Abstract

Fundo

normal homeostase do tecido é mantido por interações dinâmicas entre as células epiteliais e o seu microambiente. Perturbar essa homeostase pode induzir aberrante proliferação celular, adesão, função e de migração que pode promover um comportamento maligno. Na verdade, as interações do estroma-epitelial aberrantes contribuir para pancreático ductal adenocarcinoma (PDAC) propagação e metástase, o que levanta a possibilidade de que novas terapias alvo-estroma representam abordagens adicionais para a luta contra esta doença maligna. O objectivo do presente estudo foi determinar o efeito de células estromais humanas derivadas de tecido adiposo (ADSC) sobre a proliferação de células de tumor pancreático.

principais conclusões

Co-cultura de células de tumor de pâncreas com ADSC e médio ADSC condicionado amostragem de diferentes doadores inibiu a viabilidade das células de câncer e proliferação. ADSC efeito inibidor mediado foi ainda estendido a outras linhas celulares derivadas de cancro epiteliais (-fígado, do cólon, da próstata). ADSC meio condicionado induziu a necrose de células de cancro a seguir paragem na fase G1, sem evidência de apoptose.

In vivo

, uma única injeção intra-tumoral de ADSC em um modelo de adenocarcinoma do pâncreas induziu uma inibição forte e duradoura do crescimento do tumor.

Conclusão

Estes dados indicam que ADSC inibir fortemente a proliferação PDAC, tanto

in vitro

e

in vivo

e induzir a morte de células tumorais, alterando a progressão do ciclo celular. Portanto, ADSC pode constituir uma potencial alternativa terapêutica à base de células para o tratamento de PDAC para os quais nenhuma cura eficaz está disponível

Citation:. Cousin B, Ravet E, Poglio S, De Toni F, Bertuzzi M, Lulka H, et ai. (2009) células adultas estromais derivadas de tecido adiposo humano Tissue Provocar Câncer de pâncreas Cell Death ambos

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 4 (7): e6278. doi: 10.1371 /journal.pone.0006278

editor: Irene Oi-Lin Ng, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 24 de fevereiro de 2009; Aceito: 31 de maio de 2009; Publicação: 17 de julho de 2009

Direitos de autor: © 2009 Primo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da região de Midi-Pyrénées, Ligue Nationale Contre Cancer le e Cancrople Grand Sud-Ouest (EMERGEANCE). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

homeostase do tecido normal é mantida por interações dinâmicas entre as células epiteliais e seu microambiente. O microambiente consiste de matriz extracelular, células estromais, células do sistema imunológico e migratórias elementos neurais suportadas por uma rede vascular, tudo dentro de um ambiente de citocinas e factores de crescimento. Células interagem com o microambiente através de mecanismos autócrinos e parácrinos complexos. Várias evidências mostram que interromper este homeostase pode induzir aberrante proliferação celular, adesão, função e de migração que pode promover comportamento maligno [1] – [3]. Estudos recentes alteraram a percepção de que as células do estroma que rodeiam tumores epiteliais. Estas células não são espectadores ociosas, mas os participantes em vez ativos que moldam a frequência e as características dos tumores. Além disso, as células cancerosas em si podem alterar seu estroma adjacente para formar um ambiente permissivo e de apoio para a progressão do tumor [1] – [3].

células-tronco cancerosas e fibroblastos estromais são amplamente demonstrado para apoiar processo neoplásico [4 ] – [11], quando derivadas de medula células estaminais mesenquimais do osso (BM-MSCs) favorecem o crescimento do tumor indirectamente seguinte imunossupressão sistémica [12], ou a produção de citocinas pró-angiogénicos [13] – [15]. No entanto, os efeitos do BM-MSCs sobre a proliferação do tumor variam de acordo com o tipo de tumor: BM-MSCs promover mama, melanoma e câncer de cólon derivado proliferação das células [16], [17], quando inibir a

in vivo

o crescimento de células do sarcoma de Kaposi [18]. O tecido adiposo, como a medula óssea, contém células estromais chamados ADSCs para células estromais derivadas de tecido adiposo. Esta população compartilha muitas das características da BM-MSCs, incluindo efeitos imunomoduladores [19], e os potenciais de diferenciação multilinhagem [20] – [29]. Uma vez injectado

in vivo

, ADSCs exibem propriedades regenerativas, quer por participação direta nos tecidos recém-formados e /ou através da produção de fatores de crescimento que sustentam esta regeneração [23], [25], [30]. Embora as células do estroma da medula óssea e do tecido adiposo parecem estar intimamente relacionados, as diferenças notáveis ​​foram relatados [19], [31] – [34]. A capacidade de ADSCs para suportar a proliferação de células normais e de tumor é largamente debatidos.

