Abstract
Fundo
claudinas são proteínas de junção apertados que estão envolvidos na formação da junção apertado e função. Estudos anteriores demonstraram que claudina-7 é frequentemente sobre-regulada no cancro epitelial do ovário (EOC) juntamente com claudina-3 e claudina-4. Aqui, nós investigamos em detalhe os padrões de expressão de claudina-7, bem como suas possíveis funções na EOC.
Metodologia /Principais Achados
Um total de 95 amostras de tecido do ovário (7 ovariana normal tecidos, 65 carcinomas serosos, 11 carcinomas de células claras, 8 carcinomas endometrióides e 4 carcinomas mucinosos) foram estudados para claudin-7 de expressão. Na análise em tempo real de RT-PCR, o gene da claudina-7,
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, verificou-se ser regulada positivamente em todas as amostras de tecido de tumor estudado. Da mesma forma, a análise imuno-histoquímica e transferência de Western mostrou que a proteína de claudina-7 foi significativamente sobre-expresso na grande maioria dos EOCs. Pequenas interferir knockdown mediada por ARN de claudina-7 em células de cancro do ovário conduziu a alterações significativas na expressão de gene como medido por microarranjos e validado por RT-PCR e immunoblotting. A análise dos genes expressos diferencialmente revelou que os genes alterados em resposta a claudina-7 knockdown foram associados com vias implicados em várias funções celulares e moleculares, tais como ciclo celular, o crescimento e a proliferação celular, morte celular, o desenvolvimento, e a movimentação das células. Através de experimentos funcionais in vitro, verificou-se que tanto a migração e invasão foram alterados em células onde
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tinham sido derrubados ou sobre-expressos. Curiosamente, a expressão claudin-7 foi associado com um aumento líquido de invasão, mas também com uma diminuição da migração.
Conclusão /Significado
Nosso trabalho mostra que claudin-7 é significativamente regulada em EOC e que pode ser funcionalmente envolvidos na invasão de carcinoma do ovário.
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pode, portanto, representam potencial marcador para a detecção de câncer de ovário e um alvo para terapia
Citation:. Dahiya N, Becker KG, Madeira, WH III, Zhang Y, Morin PJ (2011) Claudina -7 é overexpressed frequentes no cancro do ovário e promove Invasão. PLoS ONE 6 (7): e22119. doi: 10.1371 /journal.pone.0022119
editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 15 de dezembro de 2010; Aceito: 16 de junho de 2011; Publicado: 15 Julho 2011 |
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Financiamento:. Esta pesquisa foi suportada inteiramente pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional sobre Envelhecimento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de ovário é a sexta maior causa de morte por câncer em mulheres em todo o mundo [1]. O câncer de ovário é tipicamente diagnosticada como doença avançada, quando as opções terapêuticas são limitadas eo prognóstico muito pobre. Nos últimos anos temos assistido a uma série de avanços em nossa compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na progressão do câncer de ovário [2], [3], embora grande parte dos detalhes permanecem desconhecidos. Entre os genes cuja expressão é frequentemente alterada no cancro do ovário são aquelas que codificam a família de proteínas de junção claudina apertadas [4] – [7]. Claudinas formar a espinha dorsal de TJs e são, portanto, essencial na compartimentalização epiteliais e no controle de transferência de soluto através monocamadas de células [8] – [10]
No câncer, função TJ normal e estrutura são tipicamente alteradas eo TJs si. são frequentemente desmontado [11], [12]. a expressão do gene de perfil recentes estudos relataram a expressão alterada de um número de proteínas TJ em vários cancros, incluindo várias proteínas claudina [4], [6]. Por exemplo, claudin-3 e claudin-4 são elevados no ovário, próstata, útero e de mama, enquanto claudin-1 é reduzida em cânceres de mama e próstata.
