Abstract

Fundo

Durante o crescimento e sobrevivência de ablação da próstata células cancerosas andrógeno ‘tornar-se independente dos mecanismos reguladores normais. Estas células independentes de androgénios adquirir a notável capacidade de se adaptar ao microambiente em torno cuja factores, tais como neurotransmissores, influenciar a sua sobrevivência. Embora os resultados estão se tornando evidentes sobre a expressão de alfa

1A-adrenérgicos em células epiteliais de câncer de próstata, seu papel funcional exata em células andrógeno-independente ainda não foi estabelecida. Trabalhos anteriores demonstraram que jangadas lipídicas membrana associados com proteínas-chave de sinalização medeiam o crescimento e vias de sobrevivência sinalização em células de câncer de próstata.

Metodologia /Principais Achados

A fim de analisar a topologia membrana da α

1A-adrenoceptor, explorada a sua presença através de uma abordagem bioquímica em fracções de membranas resistentes a detergente purificado da linha celular de cancro de próstata independente de androgénios DU145. observações de microscopia electrónica demonstraram a colocalisation do α

1A-adrenoceptores com caveolin-1, o principal componente proteico de caveolae. Além disso, mostrámos que a estimulação agonista da α

1A-adrenoceptores induzida resistência à apoptose induzida por tapsigargina e que caveolin-1 era necessária para este processo. Além disso, revelou immunohistofluorescence a relação entre níveis elevados de α

1A-adrenoceptor e um caveolin-expressão com cancro da próstata avançado estágio. Mostramos também por immunoblotting que a resistência a apoptose induzida por TG descrita em células DU145 é mediada por quinases reguladas por sinais extracelulares (ERK).

Conclusões /Significado

Em conclusão, propomos que α

estimulação 1A-adrenérgico em células de câncer de próstata andrógeno-independente

via

cavéolas constitui um dos mecanismos que contribuem para a sua protecção contra a apoptose induzida por TG em

Citation:. Katsogiannou M, Boustany CE , Gackiere F, P Delcourt, Athias A, Mariot P, et al. (2009) cavéola Contribuir para a resistência a apoptose induzida pela α

1A-adrenérgico em células de câncer de próstata andrógeno-independente. PLoS ONE 4 (9): e7068. doi: 10.1371 /journal.pone.0007068

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de junho de 2009; Aceito: 25 de agosto de 2009; Publicação: 18 de setembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Katsogiannou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Francês de Pesquisa e da Universidade de Lille 1, INSERM e na região Nord-Pas de Calais, bem como o Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité du Nord) e da Association pour la Recherche sur le Câncer (ARC) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é uma das formas mais comuns de câncer em homens e a segunda causa de morte por câncer em países industrializados [1]. Vários factores, tais como androgénios e factores de crescimento regular a proliferação de células epiteliais e apoptose no cancro da próstata e numa fase inicial de próstata normal (CaP). ablação de androgénios é actualmente a terapia levando usado para bloquear o crescimento de células cancerígenas dependentes de androgénio. No entanto a proliferação e sobrevivência de células APC »muitas vezes tornar-se independente dos mecanismos reguladores que conduzam a uma doença refractário a hormonas [2] para a qual não existe actualmente qualquer terapia de sucesso. células CaP andrógeno-independente tem a notável capacidade de se adaptar ao microambiente em torno cuja influência sobre os percursos de sobrevivência intracelular permanece sujeita a debate [3]. Com efeito, as células PAC estão em contacto com vários factores, tais como hormonas, factores de crescimento e neurotransmissores que são pensados ​​para influenciar a fisiologia dessas células. Entre outros, o interesse tem sido demonstrado para a catecolaminas noradrenalina e adrenalina endógena. Na verdade, o estroma sub-epitelial da próstata é particularmente rica em nervos autonômicos e α

1-adrenoceptores (α

1-AR). O subtipo α

1A-Ar, em particular, é encontrada nas células do músculo liso, mas a sua expressão, também foi descrita em células epiteliais [4], [5]. O α

1A-AR é um membro da superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCR) mediar as acções das catecolaminas anteriormente mencionados numa variedade de células [6].

