Abstract

A gemcitabina, um agente eficaz no tratamento do câncer de pâncreas, sofreu falhas em muitos casos depois vários ciclos de tratamento devido à emergência de resistência aos medicamentos. A combinação de componentes da dieta com drogas clinicamente validado emergiu como uma abordagem terapêutica eficaz para o tratamento de tumores pancreáticos, refractários à terapia com gemcitabina. A fim de otimizar uma possível combinação sinérgica de gemcitabina (GCB) com moléculas alimentares, ácido Betuilnic (BA) e thymoquinone (TQ), stand-alone IC foi calculado

50 dose de GCB, BA e TQ de linhas celulares de cancro do pâncreas . relação CI

50 dose fixa das moléculas alimentares em combinação com reduzida IC

50 dose de GCB foi testado em GCB resistentes PANC-1 e células sensíveis MIA PaCa-2 de sinergismo, aditivo de resposta e antagonismo, usando CalcuSyn. índice de combinação (IC) revelou que o pré-tratamento de BA e TQ juntamente com GCB sinergicamente inibiu a proliferação de células de cancro em

in vitro

experiências. Piruvato quinase (PK) M2 isoforma, um alvo promissor envolvido no metabolismo da célula cancerosa, mostrou a regulação negativa na presença de TQ ou BA em combinação com GCB. GCB com BA agiu preferencialmente na mitocôndria tumorais e desencadeou transição de permeabilidade mitocondrial. Pré-exposição das linhas celulares, MIA PaCa-2 e PANC-1, a Tq em combinação com GCB induzida apoptose. Assim, a eficácia de BA ou TQ em combinação com GCB para inibir a proliferação celular, induzir a apoptose e regular negativamente a expressão de PKM2, reflecte promessa no tratamento de cancro pancreático

citação:. Pandita A, B Kumar, Manvati S, Vaishnavi S, Singh SK, Bamezai RNK (2014) combinação sinérgica de gemcitabina e dietética Molecule induz a apoptose em células de cancro do pâncreas e para baixo Regula PKM2 Expression. PLoS ONE 9 (9): e107154. doi: 10.1371 /journal.pone.0107154

editor: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de maio de 2014; Aceito: 13 de agosto de 2014; Publicação: 08 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pandita et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as tentativas têm sido madeto melhorar a eficácia de drogas clinicamente validados em regime de combinação para melhorar a sua resposta no sentido de tumores refractários, incluindo o câncer de pâncreas [1]. Ao lado de 5-fluorouracilo, gemcitabina (GCB), um fármaco quimioterapêutico largamente utilizado para o cancro do pâncreas, mostrou falhas após múltiplos ciclos de terapia devido ao aparecimento de resistência a drogas [2], [3]. Tratamento de tumores pancreáticos que são refratários à terapia gemcitabina é um desafio para os oncologistas. Esforços, como em outros tipos de câncer, para direcionar os processos-chave, tais como o metabolismo carcinogênico, divisão celular, diferenciação, apoptose, no desenvolvimento do câncer de pâncreas, tem gerado interesse de fitoquímicos dietéticos destinados a potencial quimioprevenção do câncer. Um link mecanicista entre dieta e câncer pancreático vem de sua inter-relação de longo reconhecida [4]. Um tal agente da dieta, a qual poderia ser utilizado em combinação com GCB para o tratamento de cancro do pâncreas, é o ácido betulínico (BA), um penta-cíclico de triterpenos de ocorrência natural com uma variedade de actividades biológicas, incluindo propriedades antitumorais potentes [5]. BA está contido na casca externa de várias plantas em todo o reino vegetal, incluindo árvores de vidoeiro branco de casca [6], com atividades anti-inflamatórias, anti-virais e anti-neoplásicas [7]. actividade anti-cancro de BA foi relacionado com a sua capacidade para desencadear directamente a permeabilização da membrana mitocondrial, um evento central no processo de apoptose, elevando a esperança de contornar a resistência a agentes quimioterapêuticos convencionais [6]. Thymoquinone (TQ), outro agente potencial anticancerígeno nutracêuticos, é um composto bioativo derivado da semente preta (