Claudina-7 foi encontrado reprimidos em vários tipos de câncer incluindo esôfago [13], [14], cabeça e pescoço [15] e câncer de próstata [16]. Perda de claudina-7 foi correlacionada com a desdiferenciação em vários cancros diferentes [16] – [19]. No cancro da mama, claudina-7 de expressão também foi encontrada para ser diminuída e inversamente correlacionado com o grau do tumor e doença metastática [17], [18], embora haja evidências de que claudina-7 pode tornar-se re-expressos em metástases [20], [21]. Por conseguinte, tem sido sugerido que a perda de claudina-7 está associado com uma perda de adesão celular e aumento da metástase [14], [17]. No entanto, claudina-7 também foi demonstrado ser elevados em vários tipos de cancro. Por exemplo, claudina-7 é conhecido por ser elevado no cancro do ovário [22] – [27], bem como outras doenças malignas [28], [29]. A razão para os diferentes padrões de mudanças observadas em diferentes tipos de câncer é desconhecida, mas pode estar relacionada com as funções exatas de claudina-7 em diferentes neoplasias malignas, tornando elucidação desses papéis um objetivo importante.
Neste relatório , primeiro avaliar claudina-7 níveis de expressão em amostras de tecido do ovário e linhas celulares utilizando western blotting, RT-PCR, e imuno-histoquímica e descobrir que claudina-7 é amplamente expresso em tumores ovarianos. Usando microarrays, descobrimos que muitos genes são diferencialmente expressos seguinte
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knockdown e análise destes genes sugere vários caminhos através dos quais
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pode funcionar no câncer de ovário. Mostramos que
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knockdown conduz a uma diminuição na fosfo-Erk e um aumento nos níveis de Raf-1, sugerindo uma possível via para claudina-7 sinalização no cancro do ovário. Além disso, descobrimos que
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expressão está associada ao aumento invasão, mas diminuiu a migração em várias linhas de células fornecendo um link funcional para
expressão CLDN7
no carcinoma do ovário.
resultados
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transcrição e níveis de proteína são elevados em tecidos de cancro do ovário
Um trabalho recente mostra que, para além da
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e
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genes,
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é frequentemente elevados no cancro do ovário [22] – [26], [30]. A fim de definir claramente tumores ovarianos
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padrões de expressão em cancro do ovário, MICRODISSECADO de vários subtipos, bem como linhas de células foram analisados por em tempo real de RT-PCR.
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mRNA foi encontrado para ser altamente regulada para cima em todos os quatro subtipos principais de cancro do ovário (isto é, serosa, mucinoso, das células claras, e endometrióide) em comparação com os tecidos ovarianos normais (Figura 1A). O nível de sobre-expressão variou muito e verificou-se ser em qualquer lugar a partir de 2 vezes a 50000 vezes. Com efeito, o aumento de 2 vezes ao longo MANGUEIRA-B foi observada em 2 dos controlos ovário normal, enquanto a superexpressão 50.000 vezes foram observados em tecidos de cancro do ovário 3 serosas.
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está amplamente distribuído em tecidos humanos normais e a sua transcrição foi encontrada em níveis relativamente elevados nos rins, cólon, pulmão, intestino delgado, testículos, placenta, glândula salivar, da tiróide, glândula supra-renal, pâncreas, próstata, fígado , estômago, ovário e pele (Figura 1B). Por outro lado, músculo, cérebro, coração, baço, útero, leucócitos de sangue, medula óssea, cérebro fetal, fígado fetal e expressaram níveis mais baixos de
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ARNm.
. Os subtipos de carcinoma do ovário indicadas foram testadas para a
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por RT-PCR e os níveis são apresentadas em relação às células-B MANGUEIRA (uma linha celular epitelial da superfície do ovário imortalizada com E6 e E7 [52]).
