Abstract

Os microRNAs têm sido implicadas em muitos processos celulares críticos, incluindo a apoptose. Temos anteriormente encontrado que a apoptose em células de cancro do pâncreas foi induzida por adamantilo (RRA) molécula dependente do retinóide 3-Cl-AhpC. Aqui nós relatamos que a apoptose 3-Cl-AhpC dependente envolve regulação de um número de microRNAs incluindo miR-150 * e miR-630. 3-Cl-AhpC estimulada miR-150 * expressão e causou a diminuição da expressão de c-Myb e IGF-1R, em que as células de cancro do pâncreas. redução de 3-Cl-AhpC mediada por c-Myb resultou na ligação diminuída de c-Myb com IGF-1R e Bcl-2 promotores, desse modo fazendo com que a repressão da sua expressão e a transcrição de proteínas. A sobre-expressão de miR-150 * também resultou em níveis diminuídos de c-Myb e proteínas Bcl-2. Além disso, a adição do inibidor de miARN 2′-O-metilado miR-150 bloqueou aumento de 3-Cl-AhpC mediada por miR-150 * e os níveis de ab-rogado perda de proteína c-Myb. Knockdown de c-Myb em células PANC-1 resultou em apoptose aumentada tanto na presença ou ausência de 3-Cl-AhpC confirmar a propriedade anti-apoptótica de c-Myb. A sobre-expressão de miR-630 também induziu apoptose em células de cancro do pâncreas e inibida ARNm de IGF-1R proteína alvo e a expressão da proteína. Juntos, estes resultados implicam papéis fundamentais para miR-150 * e miR-630 e sua segmentação de IGF-1R para promover a apoptose em células de cancro do pâncreas

Citation:. Farhana L, Dawson MI, Murshed F, Das JK, Rishi AK, Fontana JA (2013) regulação positiva de miR-150 * e miR-630 induz a apoptose em células de cancro do pâncreas da segmentação IGF-1R. PLoS ONE 8 (5): e61015. doi: 10.1371 /journal.pone.0061015

editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha |

Recebido: 14 Dezembro, 2012; Aceito: 05 de março de 2013; Publicado em: 10 de maio de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Assuntos de Veteranos de mérito de revisão Grant (JAF, MID) e do Instituto Nacional do Câncer (NCI) subvenções (JAF, MID) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Após a sua descoberta inicial em 1993, microRNAs foram estudados para determinar seu efeito por um grande número de autores [1]. A capacidade de microARNs para regular a expressão de uma vasta variedade de genes ao nível pós-transcricional tem sido bem documentada [2]. Estas pequenas moléculas de RNA são conservados e expresso em um grande número de organismos, incluindo

Homo sapiens Comprar e desempenham papéis importantes na regulação de processos biológicos fundamentais, incluindo proliferação, diferenciação e apoptose.

Os microRNAs são transcrito no núcleo principalmente pela polimerase de ARN como transcritos primários longos (pré-microRNAs). Estas moléculas são então processados ​​no núcleo por ARNase III Drosha em 70 a 100 nucleótidos pré-microARNs e, em seguida, são exportados para o citoplasma, onde são tratados posteriormente pela ARNase III Dicer para gerar ARN de cadeia dupla (ARNcd) de cerca de 22 nucleótidos [3]. Se, há degradação da cadeia anti-sentido neste momento é controversa. Evidências recentes sugerem fortemente que a cadeia de ARNm de sentido inverso não pode ser degradado e pode desempenhar um papel significativo na regulação de um número de funções celulares [4]. O ARN de cadeia simples de micro madura remanescente inibe a tradução juntando-se um complexo que se liga complementar da 3′-UTR do gene alvo. Através microARNs, a ligação específica de cortesia foram mostrados para atingir um número de genes que inibem ou aumentam a sua expressão, resultando em efeitos pleiotrópicos em várias funções celulares [5].