α

1 antagonistas -ar já são usadas para o tratamento clínico da hiperplasia benigna da próstata (HBP) [7], em que o beneficio terapêutico é atribuída a uma acção directa sobre α

1-AR presente na próstata células do músculo liso [8]. No entanto, vários estudos têm fornecido dados sobre os efeitos adicionais de α

antagonistas 1-AR tais como doxazosina no tratamento de BPH longo prazo. Estes agentes têm sido demonstrados para inibir o crescimento da próstata através da indução de apoptose em células epiteliais e do estroma e estão a emergir como potenciais regimes terapêuticos para a prevenção e tratamento de CaP independente de androgénios [9], [10], [11]. Além disso, estudos anteriores de colegas de trabalho sobre epitelial cancro da próstata humana (HPCE) células e a linha celular de cancro da próstata dependentes de androgénio LNCaP mostraram que a fenilefrina (PHE), um α

agonista 1A-AR, estimula a sua proliferação [12 ], [13]. Apesar destes resultados promissores, o papel funcional da α

1A-AR em células CaP andrógeno-independente ainda não foi estabelecida.

tem sido descrito que a sinalização e tráfico de vários GPCR são regulados pela especializada domínios de membrana de plasma conhecidos como jangadas lipídicas [14]. Além disso, dados recentes em cardiomiócitos mostram que α

1-AR, bem como as moléculas envolvidas na via de transdução de sinal são acumuladas em caveolae, uma subclasse de microdomínios de membranas [15], [16]. Cavéola é invaginações da membrana de plasma em forma de frasco de 50-100 nm, caracterizados por um lado por teores elevados de colesterol e glicoesfingolípidos e por outro lado pela presença de caveolin-1 (CAV-1), a principal proteína de 20-25 constitutiva kDa [17]. Curiosamente, CAV-1 tem sido associado com várias doenças, tais como a aterosclerose e a doença de Alzheimer [18], [19]. Relação ao seu papel no cancro, tem-se estabelecido que a PCA é associado com o aumento da expressão CAV-1 [20]. Na realidade, esta proteína tem sido identificada como um marcador associado com a progressão da doença e CaP refractário a hormonas, que joga um papel determinante na andrógeno-independência de células CaP [21]. Por sua associação com receptores e enzimas específicos na membrana plasmática, CAV-1 pode ser um mediador direto de sobrevivência, crescimento e sinais de metástases em células CaP [22].

Até o momento, não se sabe muito sobre a mecanismos subjacentes neurotransmissores envolvimento na sobrevivência das células APC, deixe-alone o papel de α

1A-AR nas células epiteliais andrógeno-independente e progressão CaP. A este respeito, é tentador para conectar-se a presença de α

1A-AR e CAV-1 e levantar a hipótese de que o α

1A-AR poderia mediar

via

cavéolas seus efeitos funcionais sobre o crescimento ou sobrevivência de células estágio CaP avançados.

o objetivo do nosso trabalho foi, portanto, para explorar o papel da α

1A-AR em células CaP andrógeno-independente. Aqui, nós investigamos a presença de α

1A-AR em cavéolas de células DU145, uma linha de células CaP independente de androgénios derivado de metástases cerebrais. Analisamos a consequência de α

estimulação 1A-AR por PHE na distribuição do receptor da membrana e CAV-1, bem como o seu efeito sobre a composição lipídica das fracções tipo membrana purificadas a partir de células DU145. Além disso, descreve-se o efeito de PHE na resistência a apoptose destas células através da activação de ERK e os nossos resultados implicam fortemente o envolvimento de caveolae nesta via de sinalização. Finalmente, por immunohistofluorescence e RT-PCR, observa-se uma correlação positiva de α

1A-AR e CAV-1 e expressão CaP fase avançada. A presença de α

cavéolas 1A-rico-AR pode, portanto, contribuir para a resistência à apoptose generalizada caracterizando tecido prostático independente de andrógeno.