expressão CLDN7
B. em tecidos normais. Os seguintes tecidos foram analisados: 1, Músculo; 2, Brain; 3, Coração; 4, rim; 5, baço; 6, do fígado; 7, Colon; 8, Lung; 9, Intestino Delgado; 10, estômago; 11, testículos; 12, placenta; 13, salivar; 14, tireóide; 15, glândula adrenal; 16, pâncreas; 17, Útero; 18, ovário; 19, da próstata; 20, Pele; 21, plasma leucócitos do sangue; 22, de Medula Óssea; 23, Fetal do cérebro; 24, fígado fetal. Os níveis são apresentados em relação ao músculo e tecidos com níveis mais elevados do que 4 vezes são indicados no gráfico. C. Análise de imunotransferência da expressão claudina 7-2 em tecidos normais de ovário (N1 e N2), 7 serosa (S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 e), uma célula clara (C1) e um endometrióide (E1 carcinomas do ovário). Um total de 29 amostras foram testadas por imunotransferência e exemplos representativos são mostrados. D. A imuno-histoquímica de carcinomas do ovário serosas. carcinomas de ovário selecionados (S3, S4, S5, S6) e uma amostra de ovário normal (N) são mostrados. amostras de cancro do ovário coradas com anticorpo claudin-7 (Cl-7) apresentar uma coloração forte em comparação com controles negativos coloração falta anticorpo primário (-).
A fim de investigar claudin-7 níveis de proteína no cancro do ovário , um painel de 29 amostras de cancro do ovário primários, bem como 4 tecidos ovarianos normais foi estudada por immunoblotting (Figura 1C, Tabela S1). Claudina-7 estava ausente em todos os tecidos ovarianos normais, mas foi encontrado em elevados níveis moderados /em 66% (19/29) das amostras de cancro. Claudina-7 foi encontrado expresso em níveis baixos em 24% (7/29) dos casos, e não era detectável em 10% (29/03).
A imuno-histoquímica (IHC) experimentos confirmaram que claudina-7 foi expresso em níveis elevados no cancro do ovário (Figura 1D). O estudo demonstrou que IHC claudin-7 sobre-expressão era restrita às células cancerosas e não envolveu o estroma. Além disso, enquanto certos tumores exibiram coloração da membrana significativa (S3 e S4), outros mostraram coloração reduzida na membrana e níveis elevados de coloração citoplasmática.
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é elevada em linhas celulares de cancro do ovário e pode estar localizado na membrana ou no citoplasma
de modo a avaliar
expressão CLDN7
em linhas celulares, 7 linhas celulares foram avaliados por RT-PCR e imunotransferência (Figura 2A, B) . O
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transcrito não foi detectado na linha não-malignas do epitélio superficial MANGUEIRA-B, mas foi encontrada em todas as linhas celulares de cancro do ovário, excepto UCI101 e OVCA432 (Figura 2A). Analogamente, a proteína claudina-7 não foi detectada em MANGUEIRA-B, mas estava presente em linhas celulares de cancro do ovário a maioria (mas não em HEY e UCI101) (Figura 2B). Curiosamente, as células HEY apresentaram altos níveis
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mRNA, mas baixos níveis de proteína, enquanto OVCA432 exibiu muito baixo
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transcrição níveis, mas alta claudin-7 a expressão da proteína. Estes dados mostram que, enquanto claudina-7 transcrição é retida em linhas celulares, claudina-7 níveis de proteína podem ser regulados através de mecanismos de pós-transcrição.
. Claudina-7 imunotransferência revela níveis elevados de expressão em linhas celulares de cancro do ovário indicados. B. A análise de RT-PCR de
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ARNm em linhas de células. C. Imunofluorescência de linhas celulares de cancro seleccionadas mostra forte expressão claudina-7 na junção célula em BG-1, OVCA433, OVCA420 e OVCA432, bem como uma coloração citoplásmica pontuada em BG-1 e OVCA420. Claudina-7 foi detectada com um anticorpo anti-claudina-7 e visualizadas com um anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor. Os núcleos das células foram contrastadas com DAPI. As imagens foram fundidas para determinar a localização correcta.
Usando imunofluorescência, claudina-7 coloração foi encontrada localizado predominantemente na membrana celular, com coloração pontilhada no citoplasma de linhas celulares de cancro do ovário BG-1, OVCA420 e OVCA433 (Figura 2C). Em OVCA432, também observamos coloração da membrana, mas pouca expressão no citoplasma.