A desregulação da expressão microARN tem sido associado com o cancro iniciação e progressão por regular a expressão de supressores tumorais e oncogenes. Foi previamente demonstrado que os perfis de microRNA encontradas em tecidos de carcinoma pancreático diferem significativamente daqueles encontrados no tecido pancreático normal ou em pancreatite [6]. Postula-se que a expressão aumentada ou diminuída de microARNs específicos podem ser abordagem poderosa na terapia de um número de doenças malignas [5]. Um número de abordagens para modular a expressão microARN foram concebidas. O retinóide adamantly-substituído relacionada moléculas (RRA) foram encontrados para induzir a apoptose em uma variedade de células malignas, tanto

in vitro

e

in vivo

[7]. Uma série de mecanismos têm sido propostos através do qual a apoptose é alcançado por esta classe de moléculas [7]

Temos anteriormente demonstrado que ARRS são indutores potentes de apoptose em células de câncer de pâncreas -. Uma doença sombrio com um frequentemente devastador prognóstico [8]. Colocámos a hipótese de que a exposição das células ao 3-Cl-AhpC podem resultar em modulação da expressão e microARN que esta expressão microARN diferencial pode contribuir para a inibição da proliferação celular e a indução de morte celular mediada por ARR. Na presente série de experiências, nós demonstramos que a ARRS fato modular a expressão microARNs e que este aumento da expressão de microARN específica miR-150 * e miR-630 resulta na regulação negativa da proteína IGF-1R que são importante mediador do crescimento celular e indução de apoptose.

Materiais e Métodos

Os reagentes e células

(

e

) -4- [3- (1-adamantil) -4- hidroxifenil] -3-clorocinâmico (3-Cl-CPH) foi sintetizado como anteriormente descrito [9]. linhas celulares de carcinoma pancreático humano, PANC-1 e MiaPaCa-2 foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e mantidas em meio DMEM-F12 contendo FBS a 10% e 100 ug /ml de gentamicina. meio DMEM-F12, soro fetal bovino (FBS) e Lipofectamine 2000 foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). Os anticorpos e as suas fontes, foram as seguintes: Anticorpos para citometria de fluxo, CD44-PE, CD24-FITC da BD Biosciences (San José, CA); anti-IGF-1Rβ, anti-Smad1, anti-caspase 3 (Asp-175), anti-caspase 3 foram de Cell Signaling Technology (Boston, MA); anti-EGFR, anti-CDK6, anti-c-myb e anti-Bcl2 anticorpos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); Cdc14A e ABCC1 da Abcam, Cambridge, MA e Thermo Scientific, Rockford, IL, respectivamente; e anti-α-tubulina e anticorpo β-actina (Oncogene Research Products, Boston, MA). Puromicina foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louise, MO).

miARN análise de microarray e validação

células PANC-1 foram expostas a 1 uM 3-Cl-AhpC durante 30 h. O ARN total a partir de 3-Cl-AhpC tratadas e células não tratadas foi extraída com TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) e em seguida a preparação da amostra, a hibridação com G4470A 15K humano miARN Microarray (V2) (Agilent Technologies) e a análise foram realizadas por Asuragen, Inc. (Austin, TX). Para a validação de miARN, o ARN total foi purificado com o RNeasy Mini Kit (Qiagen) e 100 ng de ARN foi utilizado para preparar ADNc utilizando o kit de transcrição reversa TaqMan microARN (Applied Biosystems) utilizando iniciadores específicos de microRNA. O primer específico sequência de miRNA e sonda de miR-134, miR-150 *, miR-630, miR-345, miR-382, miR410 e miR129-5P, RNU6B controle endógeno e TaqMan 2 × PCR Master Mix para ensaios TaqMan microRNA foram adquiridos da Applied Biosystems e seguiu o protocolo como descrito por instruções do fabricante. Em tempo real qRT-PCR e análise foi realizada em sistema Applied Biosystems 7500 Real Time PCR. A análise dos dados foi realizada com valores ΔCt de miRNAs de cada amostra foram calculados através da normalização com RNU6B controlo interno e cada valor foram: a média de três réplicas.

mRNA quantificação

O RNA total foi preparado a partir PANC- 1 linhas celulares utilizando Trizol, tal como recomendado pelo fabricante e purificados utilizando o Kit Rneasy Mini (Qiagen). Para PCR em tempo real, o ADNc foi preparado com o sistema de síntese de ADNc de primeira cadeia SuperScript III para RT-PCR (Invitrogen) e analisados ​​em triplicado usando o 2 × SYBR mistura de PCR verde mestre (Applied Biosystems) e o sistema de detecção de 7,500 sequência ABI Prism . PCR consistiu em 40 ciclos de 95 ° C durante 10 minutos e depois 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 60 seg. Os conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos foram sintetizados a partir de tecnologia de ADN integrado Inc. (Coralville, IA). O conjunto de iniciadores para cada gene é listado abaixo:

EGFR, frente 5’CTTTCGATACCCAGGACCAAG-3 ‘; reverso 5’- CAACTTCCCAAAATGTGCCC -3 ‘; CDK6, frente 5’TGCACAGTGTCACGAACAGA -3 ‘;

reverso 5′- ACCTCGGAGAAGCTGAAACA-3′; ABCC1,

frente 5’AGGTGGACCTGTTTCGTGAC-3 ‘;

reverso 5′- ACCCTGTGGATCCACCAGAAG-3′; Smad1 frente

5’CAACAATCGTGTGGGTGAAG -3 ‘; TCCGGTTAACATTGGAGAGC reverso 5’- -3 ‘;

CDC14A, frente 5’GCACACCCAGTGACAACATC -3′;

reverter

5’CCTTCACTGGATGGTCGATT -3 ‘; IGF-1R, frente

5’AACCCCAAGACTGAGGTGTG -3 ‘; TGACATCTCTCCGCTTCCTT reverso 5’- -3 ‘;

c-Myb, frente 5’GTCCGAAACGTTGGTCTGTT -3′; reverter

5’GGCAGTAGCTTTGCGATTTC-3 ‘; BCL2, frente 5’ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA -3 ‘

reverso 5′- ACAGTTCCACAAAGGCATCC -3′; β-actina, frente

5′-TCCTTCCTGGGCATGGAG-3 ‘; reversa 5’- AGGAGGGGCAATGATCTT-3 ‘.

miRNAexpression construção do vector e shRNA-c-Myb plasmídeo

Para construção de miR-150 * vetor de expressão, pré-miR-150 * sequências foram sintetizados a partir de Integrated Technologies Inc. e foi clones recozido miR-150 da sequência * em pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR vector de BLOCK-iT-Poll II miR RNAi kit expressão vetorial (Invitrogen). miR-150 * na sequência de esqueleto de plasmídeo pré-miR-150 * foi confirmada por sequenciação. miR-150 * vector de expressão estavelmente transfectados em células PANC-1, utilizando lipofectamina 2000 e as linhas de células estáveis ​​foram seleccionados com puromycin.Vector contendo a sequência codificado foi utilizada como um controlo.

pequeno gancho de cabelo (sh) -ARN Myb vector de expressão foi construído por clonagem direccional 5 ‘-

Bam HI e

3

EcoR I

saliência nucleótidos num vector pSIREN-RetroQ de acordo com as instruções do fabricante (Clontech, mountain View, CA). O silenciamento de genes alvo eram sequências a partir da sequência de codificação das sequências de números de acesso NM_001130172 e SH-ARN PubMed, 5′-TGAAGAAGCTGGTGGAACA -3 ‘(Myb-KD1) e 5′-ACAGATGACTGGAAAGTTA -3’ (Myb-KD2), 5 ‘ – CAGAAGAGGAAGACAGAAT-3 ‘(Myb-KD3) foram sintetizados a partir de regiões de ADN integrado de tecnologia Inc. shRNA no esqueleto de plasmídeo foram confirmados por sequenciação. shRNA-myb knockdown plasmídeos foram estavelmente transfectadas para células PANC-1, utilizando lipofectamina 2000 e as linhas de células estáveis ​​foram seleccionadas com puromicina. O SH-vetor contendo sequências mexidos em pSIREN-RetroQ vector foi utilizado como controlo. Para a sobre-expressão de miR-630, pep-tem-miR-630 vector de expressão foi adquirido a partir de células Biolabs. Inc. (San Diego, CA). Para inibir o miR-150 e miR-* 630 miARNs, as células foram transfectadas com miR-150 * (OMe-miR-630) sequências anti-sentido O’methylated (OMe-miR-150) e miR-630; as sequências foi sintetizado a partir Integrated DNA Technology Inc.

A apoptose e Crescimento inibição

linhas celulares de cancro do pâncreas foram tratados com 1 PM 3-Cl-AhpC para diversos tempo indicado. A apoptose nas células foram analisadas por citometria de fluxo utilizando ligação em conjunto com iodeto de propídio (PI) a Anexina V-FITC coloração (Anexina V-FITC apoptose Kit de Detecção 1, BD Biosciences, San Diego, CA). A aquisição de dados foi feito em um fluxo FACS Calibur citômetro (BD) e analisados ​​com software CellQuest (BD Biosciences). células de indução de morte celular de miR-630 transfectadas de modo transiente PANC-1 foi avaliada por morte celular Dectection ELISAplus Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). A inibição do crescimento celular foi determinada por ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT). As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 10