Métodos

cultura celular

A a linha de células de cancro humano da próstata independente de androgénios DU145, obtida a partir da American Type Culture Collection, foi mantida em cultura em meio RPMI 1640 (Life Technologies, Inc.) suplementado com 10% (v /v) FCS (Seromed, poli-Labo, Estrasburgo , França), 5 mM de L-glutamina 2 mM e canamicina (Sigma). As células foram rotineiramente cultivadas em frascos de 50 ml (Nunc, PolyLabo, Estrasburgo, França) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2-95% de ar. Estas células constituem um modelo adequado para cérebro metastático células cancerosas presentes no câncer de próstata hormônio-refratário.

transfecções celulares e geração de cav-1 knock-down linha de células DU145

Dois pronto-a- usar ARNsi contra α

1A-AR (siADR1A, Eurogentec) foram transfectadas transientemente (50 nM) com HiPerfect Transfection Reagent (Qiagen) em células DU145. Controle siRNA (siCTL) experimentos foram realizados por transfecção siRNA contra luciferase

siLuciferase (siCTL):. 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 ‘. siADR1A-1 (mistura de): 5’-CAGGAAAGAUGCAGAGGA-3 ‘e 5′-UUCCUCUGCAUCUUUCCU-3’. siADR1A-2 (mistura de):. 5′-GCGUCUACGUGGUGGCCA-3 ‘e 5′-UUGGCCACCACGUAGACG-3’

linhas celulares estáveis ​​foram obtidas por transfecção de células DU145 com um vector que codifica ARN pSUPER curto hairpin (shRNA) contra CAV-1 (sequência: CTGGAATAAGTTCAAATTCTT 2121 3’UTR) (DUshcav-1) (ou vector pSUPER vazio para linha celular de controlo, DUshCTL) usando Nucleofector, tal como recomendado pelo fabricante (Amaxa GmbH, Colónia, Alemanha). Nós transfectadas 2 × 10

6 células DU145 tratados com tripsina com 3 ug de vector e, em seguida, utilizado as células transfectadas para semear uma placa de 24 poços (Nunc) a muito baixa densidade. Os clones foram seleccionados underexpressing CAV-1 em função da sua resistência a antibióticos para puromycine e validado por Western Blot.

Anticorpos e Reagentes

os anticorpos primários utilizados para imunofluorescência (IF) e microscopia de imunotransferência (IB ) foram: (1:100) de coelho anti-α

1A adrenoceptor (Santa Cruz Biotechnology), (1:100) de coelho anti-caveolin-1 (Santa Cruz Biotechnology), (1:50) de rato anti-caveolin- 1 (Laboratórios de transdução BD), (1:400) de ratinho anti-β-actina (Sigma), (1:200) anti-calnexina (Chemicon, Millipore, Paris, França), (1:1000) de ratinho anti-citoqueratina 18 (Chemicon, Millipore, Paris, França), (1:1000) de coelho anti-PARP (Cell Signaling), (1:100) de ratinho anti-Bax (6A7) (Santa Cruz Biotechnology) que reconhece um epitopo exposto de Bax no activada conformação, (1:1000) de coelho anti-procaspase 3 (Upstate), (1:1000) anti-fosfo-p44 /42 MAP quinase e (1:1000) anti-p44 /42 MAP Kinase (Cell Signaling). Os anticorpos secundários utilizados para IB foram: (1:10000) peroxidase de rábano ligada ao anti-ratinho ou anti-coelho (Chemicon). Para IF, foi utilizado (1:1000) Alexa Fluor® 488-rotulados e anticorpos secundários (1:2000) 546-rotulados (Molecular Probes).

As células foram tratadas com 10 mM L-fenilefrina cloridrato (PHE ), de 1 uM a prazosina (PRA) e 10 uM PD98059 durante três dias (renovadas a cada 24 h) e 10 uM tapsigargina (TG) durante 48 horas em meio RPMI. PHE tratamentos de curto prazo foram realizadas numa solução contendo (mM): NaCl, 116; KCl, 5,6; CaCl

2, 1,8; MgCl

2, 1,2; NaHCO

3, 5; NaH

2 PO?

4, 1; HEPES, 20; pH 7,3. Todos os produtos químicos foram fornecidos pela Sigma excepto TG (Alomone) e PD98059 (Calbiochem).

ciclo celular análise

As células foram cultivadas em três pratos de 60 mm por condição e as drogas foram aplicadas como descrito acima. Após os tratamentos, as células foram tripsinizadas, recolhidas e ressuspensas em 0,2 ml de PBS estéril. 1 ml de etanol frio a 70% foi adicionado para suspensões celulares durante a vórtex. As amostras foram centrifugadas, lavadas em PBS estéril e depois incubadas com ribonuclease (2 ug /ml) durante 15 min. iodeto de propídio (25 ug /mL de concentração final em PBS-Triton X-100 a 0,1%) foi então adicionado e deixado a incubar durante mais 30 min. teor de ADN foi medido pelo iodeto de propídio excitante a 488 nm e medindo a emissão a 520 nm (FL3) utilizando um citómetro de fluxo (Beckman Coulter Epics XL4-MCL com Expo32 aquisição). As experiências foram repetidas quatro vezes.