A expressão genética muda seguinte
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knockdown em células de cancro do ovário
Para investigar os possíveis papéis da
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no cancro do ovário, nós examinamos as mudanças de expressão de genes seguintes
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knockdown. Estas experiências foram realizadas em knockdown linhas de células OVCAR-2 e OVCA420, ambas as quais exibem os níveis endógenos moderadas de claudina-7 de expressão (Figura 3A).
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siARN tratamento conduziu a uma redução significativa da claudina-7 de proteína de 72 horas após a transfecção (Figura 3A) e este ponto de tempo foi seleccionado para análise de micro-arranjo. Em células OVCAR-2, que formam TJs em cultura,
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knockdown conduz a uma diminuição da resistência transepitelial (TER, uma medida de aperto TJ) e um aumento concomitante na permeabilidade através da monocamada (Figura 3B). Isso demonstra que
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knockdown tem um efeito funcional no TJ nestas células. Em OVCA420 células, que não fazem TJ em cultura, TER foi extremamente baixa e permaneceu inalterado por
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knockdown (Figura 3B). Consistente com este achado, a permeabilidade também não foi afetada pela
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knockdown.
A. A análise de imunotransferência de células OVCAR-2 e OVCA420 seguinte
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knockdown durante 72 horas. B. Efeitos da
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knockdown no TJ e permeabilidade. resistência transepitelial (TER) foi medido em vários pontos de tempo seguinte
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knockdown. A permeabilidade foi medida através da avaliação da capacidade de fluoresceína-isotiocianato-dextrano (40 kDa), para atravessar a monocamada. medições de fluorescência refletem monocamada permeabilidade e os resultados espelham as medições de TER. As experiências foram realizadas em triplicado e os resultados são apresentados como a média +/- D.P. Um asterisco (*) indica um valor de p 0,05, e dois asteriscos (**), um valor de p 0,01. C. análise de agrupamento hierárquico da expressão do gene seguinte
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knockdown em ambas as linhas celulares. A cor verde representa a infra-regulação, enquanto o vermelho representa-se-regulação. Um total de 20 grupos de genes que apresentam padrões distintos foram identificados.
análise Microarray foi utilizada para investigar os efeitos do
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knockdown sobre a expressão gênica em ambos OVCAR-2 e células OVCA420 linhas. análise de agrupamento demonstrou vários padrões de mudanças seguintes
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knockdown e esses padrões foram representados por 20 diferentes grupos de genes identificados pelo agrupamento padrão sem supervisão utilizando o software JMP (Figura 3C).
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era o único gene no grupo 3 e, como esperado, foi altamente regulados negativamente em ambas as linhas celulares. Dos 1327 genes expressos diferencialmente nas duas linhas (Tabela S2), 297 (200 e 97 regulada positivamente regulados negativamente) foram partilhados por OVCAR-2 e OVCA420 (Figura 4). Isto representa uma sobreposição de 23% de todos os genes expressos diferencialmente, um valor muito mais elevado do que o esperado por acaso sozinho (p 0,001). Em OVCAR-2, um total de 553 genes foram sobre-regulada e 415 foram regulados negativamente e, em OVCA420, 404 genes foram sobre-regulada e 252 foram regulados negativamente. Os 20 genes sobre-regulada e regulada para baixo em cada linha celular (bem como em ambas simultaneamente) estão listados na Figura 4.
No diagrama de Venn, números em vermelho representam genes supra-regulados e números em verde representam genes reprimidos. Os 20 principais genes em cada categoria são indicados na tabela abaixo o diagrama de Venn.
Para validar e ampliar os dados de microarranjos, 15 genes que foram significativamente alterados pela
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knockdown no linhas de uma ou ambas as células, foram escolhidos para a validação por análise de RT-PCR (Figura 5). Enquanto a expressão de dobragem pareceu ser subestimada por análise de microarray, em tempo real, PCR confirmou as tendências para todos os genes testados (Figura 5A, B). Além disso, os níveis de proteína para vários destes genes (
CA12
,
RRAS2
,
PRSS8
,
APOE
,
AGT
,
SPRR3
, e
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) foram testados em diferentes pontos de tempo após a
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knockdown (Figura 5C). Os resultados destas experiências foram consistentes com as alterações observadas por RT-PCR. Em geral os nossos dados mostram uma excelente correlação entre as mudanças detectadas por microarrays e os níveis de expressão de proteínas correspondentes.