4 células /poço num volume de 200 ul de meio de cultura e pré-miR-630 vector de expressão, vectores de miR foram transfectados com lipofectamina. Após 48 horas da transfecção, 25 ^ l /poço de MTT (5 mg /ml) foram adicionados ao meio e incubou-se durante 4 h e MTT precipitados foram solubilizados com 200 ul de DMSO e as placas foram lidas num BioTek Synergy HT (BioTek Instrument Inc ., Vermont) a uma absorvância de 590 nm. Todas as experiências foram realizadas em quadruplicado para determinar médias e desvios padrão.

Western blots

As células foram extraídas com tampão de lise contendo 25 mM de tampão Tris-Cl (pH 8,0), 150 mM de NaCl, 0,2 % de Nonidet P-40, 10% de glicerol, NaF 10 mM, 8 mM β-glicerofosfato, 0,2 mM de Na

3VO

4, DTT 1 mM e 10 ul /ml de cocktail inibidor de protease (Sigma Aldrich, St. Louise , MO) e transferências de Western foram realizados como previamente descrito [10].

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio

1 PANC-células de controlo foram tratadas com 1 uM de 3-Cl-ahpC para 24 h e a análise de reticulação de formaldeído e imunoprecipitação foi realizada utilizando um método anteriormente descrito [10]. cromatina lisado foi incubado com 1 ug de anticorpo anti-c-Myb durante a noite a 4 ° C e foram recolhidas imunoprecipitar complexos com contas Dynal Magntic (Invitrogen). Os seguintes iniciadores foram utilizados em nas amostras de ensaio chip para IGF-1R e a região do promotor Bcl2,

IGF-1R, para a frente, 5′-AGGGGAATTTCATCCCAAAT-3 ‘; reversa,

5′-AGGAAAAGTTCCCGCAGTG – 3 ‘; BCL2, para a frente,

5’CAGAGGAGGGCTTTCTTTCTTCTT-3 ‘; reverso, 5’-CCCGGCCTCTTACTTCATTCT -3 ‘

PCR em Tempo Real foi realizado como descrito anteriormente na secção de ARNm de quantificação. A análise dos dados foi realizada com valores ΔCt de cada c-Myb controle ligado. 3-Cl-AhpC amostras tratadas foi calculada por normalização com controle de entrada e de entrada de valor tratado e cada valor foi a média de três réplicas. Os produtos de PCR foram corridos através de electroforese num gel de agarose a 2% e visualizados por coloração com brometo de etídio e a imagem capturada pela lógica 2200 Gel sistema de imagem Molecular Imaging System Carestream Health, Inc.

de células activadas por fluorescência (FACS ) de CD44

+ /CD24

+ células e formação de esfera

As células foram cultivadas até 70-80% de confluência, tripsinizadas e lavadas com tampão de triagem (1 × PBS, FCS a 5%). As células foram ressuspensas com 100 ul de tampão de triagem e incubadas com 15-20 ul de anti-CD44-PE e anticorpos primários anti-CD24-FITC durante 30 minutos a gelo. As células foram lavadas e ressuspensas em 500 ul de tampão de triagem e classificados utilizando citometria de fluxo sistema FACSAria (BD Imunocitoquímica Systems, Franklin Lakes, NJ).

ordenada CD44

+ /CD24

+ células eram suspensas em meio de células-tronco isento de soro contendo DMEM /F12 (01:01) suplementado com B27 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 20 ng /ml de EGF (Biomol Internacional, Plymouth, PA), 20 ng /ml de factor de crescimento de fibroblastos (Biomol Internacional, Plymouth, PA), e 100 ug /ml de gentamicina. Aproximadamente 150-200 culas por po foram semeadas numa placa de fixação de baixo de ultra de 96 poços (Corning Inc., Lowell, MA). 3-Cl-AhpC (1,0 uM) foi adicionado no dia após as células foram plaqueadas ou após 7 dias de formação de esfera. Esferas foram fotografados e medidos utilizando um microscópio Olympus (Olympus CKX41) e câmera digital Olympus microscópio com software DP2-BSW (Olympus soluções de imagem suave GmbH, Alemanha). Todas as estatísticas foram realizadas utilizando o software estatístico web VassarStats (Richard Lowry, Poughkeepsie, Nova Iorque, EUA). one-way análise de variância (ANOVA) foi realizada para detectar diferenças entre grupos de controle esfera, 3-Cl AhpC tratados esferas. Se o resultado da análise de variância foi significativa (** P 0,01 vs controle), emparelhar comparações sábios entre os grupos foram feitas por um teste post-hoc (procedimento HSD de Tukey). O nível de significância foi fixado em ** P 0,01 vs controle e * P 0,05 vs controle. colchetes foram utilizados nas figuras para indicar tratamentos que são significativamente diferentes do controle.