Western Blot

O meio de cultura de células foi descartado e os frascos foram lavados com PBS gelado. As proteínas celulares foram, em seguida, extraiu-se usando tampão RIPA [1% (v /v) de Triton X-100, 1% (w /v) de Na desoxicolato, 150 mM de NaCl e 20 mM de fosfato de sódio ou de potássio, pH 7,2] com EDTA 5 mM e cocktail anti-proteases (P8340, Sigma) durante 30 min em gelo. Depois de raspar, qualquer material insolúvel foi removido por centrifugação a 30000 ×

g

durante 10 min a 4 ° C e a quantidade de proteína foi determinada pelo método BCA (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, E.U.A.). Quantidades iguais de proteínas foram submetidas a SDS /PAGE (16% de gel). Finalmente, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose utilizando um semi-seco electro-blotter (Bio-Rad). Após 1 h de saturação em 5% de leite não gordo (ou 5% de BSA (albumina de soro de bovino) apenas para anti-fosfo-p44 /42 MAPK), as membranas foram incubadas durante a noite com anticorpos primários diluídos (ver “Anticorpos e Reagentes”). As membranas foram então lavadas (3 x 10 min) com um tampão TNT (15 mM Tris /HCl, pH 8, NaCl 140 mM e 0,05% de Tween 20) e tratou-se com os anticorpos secundários ligados a peroxidase correspondente de rábano (anti-ratinho ou anti-coelho, Pierce), (1:10000) diluída em TNT /leite (ou TNT /BSA) durante 1 h à temperatura ambiente. Após várias lavagens em tampão TNT, as membranas foram processadas para detecção de quimioluminescência usando o substrato quimioluminescente Super Signal Oeste Dura (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. As membranas foram finalmente expostos a filmes X-Omat AR (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, E.U.A.). A intensidade dos sinais foi avaliada por densitometria e semi-quantificados utilizando o rácio para cada amostra entre a intensidade da proteína de interesse dividida pela intensidade da actina ou calnexina. Cada experiência foi repetida pelo menos duas vezes.

Isolamento de membranas resistentes detergente (DRM) e Dot blot

As células foram lavadas, desfeito, centrifugada e o sobrenadante foi removido. A pelete foi ressuspensa com tampão de isolamento B (de acordo com a folha de Axis-Shield S33 Aplicação) e homogeneizado com um homogeneizador Dounce (Kontes) de 15 um apuramento pilão em seguida, centrifugada durante 10 min a 1000 ×

g

. O sobrenadante correspondente ao lípido extrato bruto de balsa foi isolado e foi adicionado 0,2% de Triton X-100. Um descontínua 5-passo Optiprep® (Axis-Shield PoC AS) gradiente foi formado com tampão D (tampão B + 1% de Triton X-100) (w /v), a fim de obter 1,66 ml de 35%; 2,5 ml de 20%; 2,5 ml de 15%; 2,5 ml de 10%; 0,83 mL de 5%. Extrato bruto de jangada lipídica foi feita densa com sacarose (230 mg para 0,5 ml de lisado) e colocado na interface entre a gradientes de 35% e 20%. Ultracentrifugação a 165400 ×

g Compra de 4 h a 4 ° C em 50 rotor Ti (Beckman Coulter) foi seguido pela coleta de baixo para cima de 1,1 ml frações. 1,1 ml de 20% (v /v) de TCA (ácido tricloroacético) foi adicionado a cada fracção, a fim de precipitar as proteínas. Tubos mantidos em gelo durante 20 min foram centrifugadas a 10000 ×

