Abstract

misexpression de fatores de crescimento, particularmente os relacionados com a estaminais fenótipo de células-like, é frequentemente observada em vários tipos de câncer. Verificou-se para influenciar os parâmetros de progressão da doença como a proliferação celular, diferenciação, manutenção do fenótipo indiferenciada e modulação do sistema imunitário. GDF3 é um membro da família relacionado com TGFB pluripotência e diferenciação durante o desenvolvimento embrionário, que foi previamente relatado para ser re-expresso num certo número de tipos de cancro. No entanto, o seu papel no desenvolvimento e progressão do tumor não foi ainda clarificado. Neste estudo, decifrar o papel de GDF3 em um

in vitro

modelo de cancro de células estaminais, células NCCIT. Por abordagem clássica para estudar a função da proteína combinada com a técnica de alto rendimento para a análise do transcriptoma e ensaios de diferenciação avaliamos GDF3 como um potencial alvo terapêutico. Observamos que GDF3 robustamente induz um painel de genes relacionados à diferenciação, incluindo vários supressores de tumor potentes, sem afetar a capacidade proliferativa. Além disso, é relatada pela primeira vez, o efeito protector de GDF3 contra a apoptose induzida por ácido retinóico em células com propriedades semelhantes a células estaminais. Nosso estudo sugere que o bloqueio de GDF3 combinado com ácido retinóico-tratamento de cancros sólidos é uma direção convincente para futuras investigações, que pode levar a re-design de terapias de diferenciação câncer

Citation:. Tykwinska K, Lauster R, Knaus P, Rosowski M (2013) Crescimento e Diferenciação Fator 3 induz a expressão de genes relacionados à diferenciação em um modelo de células-tronco cancerosas e os protege de apoptose ácido retinóico-induzido. PLoS ONE 8 (8): e70612. doi: 10.1371 /journal.pone.0070612

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de fevereiro, 2013; Aceito: 20 de junho de 2013; Publicação: 12 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tykwinska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores gostaria de afirmar que este trabalho foi financiado pela Technische Universität Berlin e pela DFG através da Escola Berlin-Brandenburg for Regenerative Terapias GSC 203. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro células-tronco-like (CSC) constituem uma pequena população de de iniciação tumor. células, com ampla capacidade de auto-renovação, capacidade de gerar não-tumorigénico células finais e potencial multidifferentiation. CSCs são acreditados para ser a principal causa de resistência à quimioterapia e recidiva da doença. De acordo com a hipótese de CSC, o controle sobre esse compartimento de células altamente proliferativa define a cura definitiva para o câncer [1] – [3]

Há estudos em curso para definir marcadores CSC

in vivo

. , mas nenhuma combinação de confiança, universal foi encontrado até agora. No entanto, Ben-Porath [4] e outros [5], [6] mostrou que uma característica comum dos tumores histologicamente pouco diferenciados – que geralmente apresentam os piores prognósticos – é a assinatura ES-like, incluindo expressão de NANOG, OCT4, SOX2 e os seus objectivos [7], [8]. expressão aberrante de fatores de células-tronco dentro de tumores sustenta fenótipo agressivo e aumenta a probabilidade de progressão e metástase [9].

Entre a grande quantidade de linhas celulares de cancro disponível para estudar a biologia do câncer

in vitro

, linhas de células de carcinoma embrionário exibir assinatura ES-like, incluindo a expressão dos fatores de transcrição associados pluripotência-redes principais, e não só são capazes de diferenciar

in vitro

, mas também são altamente tumorigênico

in vivo

. Portanto, linhas de células de carcinoma embrionário (CE), são esperados para ser um modelo adequado de CSC [10], [11].

crescimento e factor de diferenciação 3 (GDF3) é amplamente aceito como marcador de pluripotência, como é um objectivo da transcrição directa de NANOG [12]. Foi relatado para regular tanto as principais características das células estaminais embrionárias, manutenção do fenótipo indiferenciado e de potencial de diferenciação a [13].