Resultados

3-Cl-AhpC modulação mediada de microRNAs específicos

PANC-1 exposição da célula de 1 uM de 3-Cl-ahpC modulada a expressão de um número de microARNs (Tabela 1 microarray). A regulação de miR-134, o miR-150 *, de miR-630, o miR-345, o miR-382, o miR-410 e miR-129-5p e sub-regulação de miR-202 e miR-578 foram também observadas ( não mostrado). Outra evidência da modulação de miARN 3-Cl-AhpC mediada foi obtido em tempo real-PCR utilizando uma sonda Taqman. PCR em tempo real demonstrou um aumento estatisticamente significativo na expressão das várias espécies de microRNA às 24 h (Figura 1) em

MicroRNAs foram validados por PCR em tempo real quantitativa. As células foram tratadas com 3-Cl-AhpC durante 24 h. metodologias detalhes foram como descrito em Materiais e Métodos. As barras de erro representam a média de três determinações separadas ± o desvio padrão (SD). *, ** E *** ( 0,05, 0,01 e 0,001) foram significativamente diferentes em comparação entre o controle e amostras tratadas usando

t

-Test

PANC-1 e MiaPaCa-2 células. Nós também determinar-se se 3-Cl-AhpC modulação da expressão microARN resultou em aumento ou diminuição da regulação dos genes alvo por estes microARNs; genes-alvo foram identificadas usando o TargeScanHuman base de 5.0 dados. A modulação dos genes alvo incluindo o EGFR, c-Myb, CDC14A, IGF-1R, Smad1, ABCC1, CPEB3, e CDK6, tanto do ARNm (Figura 2A e B) e o nível de proteína (Figura 2C e E) foi demonstrada em 24 h de exposição 3-Cl-ahpC. Nós também descobrimos que a exposição das células PANC-1 a 3-Cl-AhpC durante 24 h ou 48 h aumento da expressão de miR-150 *, enquanto diminui a expressão da proteína c-Myb e IGF-1R em células (Figura 2D e E) .

(A e B) Redução da expressão de ARNm de SYBR verde-RT-PCR; (C, E) diminuiu os níveis de proteínas foram demonstradas por análise de manchas Western. D). exposição 3-Cl-AhpC aumentou o miR-150 * expressão e, subsequentemente, diminuiu a expressão de proteínas de IGF-1R (E) c-Myb e. As barras de erro representam a média de três determinações separadas ± o desvio padrão (SD). *, ** E *** ( 0,05, 0,01 e 0,001) foram significativamente diferentes em comparação entre o controle e amostras tratadas usando

t

-Test

Over-expressão de miR150 * reforçada apoptose através da regulação c-Myb e IGF-1R e inibido CD44

+ /CD24

+ haste esferas de células-like formação

pesquisas anteriores já haviam mostrado que miR- 150 alvos proto-oncogene c-factor de transcrição Myb durante várias etapas do desenvolvimento dos linfócitos [11]. A fim de demonstrar ainda mais o miR-150 * modulação de c-Myb e IGF-1R em células as PANC-1, pré-miR-150 * foi estavelmente sobre-expressa utilizando um pré-miR-150 * vector de expressão (pré-miR -150 *) PANC-1 em células, resultando num aumento de 7 vezes na pré-miR-150 * expressão (Figura 3A); pré-miR-150 * a sobre-expressão resultou numa inibição de 80% do IGF-1R e os níveis de c-Myb de ARNm, um 50% de diminuição da expressão dos níveis da proteína c-myb e uma diminuição de 32% na expressão do IGF-1R (Figura 3B -D). Além disso, tanto o aumento da expressão de pré-miR-150 * por si só e na presença de 3-Cl-AhpC apoptose significativamente aumentado nas células PANC-1 (Figura 3E). Pré-miR-150 * caspase ativada 3 1,5 vezes, mostrando proteolítica clivada pela caspase 3 fragmentos (Figura 3E, painel superior direito) e induzindo a fragmentação do DNA (Figura 3E, painel inferior direito). Estes resultados em conjunto implicam um papel pro-apoptótico de miR-150 através da sua regulação dos seus genes-alvo. A incubação das células PANC-1, com o inibidor de 2′-O-meyhylated miR-150 * anti-sentido (OME-miR150 *) bloqueou elevação 3-Cl-AhpC-mediada de miR-150 * e os níveis de diminuição na expressão de c-Myb fortemente . Este resultado sugere que o 3-Cl-AhpC exerce os seus efeitos sobre a c-Myb e expressão de IGF-1R por meio da modulação de microRNAs (Figura 4A-C).