A. Dobre mudanças dos vários genes indicados em OVCA420 e células OVCAR-2 seguintes
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knockdown. validação B. RT-PCR dos genes indicados em (A). C. Análise de imunotransferência de candidatos seleccionados em vários pontos de tempo após a
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knockdown. controle de GAPDH foi incluído para confirmar o carregamento semelhante em todas as pistas.
Pathway análise
Usando Ingenuity Pathway Analysis (IPA), foram analisadas as vias e possíveis funções associadas com as mudanças de expressão gênica seguinte
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knockdown. Muitas das principais redes identificados cancro envolvido, o crescimento e a proliferação celular, mas eles não foram claramente conservada entre as linhas de células (Tabela S3). Curiosamente, “integrina sinalização” foi encontrada em ambas as linhas celulares entre os caminhos canônicos mais significativos identificados (Tabela S3). As funções biológicas de topo inclui uma variedade de funções, tais como o crescimento celular e a morte celular, e curiosamente, movimento celular. Os sistemas fisiológicos identificados incluiu resposta hematológica e imunológico, bem como o desenvolvimento de tecido conjuntivo (Tabela S3). análise do gene ontologia de genes alterados identificadas categorias significativos, tais como “atividade estrutural molécula”, “atividade transdutor de sinal”, “atividade regulador de transcrição”, “atividade regulador de tradução” e “actividade transportador” (Tabela S4).
as possíveis relações funcionais entre os vários genes expressos diferencialmente foram então determinada utilizando uma variedade de abordagens. Os caminhos 5 KEGG comuns mais significativos (como determinado por Webgestalt) eram “regulação do citoesqueleto de actina”, “adesão focal”, “via de sinalização MAPK”, e “via de sinalização da insulina”. Tabela S5 lista todas as vias identificadas. Os genes de topo as 5 vias mais significativos enumerados acima foram utilizados para pesquisar a base de dados do estúdio do pathway para interacções proteína-proteína conhecida (Figura 6A). Tabela S6 lista os detalhes de interacção proteína-proteína e suas referências correspondentes. Curiosamente uma das vias mais proeminentes identificadas através desta abordagem foi a via RAS-RAF-MAPK (Figura 6A). Em seguida, estudou esta via em células OVCA420 examinando expressão e fosforilação de Erk e Raf-1 nestas células (Figura 6B). Claudina-7 knockdown levou a um aumento no fosforilado Raf-1 (Ser-338) que foi acompanhada por um aumento no total Raf-1 em todos os pontos de tempo, sugerindo que, de facto esta via pode ser afectada por claudina-7. ERK1 /2 níveis não foram afetados pela claudin-7 knockdown, mas fosforilada Erk exibiram uma ligeira diminuição, especialmente em momentos posteriores.
A. análise de caminho Studio. interações diretas de 33 significativamente regulada (seta para cima) ou vermelho (setas para baixo verde) genes reprimidos são mostrados. A legenda para as diferentes tipos de interacções é mostrado abaixo do mapa. B. Análise de imunotransferência da ERK1 /2, fosfo-ERK1 /2 (p-Erk) e Raf-1 e fosfo-Raf (Ser-338) em OVCA420 nos pontos de tempo indicados a seguir
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knockdown.
Claudin 7-expressão da proteína está associada com a invasão da célula, mas inversamente correlacionada com a migração
Porque a nossa análise do gene acima revela o movimento celular como uma função possivelmente afetados pela
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, decidimos testar os possíveis papéis de
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na migração de células de cancro do ovário e da invasão. Nós primeira realizada knockdown mediado por siRNA transitória da
expressão CLDN7
em duas linhas de células de cancro do ovário (OVCAR-2 e OVCA420) e testado de migração utilizando o ensaio de migração celular Oris.