g

a 4 ° C durante 10 min. O precipitado foi lavado com metanol, centrifugado em seguida, re-suspenso em 4% (v /v) de SDS. Uma vez que as amostras não foram altamente concentrada em proteínas e detecção por Western blot clássica foi difícil de obter, as amostras foram carregadas na membrana de nitrocelulose num poço de 96 unidade de dot-blot de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad). Resumidamente, os dez fracções foram manchados em membrana de nitrocelulose em série. Quando seca, a membrana foi incubada em solução de bloqueio durante 1 h (TNT /leite), em seguida, hibridados com os anticorpos desejados seguinte procedimento IB clássicos, como descritos acima (ver “Western Blot”). Precauções foram tomadas em conformidade mantendo constante alguns factores importantes para as condições tratadas e não-tratadas. A densidade de células usadas para as experiências manteve-se constante quando a extracção com detergente e frio foi levada a cabo tanto a concentração do detergente e o rácio de concentração em número de células /detergente eram os mesmos. Cada poço foi carregado com 25 ul de cada fracção. Este método padronizado foi repetido pelo menos três vezes e foi usado para avaliar as alterações na partição de uma molécula-alvo em DRM, evitando falsas estimativas quando baseadas nas quantidades relativas em relação a todas as outras moléculas presentes.

Quantificação de fosfatidilcolina (PC), e esf ingomielina (SM)

os lípidos foram extraídos de acordo com o método de Folch et ai. [23]. Dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC Sigma), dimyristoylphosphatidylserine (DMPS Avanti Polar Lipids), lauroylsphingomyelin (LSM Avanti Polar Lipids) foram usadas como padrões internos. Phospholipid análise foi realizada num Hypersil Si 2 × 200 coluna mm (Agilent Technologies, Massy, ​​França) seguindo o protocolo [24]. Positiva ESI-MS foi realizada num MSD 1100 Espectrómetro de Massa (Agilent Technologies). A tensão orifício foi fixada em 120 V, a tensão capilar em 3,5 kV, o gás de secagem (azoto) fluir a 8 l /min e faixa de varredura de m /z 400 a 950. pico Integrated foram a partir extraídos Ion Cromatogramas (EIC) para m /z = 700-950 no tempo de retenção (TR) de PC, PS, SM foram divididos pelo EIC para m /z = 679 no RT de DMPC, m /z = 681 no RT de DMPS ou m /z = 647 no RT de LSM. Os níveis foram determinados por comparação desta relação com uma curva padrão de quantidades conhecidas de fosfatidilcolina e esfingomielina.

A quantificação de colesterol

A extracção e saponif icação foram realizadas de acordo com o procedimento previamente descrito [25] com algumas modificações. A quantificação do colesterol foi realizada utilizando um cromatógrafo de gás HP6890 equipado com um injector HP7683 e um Detector Selectivo de Massa HP5973 (Agilent Technologies). A cromatografia foi realizada utilizando um HP-5MS fundido coluna capilar de sílica (30 m × 0,25 mm de diâmetro interno, espessura de filme 0,25 um, Agilent Technologies). Um programa de monitoramento de íons selecionados foi usado para a espectrometria de massa. Os iões utilizados para análise (m /z) foram como se segue: epicoprostanol, 370; colesterol, 368. As curvas de calibração foram obtidas através da análise de padrões preparados a partir de padrões autênticos (Steraloids) e extraída com o método utilizado para as amostras.

Os protocolos de quantificação acima para lípidos e colesterol foram repetidos três vezes durante três experiências individuais não-tratados (controlo) e células tratadas com DU145 PHE durante 10 min. À medida que as quantidades de lípidos e o colesterol quantificado em cada fracção (ng /mL ou ng /ml) varia ligeiramente entre experiências, os resultados foram normalizados por determinação de valores médios para as três experiências representados pela percentagem de lipidos e de colesterol, em cada fracção, em condições de controle em comparação com as condições tratadas com PHE.