Junto com outros marcadores de células estaminais embrionárias, GDF3 foi mostrado para ser expresso em vários cancro tipos, tais como carcinoma da mama [14], [15], o melanoma [16], seminoma [15], e tumores de células germinativas testiculares [17]. Enquanto NANOG, SOX2 OCT4 e foram identificados como factores de transcrição de promoção stemness, o papel de GDF3 permanece pouco compreendido. Resultados publicados por outros, até à data, em relação ao suposto papel desta molécula na biologia do câncer são contraditórias. Demonstrou-se, que GDF3 inibe a proliferação da linha celular de carcinoma da mama MCF7 [14], mas aumenta a proliferação de mieloma B16 e pode promover a diferenciação neuronal de células PC12 [18].

GDF3 pertence ao factor de crescimento potente família do fator de crescimento transformante β (TGFB). Membros da família TGFB, incluindo Proteínas Ósseas Morfogenéticas (BMPs), crescimento e factores de diferenciação (GDF) e TGFB, exibir, efeitos, por vezes, opostas distintos nas células alvo, dependendo do contexto celular, outros ligantes presente, dosagem e identidade da citocina [ ,,,0],19]

GDF3 foi referida como estando envolvida em ambas as vias canónicos desencadeadas por membros da família TGFB:. (1) inibição extracelular de BMPs [13] e (2) a indução de Smad2 /3 fosforilação devido à ligação a activina a receptores do tipo receptores IB ou IC (ACVRIB, ACVRIC) e activina um tipo IIA ou IIB (ACVRIIA, ACVRIIB) em cooperação com obrigatória fator de crescimento derivado de teratocarcinoma co-receptor 1 (TDGF1) [20], [21].

O papel emergente de Smad2 /3 cascata de sinalização já foi demonstrado no pâncreas, da mama, gástrico, do ovário, da pele e muitos outros tipos de cancro. No entanto, ambas, activação e bloqueio da via de Smad2 /3 pode ter efeitos positivos sobre o início da doença [22] – [24]. Portanto, a ação de cada ligando desencadear esta via tem de ser cuidadosamente investigados e avaliados.

Encorajados por estes fatos, nós nos abraçamos o desafio de investigar exaustivamente os efeitos da GDF3 de sinalização em um modelo de linha CSC pelo perfil transcriptoma e ensaios de diferenciação e avaliar o seu potencial como alvo terapêutico. Descobrimos que GDF3 regula a expressão de genes envolvidos na diferenciação, mas não influencia a capacidade proliferativa de CSC indiferenciada. Além disso, demonstra-se que o CSC GDF3 protege da apoptose induzida por ácido retinóico, o único clinicamente aprovado cito-diferenciação, agente anti-cancro.

Materiais e Métodos

cultura celular e diferenciação

NCCIT e células HEK293T (Colecção americana de tipo celular) foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco com 4,5 g /l de glicose (PAA Laboratories, Áustria) contendo FBS a 10% (PAA Laboratories, Áustria) e penicilina-estreptomicina (PAA Laboratories , Áustria).

para gerar linhas celulares GDF3 knockdown, os oligonucleótidos shRNA para segmentação GDF3 foram sintetizados por TibMolBiol (TibMolBiol, Alemanha) e clonado no vector lentiviral pLL3.7 (addgene, EUA). Todas as construções foram sequenciadas (GATC, Alemanha) antes da aplicação. Em combinação com os plasmídeos de empacotamento 2 PAX2 e VSVG o vírus foi produzida por transfecção com fosfato de cálcio de células 293T. O vírus contendo o meio foi recolhido, 20 × concentrados em Spin® FX® UF Concentrador (Corning, Alemanha) e misturou-se com células NCCIT com adição de 10 ug /ml de polibreno (Sigma, Alemanha). O meio foi mudado para meio normal no dia seguinte.

Para induzir a diferenciação, as células NCCIT foram tratadas com 10? M all-trans ácido retinóico (Sigma, Alemanha) durante 14 dias.

análise de Microarray

para a análise do transcriptoma genoma humano CGH Microarray 44K (Agilent Technologies, EUA) foi utilizado de acordo com a fabrica de protocolo. Em resumo, o RNA isolado foi marcado por Low Input RNA fluorescente Linear Amplification Kit (Agilent Technologies, EUA), fragmentado, misturado com metas de controle e hibridizados durante a noite. As lâminas foram então lavadas e digitalizado com 5 um scanner de resolução usando DNA microarrays (Agilent Technologies, EUA). Recursos foram extraídos com a ferramenta de análise de imagem Um 6.1.1. (Agilent Technologies, EUA), usando as configurações padrão. A análise dos dados foi realizada com Rosetta Informática Plataforma Resolver Construído 4.0.

