melhorar SO na década de 1990, e mais recentemente, uma nova melhoria das DFS e o sistema operativo tem sido observado com a adição de oxaliplatina [26]. Em geral, a quimioterapia adjuvante para o cancro colorectal só é administrado por seis meses, mas foi mostrado para fornecer benefícios a longo prazo, incluindo prolongada de 5 anos DFS e OS [4], [26].
Com um padrão de atendimento estabelecida, nós agora enfrentam a questão de como tratar pacientes que não estas terapias padrão. De facto, 30-40% dos doentes tratados com o padrão de quimioterapia adjuvante experiência recorrência após a cirurgia num prazo de cinco anos nos carcinomas gástricos e do cólon avançado [8], [27]. Por isso, tem sido uma meta importante para melhorar os regimes de tratamento para a população subconjunto onde a terapia padrão pode ser ineficaz.
No presente estudo, para validar a utilidade dos marcadores identificados, foram coletadas arquivados tecidos de pacientes que tiveram ressecção curativa sofrido de câncer gástrico e colorretal. Todos os pacientes eram elegíveis para receber quimioterapia adjuvante, incluindo pacientes com a fase I /II de cancro colorrectal. Um relatório anterior mostrou que, entre os 769 casos mp de uma coorte retrospectivo de pacientes japoneses, a taxa de recorrência da fase I (mp, N0) pacientes foi de 7% [28]. Embora o número de pacientes foi limitado, o estudo QUASAR relatado que uma maior percentagem de pacientes estádio I (25%) que receberam a cirurgia por si só morreram dentro de cinco anos, em comparação com pacientes que receberam quimioterapia adjuvante [29]. Além disso, tem sido relatado que as células de tumor circulantes foram encontrados em 6% da fase I colorectal doentes com cancro após a operação curativa [30]. Estes achados clínicos e biológicos deve torná-lo razoável a inclusão de Fase I no presente estudo.
Tem sido relatado que cerca de 25% dos pacientes com tumores fase II são considerados como tendo um risco aumentado de recorrência devido a : (a) a penetração da serosa (T4); (B) invasão venosa extramuros; (C) a histologia pouco diferenciado; (D) a apresentação de uma obstrução; ou (e) com um rendimento de menos de 10-12 nódulos linfáticos [31]. No presente estudo, a maioria dos casos colorectal fase II possuía um desses critérios de risco, excepto num caso em que o paciente era jovem (37 anos de idade), para o qual o estudo QUASAR justificou a elegibilidade. Embora o uso de quimioterapia em fase I, não é recomendado e Fase II casos tem sido controverso, foi realizada a validação porque ele teve como objetivo selecionar um indivíduo que não podem beneficiar de quimioterapia “standard” ou ter um risco potencial em estágios mais baixos, o que é em contraste com a abordagem de estudos epidemiológicos.
relatórios anteriores demonstraram a importância de NF-kB em prognóstico, a angiogénese, e quimiorresistência em carcinomas do cólon e do estômago [32], [33], [34], [ ,,,0],35], [36]. Os nossos dados actuais demonstraram que a localização nuclear de NF-kB poderia prever o resultado de pacientes no momento da operação que posteriormente recebem quimioterapia adjuvante. Curiosamente, as células tumorais NF-kB (+) foram encontrados espalhados nas seções em que houve uma clara distinção entre as células positivas e negativas. experimentos moleculares revelaram uma relação recíproca clara entre NF-kB e expressão JNK, o que sugere uma potencial associação com a terapia 5-FU e os achados patológicos. Para esclarecer o papel do NF-kB e JNK na resposta do tumor a 5-FU, realizamos experimentos gene knockdown. Knockdown do gene de NF-kB (p65) revelou que a maioria das linhas celulares tumorais testadas demonstrou supressão de crescimento específicos de 5-FU clara, enquanto outros fármacos mesmo crescimento celular induzido. Este resultado sugere uma associação direta entre a sensibilidade 5-FU e expressão NF-kB e apoia a aplicação de diagnóstico desta análise para a quimioterapia adjuvante baseada em 5-FU. Deve também ser notado que taxans e inibidores da topoisomerase activar a via de NF-kB, o que leva à proliferação de células e a activação através MYC IKK, respectivamente [33]. As implicações clínicas destas mecanismos permanecem por ser elucidados.
