Sumário

Thiacremonone (2, 4-di-hidroxi-2, 5-dimetil-tiof eno-3-ona) é uma substância anti-oxidante como um composto de enxofre romance gerado a partir de High-Temperature-de alta pressão-tratada alho. Peroxirredoxina 6 (PRDX6) é um membro de peroxidases, e tem a glutationa peroxidase e A2 actividades independentes de cálcio (fosfolipase iPLA2). Vários estudos têm demonstrado que PRDX6 estimula o crescimento celular do cancro do pulmão através de um aumento da actividade de glutationa peroxidase. Um estudo do modelo de ancoragem e puxar para baixo ensaio mostrou que a thiacremonone se encaixa completamente no site ativo (Cis-47) da enzima glutationa peroxidase de PRDX6 e interage com PRDX6. Assim, investigamos se thiacremonone inibe o crescimento celular, bloqueando glutationa peroxidase de PRDX6 nas células de câncer de pulmão humanos, A549 e NCI-H460. Thiacremonone (0-50 ug /mL) inibiu o crescimento de células de cancro de pulmão de uma forma dependente da concentração através da indução da morte celular por apoptose acompanhada pela indução de caspase-3 clivada, -8, -9, Bax, p21 e p53, mas diminuição de XIAP , cIAP e expressão Bcl2. Thiacremonone atividade da glutationa peroxidase ainda mais inibida em células de câncer de pulmão. No entanto, não foi observado o efeito inibidor do crescimento de células de thiacremonone nas células de cancro do pulmão transfectadas com PRDX6 mutante (C47S) e na presença de ditiotreitol e glutationa. Em um aloenxerto modelo in vivo, thiacremonone (30 mg /kg) inibiu o crescimento do tumor também acompanhada com a redução de expressão PRDX6 e a actividade de peroxidase de glutationa, mas o aumento da expressão da caspase-3 clivada, -8, -9, Bax, p21 e p53 . Estes dados indicam que thiacremonone inibe o crescimento tumoral por inibição da actividade de glutationa peroxidase através da interacção PRDX6. Estes dados sugerem que thiacremonone pode ter efeitos potencialmente benéficos no câncer de pulmão

Citation:. Jo M, Yun H-M, Parque K-R, Parque MH, Lee DH, Cho SH, et al. (2014) Anti-Cancer Efeito da Thiacremonone através do Regulamento de Down de Peroxirredoxina 6. PLoS ONE 9 (3): e91508. doi: 10.1371 /journal.pone.0091508

editor: Peiwen Fei, Universidade do Havaí Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de dezembro de 2013; Aceito: 13 de fevereiro de 2014; Publicação: 11 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Jo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Governo da Coreia (MSIP) (No. MRC, 2008-0062275). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Peroxirredoxinas (PRDXs) são uma família de enzimas peroxidases como antioxidantes [1] – [2]. A família PRDX inclui seis membros. Eles são divididos em duas classes [3]. O grupo 2-Cys inclui PRDX1-5, enquanto PRDX6 é apenas uma parte do grupo 1-Cys. PRDXs são uma família de peroxidases que destroem peróxidos utilizando resíduos de cisteína conservados no centro catalítico [4]. Entre os seis membros mamíferos desta família, PRDX6 é o único membro que tem actividades independentes de cálcio fosfolipase A2 () iPLA2 glutationa peroxidase e [5]. Considerando outras PRDXs tioredoxina utilizar como redutor fisiológico, PRDX6 utiliza glutationa [6]. PRDX6 protege as células de membrana, ADN, danos proteicos, e peroxidação lipídica [7]. O elemento de resposta antioxidante (ARE) na região promotora prdx6, um

cis

actuando elemento regulador, é activada pelo stress oxidativo [8]. A transcrição do gene PRDX6 é regulada pelo factor nuclear de factores relacionados eritróide 2-1, 2, e 3 (Nrf1, Nrf2 e Nrf3) como factores de transcrição através da ligação ao ARE [9]. Entre os Nrfs, Nrf2 regula positivamente a transcrição do gene PRDX6 [10].

Como PRDXs são antioxidantes, que suportam a sobrevivência e a manutenção do tumor, protegendo as células de apoptose induzida por stress oxidativo [11]. Em um estudo recente, sobre expressão de PRDX 6 atenua a apoptose induzida por cisplatina em células de câncer de ovário humano [12]. Em contraste, a redução da expressão PRDX6 aumento da morte celular induzida por peróxido em células de cancro do fígado [13]. A invasão e metástase acções de promoção PRDX6 foi encontrado em células de cancro de pulmão através da activação de Akt através da activação de phosphoinositiede 3-quinase (PI3K) e p38-quinase [4], [14]. A actividade de PRDX6 contribui para a capacidade metastática de células de cancro do pulmão, estimulando componentes incluindo invasão de PI3K, AKT, e uPA [4]. Também foi relatado que a expressão PRDX6 em células de cancro do pulmão foi significativamente associado com a progressão tumoral [15].