Nigella sativa

) de óleo. Na medicina folclore, o consumo de semente TQ tem sido associado com diversos benefícios terapêuticos na asma brônquica, disenteria, dor de cabeça, problemas gastrointestinais, eczema, hipertensão e obesidade [8]. No contexto do cancro, TQ é referido como exibindo efeitos anti-proliferativos em linhas de células derivadas a partir da mama, do cólon, do ovário, da laringe, do pulmão, leucemia mieloblástica e osteossarcoma [9] – [15]; e efeito anti-metástase no câncer humanpancreatic. Tem sido demonstrado para suprimir a migração e a invasão de células PANC-1 de uma forma dose-dependente [16] e infra-regular NF-Kappa B e MMP-9 de expressão. Estudos anteriores também demonstraram a actividade biológica de timoquinona (TQ) em células de cancro do pâncreas e

In vitro

. Isto revelou o seu efeito de sensibilização à quimioterapia após a pré-exposição de células a CP (25? Mol /L) durante 48 horas, seguido de gemcitabina ou oxaliplatina, resultando na inibição do crescimento de 60% a 80%, em comparação com 15% a 25% . de inibição com gemcitabina ou oxaliplatinalone [17]

as células cancerosas, predominantemente dependentes da reprogramação de suas necessidades metabólicas, consomem mais glicose e produzir uma grande quantidade de lactato, mesmo em um ambiente bem oxigenado; o processo denominado como glicólise aeróbica ou “efeito Warburg” [18], [19]. Enquanto as células normais diferenciadas maximizar a produção de ATP pela fosforilação oxidativa mitocondrial de glucose em condições de normóxia, células cancerosas geram muito menos ATP a partir da glucose por glicólise aeróbica. Apesar de ser menos eficiente na produção de ATP, a glicólise é um processo muito mais rápido em células cancerosas [20], [21]. Aqui piruvato cinase (PK) catalisa a última reacção com a transferência de um grupo fosfato de alta energia a partir de fosfo-enolpyruvate (PEP) para ADP, produzindo ATP e piruvato que é reduzido a lactato pela lactato desidrogenase (LDH) no citosol. Piruvato cinase (PK) consiste de quatro isoformas, das quais PKM2 expressa predominantemente em células cancerosas [22]. Estes são: cólon [23], de células renais [24], do pulmão [25] e outros. PKM2 tem sido mostrado que actua como um marcador de: carcinoma de células renais (RCC) [26], [27], o cancro testicular [28], o cancro da mama [29], tumores urológicos [30], carcinoma do pulmão, cancro do colo do útero, e tumores gastrointestinais [31]; e com a possível detecção nas fezes de doentes com cancros gástricos e colorectais [32]. No passado recente, a espectrometria de massa demonstrou ainda uma presença predominante de PKM2 em:. RCC, carcinoma da bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, carcinoma do pulmão, e adenoma folicular [33]

Neste estudo, nós investigamos o efeito da BA ou TQ com GCB, independentemente e em combinação, em células de adenocarcinoma humano, Mia PaCa-2 e PANC-1, para induzir a morte celular. mecanismo subjacente da sua acção, especialmente no que diz respeito à expressão PKM2 e actividade e transição de permeabilidade mitocondrial foi avaliada.

Materiais e Métodos

linhas de células, manutenção e reagentes

pancreático humano linhas celulares de cancro, PANC-1 e MIA PaCa-2 foram adquiridos à American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células foram cultivadas em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. Glutamina, HEPES ou suplementos de piruvato de sódio, foram adicionados para manter o crescimento celular adequado. O ácido betulinico (BA), timoquinona (TQ), gemcitabina (GCB), dimetiltiazol-2-il-2, 5-difenil-tetrazólio-brometo (MTT), rodamina-123 (Rh-123), iodeto de propídio (PI) e outros produtos químicos (Sigma Chemical Co, EUA); juntamente com kit de detecção de apoptose Anexina-V-FITC (Cayman Chemical Company), anticorpos contra: Pro-caspase-3, beta-actina, PKM2, poli-ADP-ribose-polimerase (PARP) (Cell Signaling), foram adquiridos e usados no estudo.

perfil Tratamento e viabilidade celular ensaio

células MIA PaCa-2 PANC-1 e foram cultivadas em frascos T-75. Após 80% de confluência, as células foram tratadas com tripsina e centrifugadas a 100 x g durante 5 min. O sedimento celular foi suspenso em meio DMEM; e 2 × 10

5 células /poço dispensado em Nunclon-placas de 96 poços de fundo plano a aderir durante 24 horas. As células foram expostas a diferentes concentrações de BA, TQ e GCB, isoladamente e em combinações. Em experiências de combinação, as células foram tratadas primeiro e sensibilizados com BA ou TQ durante 24 horas, seguido por exposição a GCB para próximas 24 horas e incubou-se em CO