Plasma Membrane “Rip Off”

Este método foi baseado em um protocolo publicado [26]. As células foram cultivadas em lamelas de vidro. grelhas de cobre revestidas Formvar®-(de acordo com [27]) foram revestidas com polilisina. Lamelas foram colocadas lado célula para baixo para as grades e uma leve pressão foi exercida usando uma rolha de borracha, em seguida, lamelas foram virados e as grades foram cuidadosamente SOLTAR então fixado em 8% (v /v) PFA (paraformaldeído). Após lavagem em PBS e a saturação em PBS /2,5 mM, glicina /burro imunomarcação soro foi levada a cabo de acordo com técnicas padrão, utilizando anticorpos primários seguido de conjugados de ouro species-specific anti-IgG de 6 nm, 12 nm e 18 nm. Finalmente, as redes foram contrastadas e preparados para observação em um microscópio eletrônico de transmissão Hitachi H-600 (ampliação × 20000) a 75 kV.

ultra-estrutural Microscopia

Para a microscopia eletrônica de transmissão, as células foram fixadas em glutaraldeído a 2,5% preparada em 0,1 M de cacodilato de tampão e pós-fixadas em tetróxido de ósmio a 1% no mesmo tampão. Após a desidratação acetonitrilo, o sedimento foi incorporado em Epon. lâminas delgadas em série (90 nm) foram cortadas usando um ultramicrotome Reichert Ultracut E e recolhidos em 150 hexagonal malha grades de cobre barrados. Após a coloração com acetato de uranilo a 2% preparada em 50% de etanol e a incubação com uma solução de citrato de chumbo, as secções foram observadas num microscópio electrónico de transmissão Hitachi H-600.

Imunofluorescência Indirecta

espécimes ressecção BPH a partir de próstata humana congelados em isopentano arrefecido com azoto líquido e mantido em “Tissue-Tek®” a -80 ° C antes de 10 uM secções foram preparados a -20 ° C com um crióstato, montadas em lâminas de vidro e procedeu-se se o estudo. tecidos da próstata normais e cancerosas foram fornecidos por lâminas de tecido de matriz (SuperBioChips Laboratories), desparafinados de acordo com as indicações do fabricante (Cliniscience) antes da preparação de If de acordo com [28]. Resumidamente, todas as lâminas foram bloqueadas durante 30 min com PBS /1,2% (v /v) de gelatina, em seguida, incubadas com anticorpos primários desejadas durante 1 h a 37 ° C, em seguida, anticorpos secundários (1 h, 37 ° C). Imagiologia foi realizada utilizando Zeiss LSM 510 cabeça confocal (Carl Zeiss) conectado a um Zeiss Axiovert 200 M microscópio com uma lente objetiva de 40 × de imersão em óleo (abertura numérica 1,45). As lâminas foram digitalizados usando um laser de íon argônio e um laser de íons de hélio /néon. Todos os parâmetros de varrimento foram mantidos constantes ao longo dos diferentes experimentos. AIM 3.2 software microscópio confocal (Carl Zeiss) foi usado para a aquisição e análise de dados.

RT-PCR

transcrição reversa-PCR foi realizada como previamente descrito [29]. Os 178 pb α

1A-AR isoforma um fragmento amplificado foi amplificado com 5′-AGACCAATCCTCCTGTACCAC-3 ‘(directo) e 5′-CTCTGCATCTTTCATGTCCTAG-3′ (inverso). A 220 pb CAV-1 amplicão foi amplificado com 5’-AGTGCTCCTGTTCTCCCTTC-3 ‘(directo) e 5′-CTTGTCGATGGCTTCCTTCAC-3′ (inverso) (Eurogentec). O controle interno GAPDH amplicon 236 pb foi amplificado com 5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3 ‘(para a frente) e 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′ (reverso). A 241 pb citoqueratina 18 amplicão foi amplificado com 5’-TGAGTCAGAGCTGGCACAGA-3 ‘(directo) e 5′-TGGTGTCATTGGTCTCAGACA-3′ (inverso). Finalmente, a 210 pb a citoqueratina 14 amplicão foi amplificado com 5’-TGCGAGATGGAGCAGCAGAA-3 ‘(directo) e 5′-TGCCATCGTGCACATCCATGA-3’ (inverso). a

1A-AR,-1 cav, citoqueratina 14 e 18 de mRNA expressões foram validados pela análise de densidade gel usando mRNA GAPDH como controle interno.

amostras de tecidos humanos

biópsias BPH Humano foram obtidos a partir consentindo pacientes seguindo as considerações éticas locais. Todos os experimentos envolvendo tecidos do paciente foram realizadas em número de aprovação ‘CP 01/33’, emitido pela «Comitê Consultivo de protection des Personnes dans la Recherche Biomédicale de Lille ‘.