A análise sobre-representação foi realizada por upload dos conjuntos de genes com p-value≤0.05 e dobre change≥1.5 à base de dados da anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID ) v6.7 [25] e realizar a análise Gene ontologia usando a entrada Panther_BP_ALL.

dados de microarranjos (número de acesso GSE44670) foi enviada para o banco de dados NCBI GEO. O conjunto de dados compreende 3 condições (A-C, descrito mais adiante na base de dados GEO e na parte resultados) com uma réplica biológica cada. O controle não tratado em A e B é representada por uma amostra diferente.

O mapa de calor foi gerado por CIMminer, um freeware desenvolvido pela Genomics e Grupo de Bioinformática do Laboratório de Farmacologia Molecular, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer . Foram selecionados apenas sondas com p≤0.05 e dobre mudança ≥1.5 em qualquer microarray A ou B. Se p 0,05, dobre mudança foi padrão definido para 1 (definido como a cor preta no mapa de calor)

O isolamento de ácidos nucleicos, síntese de cDNA e qPCR

usando

O isolamento do RNA foi realizada. NucleoSpin® ARN II kit (Macherey-Nagel, Alemanha), seguindo as instruções fornecidas.

transcrição reversa do ARNm foi efectuada utilizando kit de ADNc Reagentes Transcrição reversa TaqMan ® (Applied Biosystems, EUA), de acordo com o fabricante do instruções.

PCR em tempo real foi realizado utilizando um cDNA ul com 1 ul de mistura de iniciadores e SensiFAST ™ Sybr n-ROX kit (Bioline, Alemanha), em placas de 96 poços de PCR (Biozym Scientific, Alemanha), e foram lidos com Stratagene MX 3005P ™ Multiplex Quantitative PCR System (Agilent Technologies, EUA). Primers foram encomendados à TIBMolBiol (Alemanha).

A lista de primer pode ser encontrada na Tabela 1.

luciferase ensaio

A construção BMP-responsive BRE-luc [26] e elemento de ligação SMAD construir SBE-luc foram presentes amáveis ​​do Prof. P. Ten Dijke (Universidade de Leiden Medical Center). CAGA-luc foi uma simpática oferta do Prof. P. Knaus (Freie Universität Berlin). As células foram semeadas, transfectadas com TurboFect (Thermo Scientific, Alemanha, o procedimento de acordo com o protocolo do fabricante) e 24 h mais tarde fome durante 3 horas em meio isento de soro e em seguida estimuladas durante pelo menos 20 h com ligando de interesse (rhGDF3, rhNodal e rhBMP2 foram adquiridos a partir de R D Systems, Alemanha). Para testar a capacidade inibidora de GDF3, rhGDF3 rhBMP2 e foram incubados em conjunto num meio isento de soro durante 1 hora antes da estimulação das células. As células foram em seguida lisadas e a actividade da luciferase foi medida em lisados ​​por dupla Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Alemanha) no leitor de microplacas Omega (BMC Labtech, Alemanha). Os dados são representados como unidades relativas de luciferase (RLU), que são calculados como a razão do pirilampo Renilla.

TDGF1 plasmídeo de expressão

TDGF1 plasmídeo de expressão foi criado através de amplificação por completo da ORF TDGF1 utilizando ADNc como NCCIT um modelo com primers TDGF1 clonagem up /clonagem TDGF1 fazer. O produto de PCR foi inserido no pIRES2-EGFP (BD Biosciences, Alemanha) através de sítios de restrição NheI /BamHI. Nhel, BamHI, Taq polimerase e ligase de T4 foram adquiridos a Thermo Scientific.

As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela 1.