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knockdown levou a um aumento reprodutível na migração celular em ambas as linhas celulares em cada ponto de tempo testado (Figura 7A). invasão celular foi então avaliada utilizando um ensaio de câmara de Boyden e, como mostrado na Figura 7B, a inibição da claudina-7 expressão em células OVCAR-2 e OVCA420 reduziu significativamente o potencial invasivo destas células. Para confirmar ainda mais o papel da claudina-7 na invasão, claudina-7 foi sobre-expresso em células de OV-90 (que não têm endógena expressão claudina-7) e descobriu que a sobre-expressão estável desta proteína conduziu a um aumento da invasão comparado com células transfectadas por simulação ou parental OV-90 células (Figura 7C).
A. Os ensaios de migração em células OVCAR-2 e OVCA420. A migração de células com
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derrubado (barras escuras) ou células de controlo (barras brancas) foi medido em diferentes pontos de tempo após o início do ensaio. B. Boyden ensaio de invasão câmara de OVCAR-2 e OVCA420 células com e sem
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knockdown. O número de células invasoras foi medida a cada hora durante 6 horas. ensaios C. Invasão em um modelo de
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superexpressão. Duas linhas estáveis, OV90-CLDN7 e OV90-CINEO, bem como células OV90 parentais untransfected foram usados para testar mudanças na invasão seguintes
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superexpressão. Para todos os resultados apresentados nesta figura, os experimentos foram realizados em triplicado e os resultados são apresentados como média +/- E.P.M. Um asterisco (*) indicou um valor de p 0,05, e dois asteriscos (**), um valor de p . 0,01
Discussão
Nossos dados mostram que
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é elevada em ambos os níveis de proteína mRNA e na maioria dos tecidos com cancro do ovário e linhas celulares. Pela análise ocidental, tecidos tumorais de ovário primárias exibiram expressão variável de claudina-7 variando de moderada a alta expressão em 66%, baixa em 24%, e indetectável em amostras de tecido do tumor de 10%. A razão para essa variabilidade não é clara, como a regulação da transcrição da
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permanece em grande parte desconhecido. Curiosamente, hipermetilação tem estar implicado na regulação negativa da
expressão CLDN7
no cancro da mama [17] e dois fatores de transcrição, Tcf-4 e Sox9, foram mostrados para cooperar no
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repressão células do cólon [31]. Desconhece-se se estes mecanismos estão envolvidos em
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regulação no câncer de ovário, mas estas possibilidades estão atualmente sob investigação.
Nós achamos que
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é elevado em todos os principais subtipos de câncer de ovário: seroso, endometrioid, de células claras e mucinoso. Estes resultados são consistentes com os dados anteriores microarray [22], [26] e experiências IHC [27] [30], mostrando que CLDN7 é tipicamente sobre-expressos em câncer epitelial de ovário. Com efeito, um dos primeiros estudos mostraram que claudina-7 é sobre-expresso em todos os subtipos de cancro do ovário epiteliais, mas não está em overexpresssed cordão sexual e tumores estromais [23]. Além disso, uma análise detalhada por Tassi et al. [24] mostrou que
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é universalmente-regulada em câncer epitelial de ovário em ambos os níveis de mRNA e proteína. Nosso estudo também demonstra a superexpressão nos subtipos de câncer epitelial de ovário mais comuns (serosa, de células claras, endometrioid e mucinoso) em ambos os mRNA e os níveis de proteína utilizando qRT-PCR, IHC, e immunoblotting. O uso de imunotransferência e qRT-PCR permite-nos demonstrar que os níveis de ARNm e os níveis de proteína não são sempre correlacionadas, sugerindo regulação pós-translacional de claudina-7 no cancro do ovário.