2 incubadora a 37 ° C. Para o ensaio de viabilidade celular, uma solução de MTT (20 ul de 2,5 mg /ml em DMEM) foi adicionado a cada poço e as placas de cultura agitou-se suavemente, seguindo-se incubação em CO

2 incubadora a 37 ° C durante 3 horas. O sobrenadante foi aspirado e os cristais de MTT-formazon dissolvido em 150 ul de DMSO. As placas foram novamente incubadas a 37 ° C e agitada durante 10 min num agitador de placas. A absorvância de DMSO dissolvido cristais de MTT-formazon foi medida a 570 nm. valores quimio-sensibilidade foram expressos como% da viabilidade celular da concentração da droga que inibiu o crescimento celular de 50%; eo IC

50 valores calculados a partir das relações de concentração-efeito, usando Graph Pad Prism versão 5.00.

Análise dos efeitos de drogas combinadas

sinergia droga foi determinada pela isobolograma e combinação- métodos de índice, derivadas do princípio do efeito mediano de Chou e Talalay [34], usando o software CalcuSyn (Biosoft, Versão 2.1). Os dados obtidos das experiências de inibição do crescimento foi utilizado para realizar estas análises. O método isobolograma é uma representação gráfica da interacção farmacológica; e é formado por selecção de uma morte de células afectadas fraccionada desejado (Fa). Uma linha recta foi desenhada para conectar o Fa pontos plotados contra experimentalmente utilizadas combinações de proporção fixa de drogas (GCB) ea molécula dietética (BA ou TQ) em X e Y eixos para gerar isobologramas. pontos de dados combinação que caíram sobre a linha representou uma interacção medicamentosa aditivo; enquanto que, os pontos de dados que estavam abaixo ou acima da linha representada sinergismo ou antagonismo, respectivamente. A combinação do índice (Cl), um valor numérico, foi calculada pela fórmula [35]: em que: C

A, X e C

B, X, eram as concentrações de droga A anddrug B, usado em combinação para alcançar x efeito% da droga. IC

X, A e IC

X, B foram as concentrações de agentes individuais para alcançar o mesmo efeito.

A combinação-índice (CI) método é uma representação matemática e quantitativa de um dois -droga interacção farmacológica. Usando dados de experimentos de inibição de crescimento e software informático, os valores IC foram gerados ao longo de um intervalo de níveis de Fa 0,05-0,90 (inibição do crescimento de 5% -90%). Um IC de 1 indicou um efeito aditivo entre os dois agentes, ao passo que um IC 1 ou CI 1 indicado, sinergismo ou antagonismo, respectivamente.

análise de citometria de fluxo para detecção de apoptose

1 × 10

5 células /ml /poço de MIA PaCa-2 e PANC-1 foram tratados com BA, TQ, e GCB sozinho e em combinação, durante 48 horas. As células foram lavadas e coradas com anticorpo de Anexina-V-FITC e PI, de acordo com as instruções do fabricante. ensaio de gráfico de pontos de citometria de fluxo foi realizada e as células digitalizado para a intensidade de fluorescência em FL-1 (FITC) e os canais FL-2 (PI). A fração da população de células em diferentes quadrantes foi analisado, utilizando estatísticas de quadrante. As células no quadrante inferior direito, representado apoptose; e no quadrante superior direito, necrose ou apoptose pós necrose [36].

A medição do potencial de membrana mitocondrial

1 × 10

5 células /ml /poço de MIA PaCa-2 e PANC-1 foram tratados com BA, TQ, e GCB sozinho e em combinação, em placa de 12 poços durante 48 horas. No passado 1 hora de incubação, antes da terminação da exposição, as células foram coradas com rodamina-123 (5 ug /ml). As células foram lavadas em PBS e centrifugada a 100 x g durante 5 minutos e suspensas em PBS. Para detectar as mudanças no mitocondrial transmembranar potencial (ψ), como um resultado da perturbação mitocondrial, uma diminuição na intensidade de fluorescência foi analisada fluxo-cytometrically em FL-1channel [37].