Imunofluorescência

As células foram semeadas em lâminas de câmara (BD Biosciences, Alemanha) e no dia seguinte fixo em PFA a 4%, permeabilizadas com PBS /0,05% de Triton X-100 (Sigma, Alemanha) e corados de acordo com o protocolo do fornecedor AB. Os anticorpos utilizados foram: de ratinho anti-humano AB Smad2 (Thermo Scientific, Alemanha), de coelho anti-humano TUBB3 AB (Sigma, Alemanha) e anti-IgG de ratinho (H + L) -A594 AB e IgG anti-coelho (H + G) -. Alexa594 AB (Molecular Probes, EUA)

para a translocação SMAD, as células foram privadas de 3 h em meio isento de soro e em seguida estimuladas com 300 ng /mL rhGDF3 durante 1 h, antes da fixação.

as fotografias foram obtidas com um microscópio de fluorescência digitais BZ 9000 (Keyence, Alemanha) e visualizadas com BZviewer (Keyence, Alemanha), após contracoloração núcleos com Hoechst 33342 (Sigma, EUA).

western blot

para a análise de western blot, as células foram lisadas em tampão 5xLaemmli e fervida durante 5 min. Os lisados ​​celulares totais foram separados por electroforese em gel de 10% SDS-poliacrilamida e as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (Macherey-Nagel, Alemanha). As membranas foram bloqueadas em BSA a 5% e depois incubadas com um anticorpo anti-Smad2 (Thermo Scientific, Alemanha), anti-pSMAD2 (Invitrogen, Alemanha), e anti-GAPDH (Thermo Scientific, Alemanha) ABS, seguida de incubação com peroxidase de rábano abs secundárias -conjugated (Thermo Scientific, Alemanha). proteínas imunorreactivas foram visualizadas utilizando um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Thermo Scientific, Alemanha). As fotografias das membranas foram adquiridos por Fusion fx7 (Peqlab, Alemanha).

Análise FACS

A proliferação foi rastreado por coloração das células com violeta CellTrace® (Invitrogen, Alemanha) e por apoptose anexina V- Pacific Blue (BioLegend, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

citometria de fluxo foi realizada utilizando um Analisador de MACSQuant® (Miltenyi, Alemanha) citómetro de fluxo e os dados foram analisados ​​utilizando o software FlowJo, versão 7.6.5 (árvore da estrela inc., EUA). Os dados de, pelo menos, 30 000 células foi rotineiramente adquiridos para cada amostra. A contagem de células foi normalizada para a altura do pico na moda da distribuição pelo algoritmo FlowJo, de modo que contagem absoluta é representada por 100% do total (% do Max).

A análise estatística

Unpaired teste t de Student foi aplicado para os conjuntos de dados, utilizando

GraphPad Prism

® software versão 5.0 (GraphPad software Inc., EUA). Os valores de p menor do que ou igual a 0,05 foram considerados significativos. (*) Indica p £ 0,05, (**) p≤0.01 e p≤0.001 (***). Os dados são representados como média +/- desvio padrão.

Resultados

células NCCIT expressar componentes essenciais da cascata de sinalização GDF3

GDF3 e seu co-receptor obrigatória TDGF1 têm um padrão de expressão estreito e está associada com o fenótipo pluripotentes em células estaminais embrionárias e cancro. Para estabelecer a linha de células de carcinoma embrionário NCCIT como um modelo de CSC adequado para estudar o papel de GDF3, avaliou-se a expressão de importantes componentes da via de sinalização GDF3 por RT-PCR. Detectamos expressão de

GDF3

e outros ligantes secretados potencialmente envolvidas na sinalização GDF3, tais como

nodais e

LEFTY2

(Figura 1A). NODAL utiliza o mesmo tipo I e tipo II receptores [27] e pode, por conseguinte competir com GDF3 para os sítios de ligação do receptor. LEFTY2 é um inibidor natural, extracelular de nodais e GDF3 [28]. Também transcritos de ambos, os receptores do tipo I (ACVRIB e C) e tipo II (ACVRIIA e B) estão presentes em células NCCIT, juntamente com o co-receptor aplicabilidade

TDGF1

(Figura 1B) e os mediadores de sinalização intracelular R SMADs (

Smad2

e

Smad3

), co-SMAD (

SMAD4

) eo inibidor

SMAD7

(Figura 1C), envolvido em o ciclo de feedback negativo de Smad2 /3 cascata de sinalização em células-tronco embrionárias.