(a) aumento da expressão de pré-miR-150 * vector de expressão e miR-150-pré * a diminuição da expressão de c-Myb e IGF-1R de ARNm e proteína de pré-miR-150 * células transfectadas de forma estável (B-D). As células foram tratadas com 1 uM de 3-Cl-AhpC durante 24 h. (E) pré-miR-150 * apoptose induzida por si só e reforçada 3-Cl-AhpC apoptose mediada em células PANC-1. As células foram transf ectadas transitoriamente com pré-miR-150 * vector de expressão durante 24 h e, em seguida, expostos a 3-Cl-AhpC durante 24 h. A indução de apoptose foi avaliada utilizando rotulagem Anexina V-FITC com iodeto de propídio (PI) em células de coloração e as barras de erro representam a média de três determinações separadas ± o desvio padrão (SD). Todas as amostras tratadas são significativamente diferentes de miR-vector. * ( 0,05), ** ( 0,01) e *** ( 0,001) significativamente diferente, em comparação com o miR-vector por

t

-Test. A sobre-expressão de miR-150 * induzida por activação da caspase 3, tal como indicado por caspase 3 clivada em fragmentos pré-miR-150 * células transfectadas transitoriamente (painel superior direito). pré-miR-150 * expressa células PANC-1 apoptose induzida como indicado na laranja de acridina /brometo de etídio células marcadas no painel inferior direito. As células foram transfectadas com pré-miR-150 * durante 48 h e depois coradas e fotografadas usando o software Olympus microscópio de fluorescência da câmara digital e software de DP2-BSW.

(A) Inibidor de 2′-O-metilado miR-150 * (OME-150) inibiu 3-Cl-ahpC mediada miR-150 * a expressão em células transf ectadas transitoriamente. (B e C) de miR-150 bloqueou a degradação inibidor de c-Myb 3-Cl-AhpC mediada. As células foram tratadas com 1 uM de 3-Cl-AhpC durante 24 h. (D) Derrube de expressão c-Myb nas células. (E) Derrube de c-Myb aumentou a apoptose em células. As células transfectadas de forma estável com três SH-myb vectores de expressão de knockdown e Scrumble vector de controlo foram expostas a sequência de 3-Cl-AhpC durante 24 h. A indução de apoptose foi avaliada utilizando rotulagem Anexina V-FITC com iodeto de propídio (PI) em células de coloração e as barras de erro representam a média de três determinações separadas ± o desvio padrão (SD). Todas as amostras tratadas e sh-Myb são significativamente diferentes de controle e sh-vetor; • e ••, ** ( 0,05 e 0,01, respectivamente) são significativamente diferentes pelo

t

-Test e • representada a comparação entre 3-Cl-AhpC a OMe-150 * + 3-Cl -AHPC amostras tratadas.

Colocámos a hipótese de c-Myb era anti-apoptótico nas células PANC-1 e knockdown de c-Myb iria aumentar a apoptose das células tanto na ausência e a presença de 3-Cl-ahpC. Três clones de SH-Myb knockdown foram gerados em células PANC-1 e baixos níveis de expressão de c-Myb foram encontrados (Figura 4D). Knockdown de Myb demonstrado apoptose aumentada em células SH-Myb-KD. A adição de 3-Cl-AhpC a estas células também resultou em níveis significativamente maiores do que o de apoptose observadas com células transfectadas apenas com o vector (Figura 4E).