A análise estatística

os resultados foram expressos como a média ± SEM. A análise estatística foi realizada utilizando não pareado

t

testes (para comparação de dois grupos) ou análise de testes de variância seguido de Dunnett (para controle de múltiplos

contra

comparações de teste). As diferenças foram consideradas significativas quando

p Art 0,05 (*),

p Art 0,01 (**) e

p Art 0,001 (***).

Resultados

α

1A-AR está associada com CAV-1 na superfície celular DU145

estudos anteriores descreveram uma interação direta de α

1A -AR com CAV-1 [15]. Além disso, α

sinalização 1A-AR é conhecido para localizar em caveolae [14], [30]. Para explorar a topologia de membrana de α

1A-AR, foi utilizado o “rasgão” técnica desenvolvida em células aderentes que permitem o isolamento e a observação por microscopia electrónica de grandes áreas da membrana do plasma [26]. α

1A-AR immunogold coloração (6 pontos nm, seta preta) colocaliza com CAV-1 (18 pontos nm, seta branca) em microdomínios da membrana plasmática de cerca de 50-100 nm (Figura 1).

membranas plasmáticas foram “rasgado-” tal como descrito na secção de “Métodos” e incubadas com anti-CAV-1 e anti-α

anticorpos 1A-AR. anticorpos secundários acoplados com 6 nm e 18 nm de partículas de ouro foram utilizadas contra o anti-α

1A-AR (seta preta) e anti-CAV-1 (seta branca), respectivamente. Grades foram então processados ​​para observação microscopia eletrônica. Co-localização de ambas as proteínas é indicada por círculos. Bar, 200 nm.

Plasma proteína da membrana de redistribuição e de composição lipídica alterações em frações DRM induzidas por fenilefrina

Análise de microdomínios de membrana do plasma, cavéolas ou composição jangada lipídica normalmente começa com a solubilização detergente de células inteiras, seguido de centrifugação e recuperação de DRM de fracções leves de gradiente em gradiente de densidade. Nós investigamos a associação de α

1A-AR com DRM purificada a partir de extractos de membrana de células inteiras DU145 em um gradiente de densidade OptiPrep®. Para a caracterização das fracções DRM, a presença de uma membrana plasmática marcador pan caderina específico foi avaliada pela primeira vez como um controlo positivo (Figura 2A, a). A sua presença em todas as 10 fracções purificadas demonstra que as fracções de DRM isolados correspondem a regiões da membrana do plasma. Além disso, a proteína nuclear PCNA (antigénio nuclear de proliferação celular) e a Bax proteína mitocondrial foram utilizados como controlos negativos, como são conhecidos não se associar com membrana plasmática. A sua ausência em fracções DRM valida a ausência de contaminação por membranas intracelulares (Figura 2A, a).

(A) de DRM fracções de densidade crescente (a partir de fracção de 1 a 10), obtido como indicado na secção “Métodos” e analisados ​​por Dot blot. (A), Pan-caderina foi usada como um controlo positivo, confirmando que as fracções obtidas correspondem à membrana plasmática. PCNA (antigénio nuclear de proliferação celular) e Bax foram utilizados como controlos negativos, a sua ausência confirmando a não contaminação de fracções DRM por proteínas intracelulares não se sabe estarem associadas com jangadas. (B) Dot Blot da recolha de fracções de DRM em condições de controlo (CTL) e 10 min de tratamento com 10 uM de fenilefrina (PHE). P2Y2 receptor purinérgico foi utilizado como um controlo negativo para a especificidade do efeito de fenilefrina na redistribuição de proteína em fracções. retângulo preto marca a mudança de α

1A-AR, CAV-1 e proteína Gu

q11 a frações de densidade mais leves. a composição (B) Lipid das 10 fracções foi quantificada tal como descrito na secção de “Métodos” no controle (coluna preta) e PHE células tratadas (colunas cinzentas) para (a) de lisofosfatidileolino (LPC), (b), a fosfatidilcolina (PC), (c) esf ingomielina (SM), (d) o colesterol. As barras de erro representam SEM calculado a partir de três experiências independentes. A análise estatística usou o

t

teste; *,

p Art 0,05, **,

p Art 0,01 e ***,

p

. 0,001

a fim de determinar se microdomínios anteriormente definidos estão envolvidos na α

via de sinalização 1A-AR nas células DU145, examinámos α

estimulação 1A-AR pelo seu agonista específico fenilefrina (PHE). Dot análise de mancha de frações DRM revelou distribuição de cav-1 em gradiente de densidade baixa (5% -20%) fracções 1-6 e α