a-C. Expressão de GDF3, ligando agonista nodais e inibidor extracelular Lefty2 (A), GDF3 receptores (B) e mediadores intracelulares de sinalização SMADs (C). A expressão foi determinada por RT-PCR, a expressão de GAPDH serviu como um controlo. Um exemplo representativo é descrito. n = 3 actividade da luciferase D. BRE-dependente em células NCCIT tratadas com 20 ng /ml de BMP-2 sozinho como controlo positivo ou com misturas pré-incubada de 20 ng /ml de BMP e 3 ×, 5 ×, 10 × excesso molar de GDF3 . E. SBE-dependente actividade de luciferase em células estimuladas com NCCIT GDF3 em concentrações que variam 50-700 ng /mL. Os resultados em D-E são mostradas como um pirilampo a proporção de Renilla e normalizada para amostra não-estimuladas. As barras representam um valor médio de três réplicas biológicas +/- desvio padrão. Os valores de p menor do que ou igual a 0,05 foram considerados significativos. (*) Indica p £ 0,05, (**) p≤0.01. F. Análise de imunotransferência da fosforilação nas células Smad2 NCCIT após fome e o tratamento com 300 ng /mL nodal ou 100 ng /mL GDF3 durante 1 h. GAPDH foi usada como um controlo de carga. Uma imunotransferência representativa está representada. n = 3. G. A translocação de Smad2 em NCCIT após estimulação com 300 ng /mL GDF3. As células foram coradas com anti-Smad2 e anti-murganho Alexa594 anticorpos (painel superior) e contra-coradas com Hoechst (painel inferior). barra amarela indica 100 mm. Um exemplo representativo é descrito. n = 3.

A expressão de GDF3 ligantes, receptores e efetores foi testado em outra linha de células de carcinoma embrionário, NTERA2 (Figura S1). Exceto de

ACVRIC

e

ACVRIIB

, todos os componentes do GDF3 cascata de sinalização também foram detectados por RT-PCR.

sinalização GDF3 é funcionalmente activa no modelo de CSC

GDF3 foi relatado para (1) ser capaz de bloquear Smad1 /5/8-sinalização através da ligação a BMP, por exemplo, BMP4 no espaço extracelular [13] e (2) induzir Smad2 /3 cascata [20] sinalização, [29]. Neste último caso, GDF3 actua por ligação a e juntando-se os receptores da superfície celular TDGF1 e dímeros de tipo I e tipo receptores II que leva à fosforilação de Smad2 ou Smad3 como efectores intracelulares que são subsequentemente translocado para o núcleo da célula para actuar como factores co-transcrição . Para testar o modo de ação dos GDF3 é funcional em nosso modelo de CSC, foi realizado um ensaio de luciferase. As células NCCIT foram transfectadas com vectores contendo BMP-responsivo elementos (BRE-Luc) e subsequentemente estimuladas com uma mistura de BMP2 e GDF3 em 1-, 3-, ou excesso molar de 10 vezes. Tal como mostrado na Figura 1D, a expressão da luciferase foi robustamente activado por BMP-2, apesar GDF3 presença no meio.

Para avaliar a activação de Smad2 /3 via, que as células transfectadas NCCIT com um vector contendo o SMAD Binding elemento (SBE-Luc) e estimulou as células com concentrações crescentes de GDF3. A actividade de luciferase máxima impulsionado pela construção do promotor foi conseguido com 300 ng /ml e não aumente ainda mais com o aumento da concentração do ligando (Figura 1E).

Foi confirmada a identidade da SMAD fosforilada por extracção de proteínas a partir de NCCIT células estimuladas por GDF3 e detecção de Smad2 fosforilada por western blot. Estimulação com NODAL humana recombinante (rhNodal) foi realizada como controlo positivo para a activação de Smad2 /3 cascata de sinalização (Figura 1F). Nós também foram capazes de acompanhar a translocação de Smad2 para o núcleo em cima GDF3-estimulação por imunofluorescência, mostrada na Figura 1G.