Preparação de lisado de células inteiras e imunotransferência

células, (2 × 10

6/6 mL de meio /placa de 60 milímetros de cultura de tecidos) exposta à BA, TQ, e GCB sozinho e em combinação, após 48 horas de tratamento, foram recolhidas por tripsinização e lavadas com PBS.The sedimento obtido foi lisadas com tampão de lise frio de gelo (50 mMTris pH 8,0, 150 mMNaCl, EDTA 5 mM, 1% v /v Nonidet P-40, PMSF 1 mM e 1% (v /v) mistura de inibidores de protease) e mantidos durante 30 min em gelo com rosqueamento intermediário após cada 5 minutos. Os lisados ​​foram centrifugados a 12000 g durante 10 min a 4 ° C e o sobrenadante recolhido para imunotransferência [38]. O sobrenadante assim recolhido foi quantificado utilizando o ensaio de ácido bicincon�ico (ensaio BCA) kit da Thermo Scientific. Para a análise de Western blot, 50 ug de proteína total foram resolvidos em SDS-PAGE a 60 V e, em seguida, electro transferido para membrana de PVDF durante a noite a 4 ° C sob uma corrente de 30 V. A ligação de proteína não específica foi bloqueada com leite magro a 5% em solução salina tamponada com Tris, contendo 0,1% de Tween-20 (TBST), durante 1 h à temperatura ambiente. Os blots foram sondados com os respectivos anticorpos humanos anti-rato primário /coelho /cabra durante 2 horas e lavou-se três vezes com TBST. As manchas foram então incubadas com peroxidase de rábano conjugada com anticorpos secundários durante 1 h, lavou-se novamente três vezes com TBST e os sinais detectados, utilizando ECL plus kit de quimio-luminescência em um filme de raios-X [38].

actividade PKM2 ensaio

PKM2 actividade foi medida espectro-fotometria (UV-1800, Shimadzu, Japão), utilizando NADH /lactato-desidrogenase (LDH) ensaio acoplado, como descrito anteriormente [39].

estatística análise

dados de experimentos realizados em triplicado foi expressa como média +/- SD, salvo indicação em contrário. Foram feitas comparações entre grupos controle e tratado, usando ANOVA one-way (Dunnett ou Tukey) e P valores . 0,01 foram considerados significativos

Resultados

In vitro

estudos de combinação de gemcitabina com ácido betulínico e thymoquinone

a quimio-sensibilidade em linhas celulares de cancro do pâncreas, MIA PaCa-2 e PANC-1, para o GCB droga eo moléculas dietético, BA ou TQ, reflectiu-se inibição do crescimento celular, IC calculado

50 (inibição do crescimento de 50%) em 48 horas; e em comparação com os valores inicialmente obtidos numa linha celular de controlo, FR2. A IC

50 valores obtidos a partir de tratamento independente nas três linhas celulares, MIA PACA-2, PANC-1 e FR2, são fornecidos em detalhe na Tabela 1 (BA: 25 ± 0,9 ^ M, de 23,5 ± 3,5 uM, 50 ± 1 uM; TQ 36 ± 0,28 pM, 23 ± 2 uM e 77 ± 2 uM; GCB 1 ± 0,66 uM, 5,5 uM e 2,5 ± 0,025? M). Os resultados foram analisados ​​com One-way ANNOVA-Dunnett que mostra uma redução significativa (valor de p 0,01) entre as amostras tratada efeito, de uma forma dependente da dose (Figura 1). Com base nestes resultados, uma proporção fixa da droga foi seleccionado (GCB: BA ou GCB: TQ) ao longo de um intervalo de concentrações de fármaco e utilizado de experimentações posteriores (Figura 2). Combinação-índice (CI) foi utilizado para analisar e confirmam o sinergismo observado após pré-tratamento de células com a molécula dietético, seguido pela exposição ao GCB durante 48 horas (GCB: BA e GCB: TQ). Os valores de CI, que fornecem uma medida quantitativa do grau de interacção da droga, foram calculados usando o software CalcuSyn, a valores de Fa de 0,50, 0,75, e 0,90 (Quadro 2). Isobologramas construída para estes valores, representando 50%, 75% e 90% de inibição de crescimento, respectivamente, tanto para MIA PaCa-2 e PANC-1, células (Figura 3) e trama Fa-CI, está previsto que a Figura S1. A Tabela 3 apresenta os valores de IC em Fa de 0,50-0,90 para as moléculas alimentares (BA ou TQ) e drogas (GCB). Uma comparação entre a monoterapia (BA, GCB, TQ) com a combinação (CI