Bcl-2 também desempenha um papel importante na apoptose antagonizar por um número de agentes [12]. Foi previamente relatado que c-Myb tem um local de ligação no promotor de Bcl-2 e é um regulador positivo da expressão de Bcl-2. Diminuição dos níveis de c-myb em proteína Myb dominante-negativo clone FDCP-mistura indutível células A4 resultou numa diminuição da expressão de Bcl-2 [13]. Estudámos, portanto, Bcl-2 de expressão em células expostas a 3-Cl-AhpC. Encontramos diminuiu significativamente a Bcl-2 mRNA e a expressão da proteína em ambas as células PANC-1 e MiaPaCa-2 (Figura 5A e B). Além disso, a sobre-expressão do pré-miR-150 * resultou numa diminuição da expressão da proteína Bcl-2 sugerindo que é regulada por miR-150 * até c-Myb (Figura 5C). Os ensaios de imunoprecipitação de cromatina foram pré-formado para elucidar o mecanismo pelo qual 3-Cl-AhpC diminui Bcl-2 e IGF-1R expressão. 3-Cl-AhpC exposição resultou numa diminuição significativa na ligação de c-Myb para o IGF-1R e Bcl-2 promotores (Figura 5D).

(A e B) 3-Cl-AhpC diminuiu Bcl-2 mRNA e a expressão da proteína. (C) A sobre-expressão de pré-miR-150 * a diminuição da expressão da proteína Bcl-2. (D) 3-Cl-C-AhpC diminuiu Myb- a ligação aos locais de promotor de Bcl-2 e IGF-1R no ensaio de imunoprecipitação da cromatina. As células foram expostas a 3-Cl-AhpC durante 24 h. As barras de erro representam a média de três determinações separadas ± o desvio padrão (SD). ** E *** ( 0,01 e 0,001). Foram significativamente diferentes em comparação entre o controle a 3-Cl-AhpC tratada mRNA e Myb obrigatório em locais promotoras usando

t

-Test

Temos encontrado previamente que as células PANC-1 enriquecido para CD24 /CD44 positividade possuía o recurso de células-tronco como das esferas que se formam em condições de crescimento não aderentes [8]. A adição de 3-Cl-AhpC a estas esferas inibido o seu crescimento e resultou na indução de apoptose. Portanto, avaliou o efeito de níveis elevados de pré-miR-150 * e knockdown da expressão de c-Myb sobre o crescimento dessas esferas (Figuras 6A, B e C). Ambos os níveis elevados de pré-miR-150 * e knockdown da expressão de c-Myb resultou numa inibição significativa do crescimento de esferas aos 7 e 14 dias. Da mesma forma, Zhang

et ai.

[14] demonstraram recentemente que o aumento da expressão de miR-150 inibe as células estaminais positiva CD133 cancro do fígado através da sua inibição da expressão de c-Myb.

(A e C ) Pré-miR-150 * inibiu a formação de esfera em CD44

+ /CD24

+ células. (B e C) c-Myb knockdown inibiu a formação de esfera em CD44

+ /CD24

+ células PANC-1. Para a formação de esfera, o CD44

+ /CD24

+ células foram classificadas por citometria de fluxo de estavelmente transfectadas pré-miR150 * e sh-Myb derrubar células, respectivamente. Os tamanhos das esferas foram fotografados e medidos numa escala de 100 mm e ampliação de 400 × usando Olympus microscópio de fluorescência software da câmera digital e software DP2-BSW. As barras de erro representam a média de 15 determinações esfera ± o desvio padrão. ** Foi significativamente diferente em comparação com o controlo esferas. Os dados foram analisados ​​por análise de variância; teste de Tukey HSD para comparações múltiplas. ** P 0,0001 vs. controlo. (D) Esquema mostrando previu local conservado alvo de miR-630 na 3’UTR de IGF-1R.

proteína alvo IGF-1R é regulada por miR-630

Galluzzi

et ai.

têm mostrado que o miR-630 regula a paragem do crescimento induzida pela cisplatina por modulação p27 inibidor do ciclo celular

KIP1 e induz a apoptose no cancro do pulmão de células não pequenas [14]. Verificou-se que um PANC- células expostas a 3-Cl-AhpC expressão aumentada de miR-630 de 6 vezes. Usando TargetScanHuman 5,1 software (Tabela 1), encontramos potenciais genes alvo miR-630 IGF-1R e Cdc14A. miR-630 pares para uma região conservada de nucleótidos 7 localizado na posição 2658-2665 do IGF-1R 3′-UTR (Figura 6D). A sobre-expressão de pré-miR-630 reduzida de IGF-1R de ARNm e a expressão da proteína em células transfectadas de forma transiente (Figura 7A-D) enquanto não houve alteração no nível Cdc14A gene alvo ARNm. 3-Cl-AhpC diminuiu o ARNm Cdc14A e a expressão da proteína (Figura 2A e C). O mecanismo pelo qual 3-Cl-AhpC desencadeada diminuição da expressão Cdc14A permanece a ser determinada. O anti-sentido inibidor de 2′-O-metilado miR-630 bloqueou pré-miR-630 degradação mediada por IGF-1R indicou que o ARNm de um gene alvo de miR-630 é o IGF-1R (Figura 7E). Além disso, a sobre-expressão de pré-miR-630 e a inibição aumentada apoptose significativamente em PANC-1 de células (Figuras 7F e G). Estes resultados demonstram o importante papel do miR-630 na indução de apoptose em células de cancro pancreático.