Em resumo, fomos capazes de mostrar que GDF3 induz a via Smad2 /3 em NCCIT células, e não funcionar como BMP-antagonista extracelular.

GDF3 não influencia a proliferação de células NCCIT

Desde GDF3 foi relatado para influenciar a proliferação de células cancerosas anteriormente [14], [16 ], determinou-se GDF3 tem um impacto sobre a proliferação da linha de células de modelo CSC. As células NCCIT foram marcadas com um corante violeta CellTrace®, semeadas e estimuladas com rhGDF3 a cada 24 h. As células foram recolhidas todos os dias e a quantidade do corante incorporado em células estimuladas com GDF3 e não tratados foi avaliada por FACS e comparado. Não foram encontradas diferenças, como mostrado na Figura 2A e Tabela 2.

A. A análise FACS da quantidade de CellTrace® violeta incorporado nas células NCCIT repetidamente estimuladas com 300 ng /mL rhGDF3 (curva de cor) e não tratadas (linha preta). B-C. A análise FACS da quantidade de CellTrace® violeta incorporada NCCIT SCR (B) e NCCIT sh1GDF3 células (C). As células foram coradas, semeada e colhida a cada dia (indicado como D0-D3). linha cinzenta indica células não coradas. A contagem de células foi normalizado para a altura do pico na moda da distribuição pelo algoritmo FlowJo, de modo que a contagem absoluta é representada por 100% do total (% de máximo). O experimento foi realizado em triplicado, um exemplo representativo é descrito.

Para testar o efeito de diminuição da concentração de GDF3 endógena em células NCCIT, criamos uma linha de células knockdown GDF3 estável, por transdução NCCIT de células com lentivírus com um shRNA-cassete segmentação GDF3. A eficiência da transdução e GDF3 subsequente regulação negativa foi monitorizada através de FACS através da expressão da GFP e por qPCR para

GDF3

expressão, respectivamente (Figura S2). Dos dois constructos testados shRNA, GDF3 knockdown na linha celular gerado com sh1GDF3 foi mais eficiente e atingiu 96%, e, por conseguinte, foi utilizada para todas as experiências seguintes. GDF3 knockdown não influenciou a capacidade proliferativa das células NCCIT, quando comparado com células de controlo, transduzidas com mexidos vector (figura 2B-C e Tabela 2).

GDF3 modula a expressão de genes no modelo de CSC

para obter mais detalhes sobre o papel potencial dos GDF3 em nosso modelo de CSC e identificar alvos GDF3-jusante, perfis de expressão gênica global de células NCCIT estimulados com GDF3 ou com GDF3 knockdown foram analisados ​​por uma plataforma de cDNA microarray. Escolhemos um curto período de estimulação de 3 h, para avaliar os efeitos primários da estimulação do ligando.

A resposta à estimulação da transcrição por vários membros da família TGFB que sinalizam através da mesma via, muitas vezes varia, dependendo em primeiro lugar sobre a força de Smad-sinalização desencadeado nas células alvo e a activação das vias de não-SMAD [30]. Além disso, a sinalização do ligando dependente da concentração Smad2 /3 foi relatado para desencadear diferencial, mesmo de maneiras opostas [19], [31]. Portanto, em nosso estudo, destinado a cobrir uma ampla gama de efeitos de transcrição causadas por diminuição e aumento da força de Smad2 /3 de sinalização em células NCCIT (Tabela 3, microarrays A a C). Especificamente, aplicou-se baixa (100 ng /ml) e elevada (300 ng /mL) dose de GDF3 (microarray A B, respectivamente). No microarray C foram investigados os efeitos da GDF3 knockdown na linha celular modelo de CSC.