(GCB: BA), e IC

(GCB: TQ)) mostrou uma diferença significativa no valor de p 0,01. Os valores de ED do isolobologram para MIA PaCa-2 e PANC-1 são mencionados na Tabela S1. Em células MIA PaCa-2, sensibilizadas com BA e seguiram com a exposição GCB, o CI

: valores obtidos em doses (6.25:0.082 e 25:0.33) (GCB BA) foram 0,519, 0,889. Com TQ, a CI

(GCB: TQ) em doses (4.5:0.082; 9:0.15 e 36:0.66) apresentaram os valores de 0,721, 1,050, 0,681. No entanto, em PANC-1 do CI

(GCB: BA) em doses (20:5.2 5:1.3 e) mostrou 0,766, 0,429 e com TQ CI

(GCB: TQ) em doses (6.25:1.3 e 25:5.3), os valores foram 0,736, 0,371. Os valores de CI 1; 0,5 e 1, representado sinergismo, sinergismo forte e efeito antagonista, respectivamente. O sinergismo foi observada através de uma ampla gama de concentrações em ambas as linhas de células de tumor de pâncreas estudados. Sinérgica combinação de drogas ou seja, CI (o índice de combinação) de CI

(GCB: BA) (25 + 0,33), e IC

(GCB: TQ) (36 + 0,66) na linha de MIA PaCa-2cell e CI

(GCB: BA) (20 + 5,25), e IC

(GCB: TQ) (25 + 5,25) em PANC-1, representando o valor Fa 0,75 (mostrando inibição 75%), foram utilizados em repouso dos ensaios . No entanto, a linha celular normal utilizado no estudo (FR2), para comparação, um controlo, mostrou inibição para o valor de Fa 0,75-0,90. Os nossos resultados mostraram que o impacto das moléculas alimentares (BA ou TQ) nas células normais foi observada a uma elevada concentração; enquanto que foi necessário apenas uma dose mínima de GCB para a inibição da proliferação celular. No caso de estudos de associação, a exposição total de gemcitabina para as células cancerosas foi apenas durante 24 horas.

IC

50

valor foi calculado com

pâncreas humano adenocarcinoma

linhas de células (a) MIA PaCa-2 (B) PANC-1 e linha celular normal (C) FR2: para o tratamento individual de gemcitabina, thymoquinone e ácido betulínico durante 48 horas (** , significativo como compaired a controlar pelo valor de p . 0,01, n = in-between 3) as três linhas celulares

(a) MIA PaCa-2 e (B) células PANC-1 foram expostas a concentrações graduais de ácido betulínico, timoquinona ou gemcitabina, quer isoladamente ou em combinação com uma proporção de dosagem fixa de ácido betulínico contra gemcitabina e thymoquinone vs. gemcitabina durante 48 horas. (a gemcitabina

tendo exposição durante 24 horas apenas em caso de combinação), gemcitabina (quadrados),

ácido betulínico e thymoquinone

(círculo) gemcitabina + ácido betulínico e gemcitabina + thymoquinone (triângulo). (terapia Mono ( BA, GCB, TQ) Versus Combinações (CI

(GCB: BA), CI

(GCB: TQ).) (** diferença significativa ao valor de p 0,01, n = 3)

(a e B) Mostrando análise isolobolograms da combinação de gemcitabina, ácido betulínico ou thymoquinone in, (a) células MIA PACA-2 com um 1:0.01 rácio de drogas fixo de GCB : BA e GCB: TQ

(B) células com um rácio de drogas 1:0.2 fixo de GCB 1 PANC-: BA e GCB: TQ. As doses individuais de gemcitabina, ácido betulínico e timoquinona, para atingir 90% (linear) de inibição de crescimento (Fa = 0,90), a inibição de 75% (linha hífen) o crescimento (Fa = 0,75), e 50% (cruzes) de inibição de crescimento ( Fa = 0,50) foram plotados no xey eixos. índice de combinação valores (CI) calculado usando software CalcuSyn é representado por pontos acima (antagonismo indicating- entre as drogas) ou abaixo as linhas (sinergia indicating-). (Símbolo X) ED50, (sinal) ED75 e (círculo aberto pontilhada) ED90 (monoterapia (BA, GCB, TQ) versus combinações (CI

(GCB: BA), CI

(GCB: TQ)) (***, diferença significativa no valor de p 0,001, n = 3).