(a) pré-miR-630 em expressão PANC-1 e células MiaPaCa-2. (B e C) A expressão aumentada de pré-miR-630 diminuiu o ARNm de IGF-1R, mas não em células Cdc14A. (D). A diminuição da expressão da proteína IGF-1R em pré-miR-630 expresso células. (E) Inibidor de 2′-O-metilado miR-630 (OME-630) bloqueou a degradação de IGF-1R ARNm. As células foram transf ectadas transitoriamente com pré-miR-630 durante 48 h (F e G) pré-miR-630 inibiu o crescimento e a expressão de apoptose induzida em células PANC-1. A inibição da proliferação de células foi avaliada após 48 h de miR-630 pré-células transitoriamente transfectadas pelo ensaio MTT e expressos como percentagem de inibição que de cada vez em relação ao controlo de miR-vector. As barras de erro representam a média de quatro determinações separadas ± o desvio padrão (SD). *, ** E *** ( 0,05, 0,01 e 0,001) foram significativamente diferentes comparativamente entre o miR-vector e miR-630; • foi altamente significativa e representou a comparação entre miR-630 a miR-630 + OME-630 usando

t

-Test. A apoptose de células de miR-630 foi avaliada após 48 h de células transfectadas. A morte celular foi medida por associada-histona-DNA fragmentos citoplasmáticos por ELISA (OD = factor de enriquecimento de miR-630 expresso lisado /OD do miR-vector, OD a 405 nm-490 nm).

Discussão

A importância da expressão microARN na manutenção da fisiologia celular normal tem sido bem documentada [15]. A inibição do processamento de microARN foi mostrada para aumentar a transformação celular [16]. O knockdown incompleto de Dicer 1 em células de adenocarcinoma de pulmão de rato resultou num aumento da proliferação e invasão celular, bem como

In vivo tumor

formação reforçada [16]. Além disso, a diminuição da expressão microARN em fibroblastos embrionários de rato resultou em transformação incompleta das células [16]. Os mecanismos pelos quais a expressão microARN diminui nas células malignas, por oposição às células normais não é clara. Recentemente, a regulação de expressão epigenética microARN tem sido demonstrado numa variedade de tumores [17]. microRNA genes foram silenciados em tumores humanos por hipermetilação aberrante de ilhas de CpG adjacentes e circundantes para os genes microRNA e por acetilação de histonas gene microARN associados [17]. Verificou-se que uma proporção mais elevada de genes conhecidos microRNA foram encontrados para ser regulada epigeneticamente através de metilação (11,6%) do que o encontrado nos genes que codificam proteínas (1-2%) [18], [19].

na presente publicação, nós demonstramos que o 3-Cl-ahpC modula a expressão de um número de microRNAs que regulam a tradução e a degradação de ARNm. Estes ARNm codificam a expressão de proteínas previamente demonstrado ter funções fisiológicas importantes na proliferação celular e a morte. Verificou-se que a exposição de 3-Cl-AhpC resultou na sobre-regulação de um número de microARNs incluindo o miR-150 e miR-* 630. A importância da modulação desses microRNAs foi demonstrada pela observação posterior modulação de sua genes- alvo para incluindo EGFR, c-Myb, Smad1, ABCC1, CPEB3, IGF-1R e CDK6.

3-Cl-AhpC-se -regulação de miR-150 * resultou na diminuição da expressão de c-Myb e IGF-1R. Ambas as proteínas desempenham papéis críticos no aumento da proliferação celular. A sobre-expressão de IGF-1R foi encontrado em uma variedade de doenças malignas, incluindo o cancro pancreático [20]. Inibição de IGF-1R utilizando inibidores de cinase de moléculas pequenas resultou em crescimento do cancro do pâncreas reduzida [21].