Curiosamente, enquanto verificou-se que mais claudina -7 coloração foi localizada na membrana, várias amostras de cancro do ovário exibiram forte coloração citoplasmática (Figura 1D). O facto de as proteínas claudina pode ser encontrada no citoplasma foi avaliado e, em especial, uma coloração citoplásmica pontuada de claudina-7 tem sido observada em cancro do ovário [24]. Os mecanismos e causas de localização citoplasmática claudina permanecem incertos, mas várias linhas de evidência sugerem que a fosforilação da claudinas pode afectar a sua localização. Por exemplo, a mutação de um local de fosforilação de PKA em claudina-3 foi mostrado para levar a um aumento da localização citoplasmática do cancro do ovário em [32]. Da mesma forma, claudina-4 foi encontrado para ser fosforilada pela proteína quinase C e esta fosforilação foi encontrada para levar à translocação de claudina-4 a partir da membrana para o citoplasma e uma diminuição na função TJ [32]. claudina proteínas também são conhecidas por serem reguladas por palmitoilação, como claudina-14 palmitoilação foi mostrado para ser crucial para a sua localização correcta [33]. É actualmente claro se claudin-7 podem ser modificadas e se as modificações podem afectar a sua localização.
A superexpressão de claudinas no cancro sugere que claudinas pode ter papéis funcionais em tumorigênese. Vários grupos têm estudado os possíveis papéis de claudina-7 no câncer. Claudina-7 tem sido sugerido para ser envolvido na regulação do antigénio específico da próstata (PSA) [34], possivelmente através da interacção com uma molécula de adesão juncional (JAM-A) [35]. Claudina-7 também foi relatada para formar um complexo com EpCAM-tetraspanina que interfere com as propriedades de adesão celular mediada por EpCAM e aumenta a resistência à apoptose [36] – [38]. Com efeito, no carcinoma colorrectal, de EpCAM e claudina-7 são encontrados em associação com a tetraspanins CD9 e /ou CO-029 e promover a formação de metástases [37]. Além disso, EpCAM-
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complexo foi sugerido ter papel na migração, proliferação, resistência à apoptose, metástase e tumorigenicidade [37], [39].
Em tentando reunir pistas adicionais sobre
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função no câncer de ovário, investigamos as mudanças de expressão de genes seguintes
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knockdown. Nossa hipótese é que a regulação negativa do
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pode afetar as vias a jusante afectados por esta proteína e, finalmente, levar a mudanças de expressão nos genes regulados por estas vias. Entre as duas linhas de células de cancro do ovário estudada, foi identificada com um total de 1296 genes que foram significativamente alterados seguinte
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knockdown. Entre estes genes, 297 foram encontrados expressos diferencialmente simultaneamente em ambas as linhas. A análise destes genes utilizando Ingenuity Pathway Analysis, levou à identificação de várias redes de genes que contêm genes relacionados com as categorias funcionais “câncer”, “morte celular”, “ciclo celular”, “tráfico de RNA”, “desenvolvimento celular” “, célula sinalização “,” crescimento e proliferação celular “, e” movimento celular “. A partir da Enciclopédia Kyoto de genes e análise de caminho Genomas (KEGG), foram selecionadas as 5 principais vias que foram alterados em ambas as linhas celulares OVCAR-2 e OVCA420 e gerados um mapa da rede de interação proteína-proteína para estas vias. Usando via Studio, encontramos interações diretas entre 33 genes significativamente upregulated ou reprimidos (Tabela S6). A rede de interacções mostrou um número de genes que desempenham papéis supressores oncogénicos ou tumorais. Por exemplo, RRAS2, que codificam uma GTPase relacionadas com Ras com potencial de transformação semelhante ao de H-, K- e N-Ras, é um oncogene conhecido e tem sido implicado na patogénese de cancro humano. As vias que medeiam a tumorigénese induzida RRAS2 não estão bem estabelecidos, mas fosfoinositida 3-quinase, p38 MAPK, e mTOR vias têm sido implicados [40]. De particular interesse, RRAS2 e RRAS foram mostrados para promover a invasão via de sinalização da integrina nas células epiteliais da mama [41].