a perda de potencial de membrana mitocondrial

BA ou TQ pré-tratados MIA PaCa-2 e PANC-1 de células juntamente com GCB, em conjunto, e de forma independente, quando analisado por Rh-123 a absorção por cytometery fluxo, apresentado uma perda de 11% e 17% mitocondrial potencial de membrana (MMP) , em MIA células PaCa-2 tratadas com 0,33 uM e 0,66 uM de GCB, respectivamente, enquanto que, em combinação, CI

(BA: GCB)., thedecrease foi de 77% quando comparado com o controlo (o valor de p 0,001) (Figura . 4A) no entanto, as células PANC-1, que são relativamente resistentes a GCB quando comparado com MIA PaCa-2, mostrou um decréscimo de 74% apenas com BA e em combinação, CI

(GCB: BA), a redução foi -se to46%, em comparação com o controle (valor de p 0,001). o tratamento com a dose individual de GCB ou seja, 5,25 uM, mostraram uma diminuição de até 13% (Figura 4B). TQ sozinho ou em combinação com GCB não mostraram qualquer alteração na MMP em ambas as linhas celulares. Aparentemente, BA equi-potente alvo funções mitocondriais que TQ e GCB, em ambos os tipos de células. Nas células de controlo não tratadas, quase todas as células eram bio-energeticamente activo, tal como evidenciado pela elevada Rh-123 fluorescência

(A) MIA PaCa-2:. O ácido betulínico

sozinho e em combinação IC

(GCB: BA) com perda induzida gemcitabina de potencial de membrana mitocondrial (ψ) que não é observado em thymoquinone e gemcitabina sozinha nem nem em combinação IC

(GCB: TQ). As células foram coradas com rodamina-123 (5 mg /mL) durante 1 hora e analisadas em FL-1 do canal de citómetro de fluxo. Os dados em todas as figuras são representativas de uma das três experiências semelhantes. (B) Estudos semelhantes foram realizados na linha celular PANC-1, o ácido betulínico só induz mais a perda da membrana mitocondrial do que em combinação com gemcitabina IC

(GCB: BA) também sem perda de membrana mitocondrial foi observada quando tratados com thymoquinone e gemcitabina sozinho ou em combinação CI

(GCB: TQ) durante 48 horas (Controle versos monoterapia (BA, TQ, GCB) e Controle versos Combinações (CI

(GCB:. BA), CI

( GCB: TQ)), (***, diferença significativa no valor de p 0,001, n = 3)

citometria de fluxo de pontuação Análisis- de células em apoptose, tratados com BA, TQ. e GCB, isoladamente e em combinação

a citotoxicidade aumentada pela BA ou TQ pré-tratamento apoptose induzida era uma questão a ser respondida. TQ células pré-tratadas, juntamente com GCB BA ou, em combinação e individualmente, a dose produzido aumento dependente da população de células apoptóticas e de pós apoptótica em ambos as linhas de células de cancro do pâncreas, MIA PaCa-2 e PANC-1. em MIA PaCa-2, o tratamento independente com BA (25 uM), CP (36? M) e GCB (0,33 uM e 0,66 uM) resultou em 7%, 5%, 1% e 2% de taxa de apoptose, respectivamente. Em combinação, CI

(GCB: BA), produziu 11% e IC

(GCB: TQ) produziu 6% (valor de p 0,001) apoptose, whencompared para controlar (Figura 5A). Do mesmo modo, em linha de células PANC1, BA (20 uM), CP (25? M) e GCB (5,25 uM), produzidos individualmente 9%, 8%, 7% de taxa de apoptose, respectivamente. Enquanto em combinação, CI

(GCB: BA), e CI

(GCB: TQ), a taxa de aumento de 11% e 12% (valor de p 0,001), respectivamente, quando comparado com o controlo (Figura 5B) . Em combinação tratamento, houve um aumento na taxa de apoptose em ambas as linhas celulares. BA produziu efeito mais apoptótica individualmente e em combinação com GCB de GCB e TQ TQ sozinho ou em combinação com MIA PaCa em GCB-2; enquanto, inversa foi observada em células PANC-1.