Para a avaliação dos dados de microarranjos, somente pontos com um valor de p ≤0.05, dobra mudança ≥1.5 e com anotação Oficial gene foram incluídos (Tabela 3). Isto reduziu a quantidade de genes expressos diferencialmente a 390 e 421 devido à estimulação com dose baixa e elevada de GDF3. O número de transcritos regulados positivamente correlacionada com a força de Smad2 /3 sinalização induzida pelo ligando (s) aplicado (comparar Figura 1E). As alterações de transcrição mais proeminentes com 2075 genes diferencialmente regulados foram observadas como resultado de GDF3 knockdown. Enquanto devido a GDF3 tratamento mais genes foram regulados positivamente do que reprimidos (microarrays A B, Tabela 3), o padrão oposto é exibida como resultado de GDF3 knockdown (microarray C, Tabela 3)

GDF3 atos em. uma dose-dependente maneira

para abordar o papel biológico de GDF3, genes regulados devido à estimulação GDF3 e knockdown (Tabela 3) foram categorizados com base na sua função biológica. Para este efeito, regulada genes com nomes oficiais do gene foram extraídos de cada microarray e uma análise sobre-representação foi realizada por banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID) v6.7 [25]. Este procedimento permite avaliar se um grupo funcionalmente definido em particular de genes é representado mais do que o esperado por acaso dentro de uma lista de genes [32]. Os genes regulados por GDF3 foram classificados de categorias principais, tais como processos de desenvolvimento, mesoderme e ectoderme desenvolvimento, neurogénese e a transdução de sinal (Tabela S1 e Tabela 4). Entre 15,3% e 18,2% dos genes regulados em microarrays de A e C, respectivamente, foram associados com processos de desenvolvimento. Regulação de genes com função no desenvolvimento ectoderma e neurogênese foi observada em microarrays A (6,5% e 6,5%) e C (6,5% e 5,8%), mas não B. Além disso, entre os genes regulados por GDF3 knockdown 5,3% foram associados com desenvolvimento mesoderme. Aprox. 25% de todos os genes no microarrays foram classificados para a transdução de sinal. análise Overrepresetation revelou também que um pequeno, mas significativo número (p≤0,05) de genes relacionados à angiogênese em microarray C (0,9%) (Tabela S1) é regulada por Smad2 sinalização /3.

A estimulação de células NCCIT com diferentes concentrações de GDF3 e GDF3 knockdown diferencialmente afectada Smad2 /3 força de sinalização (Figura 1E). Para comparar esses efeitos, analisou-se a sobreposição quantitativa das alterações de transcrição em células estimuladas assim como os subconjuntos de genes regulados exclusivamente por cada condição experimental (Figura 3). As listas de genes extraídos foram subsequentemente sujeitos a sobre-representação da análise. 48 genes eram comumente regulados em todas as três condições. No entanto, apenas nove deles foram significativamente enriquecido de acordo com a sua função biológica para a categoria de transdução de sinal mediada por receptores da superfície celular. Dos genes 2075 e 421 diferencialmente regulados por GDF3 knockdown ou alta concentração de GDF3, respectivamente (A C), 129 transcrições foram reguladas em ambas as condições. Estes foram predominantemente enriquecido em categorias relacionadas com o desenvolvimento e linhagem compromisso: processos de desenvolvimento, o desenvolvimento ectoderma e neurogênese. No entanto, quando os genes normalmente regulados foram excluídos do conjunto de genes e genes regulados exclusivamente apenas pelo aumento (microarray A) ou interrompido sinalização (microarray C) Smad2 /3 foram analisadas, não foram observadas grandes diferenças no impacto sobre vários processos biológicos. Enquanto a dose elevada de GDF3 única impactado processos relacionados com a sinalização (receptor da superfície da célula mediada por transdução de sinal, a comunicação celular, a sinalização mediada pelo ligando, a transdução do sinal) e neurogénese, os GDF3 knockdown afectada mais conjuntos de genes designados não só para sinalização processos de desenvolvimento e desenvolvimento de ectoderma, mesoderme, mas também o desenvolvimento e a hematopoiese.