alho tem sido usado na medicina tradicional como componente dos produtos alimentares para evitar o desenvolvimento de cancro [16]. Thiacremonone (2,4-di-hidroxi-2,5-dimetil-tiofeno-3-ona) é uma substância anti-oxidante, tal como um composto de enxofre romance, gerada a partir de High-Temperature-de alta pressão (HTHP) alho tenha sido tratada com [17]. No presente estudo, nós investigamos o efeito anti-câncer do thiacremonone através da inibição da atividade da glutationa peroxidase através da interação em células de câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Extração e caracterização de thiacremonone

A estrutura de um composto de enxofre isolado a partir de alho (thiacremonone chamado) é mostrada nos resultados (Fig. 1A). Alho (Allium sativum L) foi aquecida a temperaturas de 130 ° C durante 2 horas. As amostras foram aquecidas espremido e depois filtrou-se num funil de Buchner sob um vácuo. sumo de alho aquecida foi particionado consecutivamente num funil de separação, utilizando acetato de etilo. O isolamento dos compostos de a camada de acetato de etilo de sumo de alho aquecida foi submetido a cromatografia em coluna sobre gel de sílica. Esta fracção contendo thiacremonone foi purificado por RP-HPLC preparativa numa Younglin SP930D Instrumento [17]. Thiacremonone foi resolvido em 0,01% de dimetilsulfóxido, e tratou-se em concentrações de 10, 20, e 50 ug /ml em células de cultura.

(A) Estrutura do thiacremonone, um sulfurcompound isolado a partir de alho. (B) proteína recombinante de PRDX6 foi incubado com conjugado thiacremonone-Sepharose 4B. (C) Os lisados ​​de células totais de NCI-H460 foram incubadas com conjugado thiacremonone-Sepharose 4B. Após a precipitação, os níveis de PRDX6 ligados foram monitorados por análise de transferência de Western. (D) Depois da precipitação com thiacremonone conjugado com Sepharose 4B, os níveis de PRDX6 ligado ou C47S PRDX6 mutantes foram monitorados por análise de transferência de Western. (E) modelo de representação da fita de ancoragem de thiacremonone com PRDX6 (F) modelo de acoplamento representação da superfície molecular de thiacremonone com PRDX6.

Cultura de Células

O A549 e NCI-H460 células do cancro do pulmão linhas foram adquiridas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). A linha de células normais CCD-18Co cólon e da linha de células normais de pulmão LL24 foram adquiridos a partir do banco linha celular coreana (Seoul, Coreia). células normais NCI-H460 e LL24 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e penicilina /estreptomicina (100 U /ml). A549 e CCD-18Co células normais foram cultivadas num meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e penicilina /estreptomicina (100 U /ml). As culturas celulares foram então mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2.

Ensaio de viabilidade celular

Para determinar os números de células A549, e NCI-H460 do cancro do pulmão ou células CCD- a linha de células normais de cólon 18Co e linha de células normais de pulmão LL24 foram plaqueadas em placas de 24 poços (5 x 10

4 células /cavidade). As células subconfluentes foram subsequentemente tratadas com thiacremonone (10, 20, e 50 ug /ml) durante 72 h. Após o tratamento, as células foram tratadas com tripsina e sedimentadas por centrifugação durante 5 min a 1500 rpm, ressuspendeu-se em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), e 0,1 ml de 0,2% de azul de tripano foi adicionado à suspensão de células de cancro em cada uma das soluções (0,9 ml cada). Subsequentemente, uma gota de suspensão foi colocada numa câmara de Neubauer e as células cancerosas vivas foram contadas. As células que mostraram sinais de coloração foram consideradas mortas, enquanto que aqueles que foram excluídos do azul de tripano considerado viável. Cada ensaio foi realizado em triplicado.

A transfecção

células cancerosas de pulmão (5 × 10

4 células por poço) foram plaqueadas em placas de 24 poços e transientemente transfectadas com ARNsi PRDX6 ( Santa Cruz Biotechnology) ou pcDNA-PRDX6, (presentes generosos de DR. Jhang Ho Pak, da Universidade de Ulsan College of Medicine utilizando uma mistura de Prdx6 siRNA ou pcDNA-Prdx6 eo WelFect-EX PLUS reagente em Opti-MEN, de acordo com o as especificações do fabricante (WelGENE, Seoul, Coréia).

luciferase Ensaio de Actividade

células do cancro do pulmão humano NCI-H460 A549 e foram transfectadas com plasmídeo prdx6 promotor-Luc utilizando uma mistura de plasmídeo eo WelFect reagente EX Plus em Opti-homens, de acordo com as especificações do fabricante (WelGENE, Seoul, Coreia). Após 6 horas, as células foram tratadas com thiacremonone. a actividade de luciferase foi medida utilizando o kit de ensaio de luciferase (Promega, Wisconsin, EUA) de acordo com as instruções do fabricante (WinGlow, Bad Wildbad, Alemanha)