(A) MIA PaCa-2 células (1 × 10

5) foram incubadas com as concentrações indicadas de ácido betulinico, timoquinona e gemcitabina

isoladamente e em combinação CI

(GCB: BA), e IC

(GCB: TQ) para

48 horas e analisadas para annexinV-FITC coloração /PI para determinar apoptótico populações de células, como descrito em Materiais e Métodos. (B) Estudos semelhantes foram realizados com em células PANC-1, após tratamento com as doses indicadas de betulínico ácido, timoquinona e gemcitabina sozinha e em combinação IC

(GCB: BA), e CI

(GCB: TQ) para 48 horas (controle versus monoterapia (BA, TQ, GCB) e controle versus combinações (CI

(GCB:. BA), e IC

(GCB: TQ)), (***, diferença significativa na valor de p 0,001, n = 3)

expressão PKM2 e Atividade

BA ou TQ pré-tratamento com uma dose sinérgica de Fa 0,75 juntamente com GCB em combinação. (CI

GCB: BA, e IC

GCB: TQ). durante 48 horas em ambas as linhas celulares de cancro do pâncreas, MIA PaCa-2 e PANC-1, mostraram uma diminuição do nível de proteína inPKM2 (Figura 6A e B) Enquanto , na Fa 0,5 ou seja, as células pré-tratadas com BA (5 uM) e TQ (6,25 mM) em combinação com GCB (1,3 uM) durante 48 horas, uma diminuição foi observada em Pro Caspase-3-expressão e PARP, sem qualquer efeito na expressão PKM2, excepto para uma diminuição moderada na expressão em PKM2 com CP (Figura 6C). a actividade de PKM2, contudo, mostrou um aumento inuntreated MIA PaCa-2 células e uma diminuição nas células tratadas com BA (25 uM) , CP (36? M) e GCB (0,33 uM e 0,66 uM); que aprimorou na combinação (CI

GCB: BA, e IC

GCB: TQ) (Figura 7A). Enquanto, no caso de células PANC-1, os resultados assim obtidos foram reversa nas células tratadas com un que mostraram uma actividade diminuída de PKM2 e um aumento na actividade em células tratadas, isoladamente ou em combinação (Figura 7B).

(a) MIA PaCa-2 e (B) doses sinergéticas a Fa 0,75 de ácido betulínico e thymoquinone foram usados ​​isoladamente e em combinação 1 PANC-CI

(GCB: BA), e IC

(GCB: TQ) com gemcitabina

a partir dos borrões, observou-se que houve uma diminuição na expressão de PKM2 quando tratados em doses combinadas.. (C) PANC1 linha celular de doses em Fa 0,5 de ácido betulinico, timoquinona e gemcitabina foram usados ​​sozinhos e em combinação, e a partir das manchas observou-se que houve uma diminuição no pro-caspase-3, seguido por diminuição da PARP e um ligeiro decréscimo é observada em thymoquinone tratados em PKM2.

MIA PaCa-2 células (a) tratados com Betulinic ácido, thymoquinone e gemcitabina sozinho e em combinação, CI

(GCB : BA) e

CI

(GCB: TQ) às 48 horas. A diminuição da atividade em células tratadas seguidos com

mais

diminuir

em combinação (s), CI

(GCB: BA)

e IC

(GCB: TQ),

em comparação com foi observado o controle;

(B)

Em PANC-1 linha celular foi vice-versa observado. Controle versus monoterapia (BA, TQ, GCB) e controle versus combinações (CI

(GCB: BA) CI

(GCB: TQ)), (***, diferença significativa no valor de p 0,001, n = 3)

Discussão

tumores pancreáticos que são refratários à terapia gemcitabina representam um desafio para os oncologistas. Terapias que estão atualmente em uso para o tratamento de câncer pancreático mostraram decepcionante eficácia; ea aquisição de resistência à droga durante a quimioterapia constitui um grande desafio. Assim, novas estratégias têm de ser postas em prática, a fim de desenvolver agentes quimio-preventivas e /ou quimio-terapêuticas inovadoras que possam melhorar o resultado clínico desta doença. Evidências crescentes incentiva a utilização de moléculas e suplementação na dieta para aumentar a resposta dos agentes quimioterápicos do câncer padrão. Anteriormente, os flavonóides foram relatados para inactivar vias frequentemente desregulada, tal como Akt e NF-kB, no cancro pancreático, contribuir para o crescimento celular, metástase e resistência à quimioterapia. A genisteína, um composto dietética, tem mostrado aumentar a actividade anti-tumoral de erlotinib e gemcitabina em sistemas experimentais de cancro pancreático [40]. Anteriormente, também foi demonstrado que garcinol, uma molécula dietético, sinergiza com gemcitabina para inibir a proliferação celular e induz a apoptose em células MIA PaCa-2 com modulação significativa dos principais reguladores do cancro, incluindo

PARP

,

VEGF

,

MMPs

,

TIs

, caspases, e

NF-kB

[

41

]. A curcumina, um componente da dieta, sensibiliza do cancro do pâncreas gemcitabina

in vitro

e

in vivo. In vitro

, curcumina foi demonstrado inibir a proliferação de várias linhas de células do cancro do pâncreas, potenciar apoptose induzida por gemcitabina, e inibindo a activação constitutiva do NF-kB em células.