Venn diagrama que ilustra a sobreposição entre microarrays a, B e C. Apenas as sondas em microarrays com p-valor ≤0.05 e dobre mudança ≥1.5 foram utilizados neste análise. Subconjuntos de genes indicados nos títulos das caixas com códigos de cores foram submetidos à análise sobre-representação de ontologias gene e uma selecção de processos biológicos predominantemente enriquecidos está listado (lista completa pode ser encontrada na Tabela S1). Os processos biológicos também listados na Tabela 4 são impressas a negrito. A – estimulação com 300 ng /mL rhGDF3, B – estimulação com 100 ng /mL rhGDF3, C -. Knockdown GDF3

O mesmo procedimento foi empregado para analisar a função dos genes modulados pela alta e baixa doses de GDF3 (Figura 4A). 89 genes foram regulados em ambas as condições, mas a avaliação da ontologia gene atributos dentro deste grupo entregue há resultados estatisticamente significativos (p≤0,05). Notamos diferenças claras nos processos biológicos regulados por diferentes concentrações de GDF3. concentração alta GDF3 impactado transcrição de vários genes associados com o desenvolvimento de ectoderma, neurogénese e transdução de sinal, enquanto que 100 ng /mL de GDF3 modulado único processo de transdução de sinal. O mapa de calor de mudanças dobra destaca vários grupos de genes potencialmente regulados diferencialmente (Figura 4B) por concentração alta e baixa de GDF3.

A. Venn diagrama que ilustra análise cruzada de genes comumente regulados devido a 300 ng /mL rhGDF3 (Microarray A) e 100 ng /mL rhGDF3 (Microarray B) estimulação das células NCCIT. Somente genes com valor-p ≤0.05 e dobre mudança ≥1.5 foram incluídos. mapa B. Calor de mudanças vezes de genes regulados por dose elevada e baixa de GDF3 (Microarray A B). Genes com mudança dobra ≥1.5 e p-valor ≤0.05 em pelo menos um dos microarrays foram incluídos. As barras pretas indicam as alterações dobra 1,5 ou p-valor 0,05. A mudança vezes é um código de cores de verde para vermelho (ver barra de escala).

As três condições aplicadas para dissecar o impacto da GDF3 em células NCCIT compreendendo (A) alta dose de GDF3 para ativar maximamente Smad2 /3 via, (B) uma dose baixa de GDF3 para moderada Smad2 /3 sinalização e (C) uma ruptura da sinalização por GDF3 GDF3 knockdown gerado níveis diferentes de força de sinalização GDF3. Os nossos resultados indicam que a modulação de sinalização de Smad2 /3 por estimulação GDF3 ou perturbação de GDF3 via de sinalização afecta vários processos biológicos, tais como processos de desenvolvimento, desenvolvimento de ectoderma, neurogénese e a transdução do sinal no nível transcricional. Além disso, o knockdown GDF3 estável levou à indução de genes associados com o desenvolvimento e mesoderme da hematopoiese em células NCCIT. Além disso, GDF3 modulado do transcriptoma de células NCCIT de uma forma dependente da dose. Mesmo uma dose baixa de GDF3 (microarray B) alterou significativamente o transcriptoma das células alvo. No entanto, ao contrário de uma alta dose de GDF3, uma dose baixa não teve qualquer impacto sobre a regulação de genes associados com o desenvolvimento.

GDF3 induz a expressão de vários genes associados com a transdução de sinal e desenvolvimento

para confirmar os resultados de microarray, optamos por vários genes relacionados à transdução de sinal e processos de desenvolvimento e validado sua expressão após estimulação GDF3 por qPCR. A compilação de microarray e qPCR resultados são apresentados na Tabela 5, que resume a validação da experiência microarray.

Escolha de candidatos para genes alvo GDF3 nós nos concentramos principalmente em membros da família e dos factores de transcrição TGFB, que pode atuar como interruptores nas decisões de destino celular.

A expressão de

LEFTY2

, um conhecido Smad2 /3-alvo em células-tronco embrionárias [33], foi fortemente regulada pela baixa e alta dose de GDF3 (Figura 5A) e serviu como um controlo positivo para a estimulação.

a-L. Efeito da estimulação com diferentes concentrações GDF3 sobre a transcrição de vários genes regulados em micromatrizes A B. N = H. 5. Efeito de knockdown GDF3 sobre a transcrição de vários genes regulados em E. microarray n = 3. A expressão foi medida por qPCR, os resultados são apresentados como o

relação de GAPDH e normalizados para

células não estimuladas (A-G) ou as células transduzidas com vector mexidos-(H). Os valores de p menor do que ou igual a 0,05 foram considerados significativos. (*) Indica p £ 0,05 e p≤0.01 (**).