1A-AR em frações 1 e 3-6 no controle (CTL) condições. Após 10 minutos de tratamento por PHE distribuição 10 uM CAV-1 foi observada em gradiente de densidade baixa (5% -10%) fracções 1-5 e α

1A-AR foi agora detectado em todas as fracções 1-6 (incluindo baixa densidade fracção 2) (Figura 2A, b, painel superior CTL; painel inferior PHE). Importante, Gu conteúdos

Q11 (um α

1A-AR efetoras) mostrou uma mudança de fracções 4-5 de fracções 1 a 5 após o tratamento PHE e permanecem presentes em frações de maior densidade, sugerindo que a ativação do receptor não envolve todas as proteínas Gu

Q11 presentes a nível de membrana. Também se avaliou o receptor purinérgico P2Y2 utilizado como um controlo negativo para a especificidade da alteração na distribuição da proteína induzida por PHE. α

1A-AR e P2Y2 são ambos GPCR partilha vias de sinalização semelhantes. P2Y2 situa-se nas mesmas fracções se as células DU145 foram tratados ou não (Figura 2A, b, CTL e PHE), portanto demonstrando a especificidade da distribuição de proteína modificada induzida por PHE anteriormente observado.

Além disso, nós interessado na composição de lípidos de fracções purificadas de DRM. Os lípidos conhecidos para ser enriquecido em jangadas lipídicas biológicos, tais como a lisofosfatidilcolina (LPC), esfingomielina (SM), fosfatidilcolina (PC) e o colesterol [31], [32], foram analisados. Mais uma vez, investigou-possíveis alterações da composição lipídica das fracções DRM após estimulação PHE. As nossas observações mostram um aumento significativo nas quantidades destes lípidos, principalmente em gradiente de densidade baixa (5% -10%) fracções de 1-5, como resultado da estimulação PHE (Figura 2B, a, b, c, d). Estes resultados estão de acordo com o fato bem estabelecido que o teor de lípidos alta provoca flutuante de microdomínios lipídicos em frações de baixa densidade durante a centrifugação. dados publicados anteriormente sobre os sistemas de modelo de lípidos mostram que o tamanho de jangadas lipídicas depende da composição da membrana lipídica [33], [34]. As alterações observadas em composições de lípidos devido a reorganização de membrana pode ser responsável por microdomínios densidade mais leves, resultando na redistribuição de α

1A-AR, cav-1 e Gαq

11 observados em frações de DRM.

Protein e reorganização lipídica induzida por fenilefrina está associada com CAV-1-rico agrupamento membrana

Pensa-se que após estímulo extracelular, a membrana plasmática está preparado para a formação de domínios mais estabilizados e aglomerados com tamanho molecular e tempo de vida melhorada tais como caveolae [35], [36]. A fim de compreender o envolvimento dos caveolae na α

sinalização 1A-AR, exploramos o efeito da estimulação PHE sobre a morfologia da superfície celular DU145 (Figura 3A). Células tratadas durante 10 minutos com 10 uM PHE apresentam numerosas invaginações de superfície correspondente a caveolae (figura 3a, b), em comparação com células não tratadas (Figura 3A, a). Cavéolas são evidentes como perfis circulares com forma uniforme e 50-80 nm de diâmetro. Neste cavéolas micrografia eletrônica representante estão presentes como poços individuais (Figura 3A, b, setas pretas) e às vezes em arranjos mais complexos interligados com perfis citoplasmáticos caveolar (Figura 3A, B, setas brancas).

(A) micrografia electrónica representativas de células DU145 em (a) condições não tratado (b) após 10 min de tratamento de 10 uM de PHE. Cavéolas e caveolina contendo vesículas de 50-80 nm de diâmetro são densos em electrões são indicados por setas pretas. setas brancas indicam cavéolas forma complexa.