In vivo

, tumores de camundongos nus injectados com células de cancro do pâncreas e tratados com uma combinação de curcumina e gemcitabina mostrou uma redução significativa no volume (

P

= 0,008 vs controle;

P

= 0,036 vs gemcitabina sozinho) [42]. Nas nossas experiências, uma interacção combinado de ácido betulinico (BA) ou timoquinona (TQ), os dois neutraceuticals com gemcitabina (GCB), em GCB-Sensitive-MIA PACA-2 e GCB-resistentes-PANC-1 – linhas pancreáticas celulares de cancro , mostrou sinergismo. O ensaio de viabilidade revelou uma interacção sinérgica entre GCB citotóxica e BA ou GCB e TQ em ambas as linhas celulares GCB-sensíveis e resistentes ao, como determinado pelo DRI (dose Índice de redução) de 1 obtido a partir de CalcuSyn [43]. Mecanicamente, GCB medeia os seus efeitos citotóxicos através da inibição da síntese de reparação passo através de sua ação como um inibidor da ribonucleótido-redutase, esgotando as piscinas desoxi-nucleotide intracelulares, e reforçar o potencial de sua própria incorporação no ADN recentemente sintetizado. Uma vez incorporada no ADN, o análogo origina a terminação da síntese de ADN e é resistente à remoção por exo-nucleases, resultando em quebras na cadeia de ADN [44]. O ácido betulinico (BA), um nutracêutico, tem sido demonstrado que induz a apoptose através de vias mitocondriais, em que durante este processo as duas membranas exteriores e interiores mitocondriais são permeabilizadas, resultando na libertação de proteínas solúveis, tais como o citocromo c, Smac ou FIA, a partir de o espaço intermédio mitocondrial para o citosol [45]. BA também induz deathin várias linhas de células de cancro diferentes através de múltiplas vias, que incluem indução independente de p53 de p21 /WAF1, a sobre-regulação de receptores de morte, a inibição de factores de proteína especificidade (SP) de transcrição [46]. Da mesma forma, timoquinona (TQ) induz a apoptose em células tumorais através de vários mecanismos, incluindo a supressão do NF-kB, a activação de Akt quinase e vias de sinalização regulada por sinal extracelular, e também por inibição da angiogénese de tumores [47]. Com base ED

50, ED

75 e ED

90 de combinações de medicamentos, isobologramas foram gerados e a sinergia avaliada, usando CalcuSyn. O ácido betulinico (BA) ou thymoquinone (TQ) em combinação com gemcitabina (GCB), em várias concentrações de fármaco, mostraram que em GCB-sensíveis-MIA PaCa-2 e GCB-resistentes-PANC-1 de células, o índice de combinação (IC) 0,88 estava sob a Fa de 0,75 (redução de 75% do crescimento celular) em células MIA PaCa-2. Considerando que, em caso de PANC-1, o índice de combinação (IC) estava sob 0,76 a 0,5 de Fa. A base biológica para esta sinergia foi claro em alterações diferenciais em apoptose com ambas as moléculas alimentares. Mesmo que mecanicamente nossas combinações são “mutuamente não-exclusivo” na natureza, mas ambas as moléculas alimentares mostrou uma diferença significativa no quantum de indução de citotoxicidade em comparação com ficar sozinho GCB. No entanto, a taxa de indução de apoptose por BA em combinação com GCB foi mais eficiente em ambas as linhas celulares, que em combinação com TQ GCB. Além disso, a diminuição do potencial mitocondrial transmembranar (Ψ) foi observada quando BA sozinho ou em combinação com GCB foi fornecida a ambas as linhas celulares. Nenhuma mudança, no entanto, foi observada no potencial mitocondrial transmembranar (Ψ) quando as linhas celulares de cancro foram tratadas com GCB sozinho.