NF-kB tem sido implicada no desenvolvimento de resistência à droga numa vasta gama de células de cancro. A inibição da activação do NF-kB reduzida quimiorresistência em linhas celulares de cancro gástrico e colorectal, o que é consistente com os nossos resultados presentes [6], [37], [38] [32]. A activação constitutiva do NF-kB tenha sido sugerido como um potencial factor de prognóstico no cancro gástrico [39], [40], [41] e está correlacionada com a progressão e quimioterapia resistência de carcinomas colorrectais [42], [43].
JNK proteínas têm diversas funções na proliferação celular e na indução de apoptose através de vias de proteína cinase activada pelo stress, e são frequentemente regulados negativamente em cancros [44], [45]. No presente estudo, o papel de JNK no contexto de resposta de 5-FU parece ser passivo com respeito a quimiossensibilidade, de acordo com a nossa experiência de siRNA. A análise imuno-histoquímica neste estudo mostraram que o NF-kB e JNK foram indicadores recíprocos de prognóstico. No entanto, knockdown de NF-kB sensibilizados 5-FU, enquanto JNK não tornar as células resistentes a 5-FU. activação de NF-kB por TNF-α é fortemente regulada por JNK no contexto de uma resposta pró-inflamatório, que ocorre imediatamente após estimulação [46], [47], [48], [49]. Por outro lado, a activação de NF-kB na malignidade ou quimiorresistência parece ser parte constituinte de uma parte de progressão do tumor gastrointestinal [47], [50]. No presente estudo, apesar de coloração nuclear de NF-kB foi observada apenas em uma pequena fracção de células tumorais, a JNK foi corada relativamente ubíqua em todo o tecido. Por conseguinte, os nossos resultados actuais podem indicar que a JNK coloração reflete um grau de fundo respostas inflamatórias ou stress crónico da mucosa gástrica [51], enquanto que a activação constitutiva do NF-kB está associada com o potencial de malignidade das células tumorais [39], [40] , [41], [52]. Para além da potencial maligno intrínseca, os nossos resultados demonstraram também que o NF-kB desempenha um papel específico na resposta de 5-FU. Tomados em conjunto, embora seja necessária uma maior investigação clínica, a expressão nuclear de NF-kB pode ser um bom candidato como um marcador de prognóstico quimiossensibilidade 5-FU, enquanto JNK pode ser um marcador de suporte que reflecte a informação de fundo da mucosa.
embora o presente resultado ainda é preliminar a partir de um ponto de vista prático, estes resultados podem oferecer uma oportunidade para regimes alternativos para ser considerado para casos que indicam uma baixa probabilidade de uma resposta quimioterápico à base de 5-FU. Um estudo imuno-histoquímico maior que inclui NF-kB /JNK análises serão necessários para provar a utilidade em cânceres gástrico e colorretal.
Informações de Apoio
Figura S1.
Fluxo de Chemosensitivity marcador Identificação. (A) com base num ensaio de quimio-sensibilidade de um painel de linha celular de cancro, o A (actividade) x C (células) = matriz de CA foi criado. Os dois painéis da esquerda mostram as curvas de crescimento celular em função da concentração de fármaco. O painel do meio mostra a inibição do crescimento de 50% os valores (IG
50) em um gráfico de barras. Todos os dados são centrada por pico de concentração plasmática (PPC) valores que são únicas para cada droga. O painel da direita representa o GI
50 valores e as células em um mapa de calor com um formato de agrupamento hierárquico. (B) “Reverse-phase” lisado de proteína microarray (esquerda) e C (células) × P (proteína) = matriz de CP em um mapa de calor com um formato de agrupamento hierárquico (direita). (C) Um mapa de calor com representação agrupamento hierárquico da matriz AP, o qual é gerado a partir de matrizes de CA e CP. O dendrograma indica a distância com base no coeficiente de correlação dos dados ajustados ao lado do outro. Assim, a matriz AP mostra a correlação entre a expressão da proteína e eficácia da droga em todas as linhas celulares. Citado com permissão de referência # 2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0043236.s001
(TIF)
Figura S2.
Correlação entre proteínas candidatos e sensibilidade às drogas. Esquerda: Diagrama de dispersão com base na sensibilidade do 5-FU e a expressão de NF-kB. O coeficiente de correlação é positiva, mas é negativo (
r
= -0,304), quando as linhas de células gastrointestinais (CW2, HCT116, GSS, KATOIII, MKN45, HuG1-PI e KE39) foram analisados, o que é consistente com o resultado de validação do TMA. Direita: Diagrama de dispersão com base na sensibilidade e expressão JNK 5-FU. Tem sido bem aceite que as ferramentas de rastreio, tais como técnicas baseadas em microarrays, pode descobrir biomarcadores úteis, mas podem também isolar os falsos positivos.