Demonstrámos previamente que as células epiteliais do ovário que expressam claudina-3 e -4 mostram aumento da capacidade de invasão
in vitro
[42], que foi mediada por sobre-expressão de MMP-2. De modo semelhante, em células de carcinoma hepatocelular, claudina-10 expressão promovido a sobrevivência celular, motilidade e invasividade, enquanto matriz de metaloproteinase 2 (MMP2) foi regulado para cima [43]. No entanto claudinas também têm sido mostrados para reduzir a invasão como claudina-4 expressão foi associada com uma redução na capacidade de invasão de células de cancro pancreático [44]. redução da expressão da claudina-7 tem sido correlacionada com a invasão tumoral e metástase no carcinoma epidermóide do esôfago e no cancro colorectal [13], [45]. Neste estudo verificou-se que
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knockdown levou a alterações na expressão de genes associados com várias funções, incluindo a migração /invasão. Em particular, acompanhando os resultados da análise via, mostramos que Raf-1, um gene previamente implicado na migração celular [46], [47], foi regulado para cima seguinte
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knockdown (Figura 6) . Erk-1 não foi encontrado significativamente elevados nestas condições, sugerindo que Raf-1 pode sinalizar através de outras vias a jusante em resposta a
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knockdown.
Com base em nossos dados de expressão, nós então investigado os possíveis papéis de
CLDN7
e encontrou efeitos sobre a invasão e migração
in vitro
. Na verdade, a capacidade de invasão foi significativamente reduzido após
CLDN7
knockdown e, inversamente, verificou-se um aumento após a superexpressão de
CLDN7
. Curiosamente, a migração foi encontrado para ser aumentada após
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knockdown (possivelmente por causa um aumento na Raf-1), e estes resultados aparentemente contraditórias (invasão vs migração) pode explicar as observações anteriores no campo. De fato, os papéis exatos de claudin sobre invasão ter permanecido controversa, pois alguns investigadores observar os efeitos positivos da claudinas na invasão e outros descobriram o oposto. Desde proteínas claudina são conhecidos por activar MMPs [42], [48], mas também têm um papel na adesão célula-célula [9] e em migração (conforme mostrado), o efeito líquido observadas podem representar o resultado destes efeitos opostos sobre invasão. Os nossos dados sugerem que, embora
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sobreexpressão pode diminuir a migração, o aumento na invasão devido a outros factores (tais como o aumento de activação de MMP) é dominante e leva a um efeito positivo líquido sobre a invasão de células no nosso sistema. Os mecanismos exatos da
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papéis na migração e invasão celular estão sob investigação, mas os nossos dados podem explicar algumas das discrepâncias na literatura.
Em resumo, descobrimos que
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é elevado na grande maioria dos cancros do ovário. Foram realizadas análises microarray para identificar alterações na expressão de genes associados com
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knockdown no câncer de ovário. Curiosamente, descobrimos que muitos genes e caminhos afetados pela
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expressão estão envolvidos na sobrevivência de células cancerosas, crescimento e invasão. ensaios de invasão e migração demonstrou efeitos claros de claudina-7 sobre o comportamento invasivo das células de cancro do ovário. A nossa análise de microarray fornece vários mecanismos possíveis através dos quais claudina-7 pode afectar a migração celular e invasão, e estes diferentes mecanismos estão actualmente a ser investigado. Para além da sua função de junção estanque, claudina-7 podem desempenhar papéis importantes num número de vias de sinalização envolvidos no cancro, crescimento celular, proliferação e ciclo celular. Dado o seu importante papel na carcinogênese ovário,
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pode ter um potencial significativo em aplicações de diagnóstico e terapêuticas.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Todos humano tecidos foram coletados por meio de um protocolo aprovado IRB (Instituto de Pesquisa MedStar IRB # 2003-103). Os tecidos foram recolhidos anonimamente e este protocolo foi isentos da obrigação de consentimento.
linhas celulares e Amostras de Tecido
linhas do cancro do ovário utilizados neste estudo, BG-1, UCI-101, HEY, Todos os ensaios foram realizados em triplicado.