In vitro

, expandidas ADSCs mediada supressão da proliferação de linfócitos alogénicos [35]. resultados contraditórios foram obtidos

in vivo

, quando co-injeção de ADSCs com câncer de mama, cólon, próstata, células derivadas de cancro do pulmão ou de glioblastoma não-pequenas levaram ao apoio inicial do crescimento do tumor [36] – [38]. Para clarificar esta discrepância, que estudaram o efeito de ADSCs em células derivadas de adenocarcinoma ductal pancreático. Entre os tumores sólidos, o adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é caracterizada pela sua extremamente densa infiltração desmoplásica [39], [40]. PDAC é uma doença altamente agressiva sem solução terapêutica, e ainda a quinta maior causa de mortes relacionadas ao câncer nos países ocidentais [41]. Como as interações do estroma-epitelial aberrantes contribuir para PDAC propagação e metástase, se a hipótese de que a segmentação do estroma tumor pode representar uma abordagem adicional para o tratamento de PDAC. Aqui, demonstramos a capacidade de ADSCs humanos (hADSCs) para reduzir o crescimento de células cancerosas PDAC-derivada,

in vitro

e

in vivo

, e para induzir a morte de células cancerígenas seguinte paragem na fase G1 .

Resultados

ADSCs humanos exercem um efeito inibidor sobre linhas de células derivadas de PDAC

primeiro, hADSC fenótipo foi determinado por citometria de fluxo (texto complementar S1), a fim de confirmar que as células utilizadas exibida características fenotípicas geralmente descritos para ADSCs [22], [23]. Com efeito, as análises de FACS confirmou que ADSC foram CD34, CD90, CD73 e HLA ABC positiva enquanto que CD45 e CD31 negativa (Figura Suplementar S1). Em seguida, determinou o

in vitro

efeito da hADSCs sobre o crescimento de células tumorais PDAC. Nós cultivaram células Capan-1-PDAC derivados na presença de ADSCs isoladas a partir de 25 doadores saudáveis ​​diferentes, utilizando membranas Transwell para evitar o contacto célula-a-célula. Após 48 horas de co-culturas, ADSC exibiu um efeito inibitório dependente da dose no número de células potente PDAC-derivada, tal como demonstrado na Figura 1A. De facto, o número de células de cancro do pâncreas foi significativamente reduzido de 36,5% ± 4,8% na presença de 01:01 proporção de ADSCs, quando em comparação com o controlo.

. O aumento da relação de células ADSC e Capan-1 foram co-cultivadas na presença de Transwell durante 48 horas em meio de crescimento completo. Capan-1 a proliferação das células foi então quantificada por contagem de células. Os valores são médias ± S.E.. de três experiências separadas com ADSCs de diferentes dadores. B. células cancerosas de diferentes origens foram cultivadas na presença de meio condicionado ADSC (CM) durante 48 horas. A viabilidade celular foi determinado por MTS usando o CellTiter 96® Aqueous One Solution celular Proliferação de Ensaio. Os resultados são expressos como percentagem dos valores obtidos em condições de controlo. Os valores são médias ± S.E.. de três experiências separadas realizadas com ADSC-CM a partir de diferentes dadores. C. células Capan-1 foram cultivadas durante 48 h com Capan-1, BM-MSC ou ADSC-CM. o número de células Capan-1 foi quantificada como em A. Os valores são médias ± S.E.. de três experiências separadas com ADSCs e MSC de diferentes dadores. *: P 0,05. ***; p . 0.001

O meio condicionado das ADSCs inibe a viabilidade de muitas células tumorais

A ausência de contacto directo célula a célula do nosso ambiente experimental nos levou a testar se ADSCs forma climatizados, (CM) também pode prejudicar a viabilidade de células do cancro. Com efeito, factores solúveis tenham sido previamente demonstrado para mediar o efeito imunossupressor de ADSCs humanos [19]. Como mostrado na Figura 1B, ADSC-CM, por si só inibiu significativamente não só a viabilidade de várias células derivadas de adenocarcinoma pancreático (Capan-1, Capan-2, BxPC3, MiaPaCa-2), mas também a viabilidade de células derivadas de carcinoma hepatocelular ( Huh7, HepG2), de células do cólon-derivadas de cancro (Caco-2), e da linha de células de cancro da próstata (PC3). Em contraste, ADSC cultura sobrenadante tinha um efeito pequeno, se algum, sobre as células Hela derivadas de cancro da cervical ou células MCF-7, uma linha celular de cancro da mama. Porque, as respostas observadas podem reflectir o esgotamento de nutrientes a partir de meios de comunicação e /ou acumulação não específica de metabolitos tóxicos, usamos o meio condicionado a partir de células cancerosas por si só como um controlo, juntamente com BM-MSC-CM. Em contraste com ADSC-CM, o tratamento de células cancerosas com qualquer Capan-1 ou BM-MSC-CM não prejudicar significativamente a viabilidade das células do cancro, embora a tendência de diminuição foi observada com o último (Figura 1C).

ADSC meio condicionado inibe a proliferação de células tumorais e induz a morte celular tumoral

Para analisar efeito potencial de ADSC-CM sobre a proliferação de células de cancro, Capan-1 foram incubadas na presença de BrdU com ou sem ADSC-CM. A análise FACS foi realizada após a desnaturação de células e a incubação com iodeto de propídio. BrdU é incorporado durante a fase S (portão P4), enquanto que a coloração com iodeto de propídio permite a discriminação entre 2N (G0 /G1, porta P2) e cromossomas 4N (G2 /M, portão P3) (Figura 2A). Os gráficos de pontos fechados em células individuais mostrou que o número de Capan-1 em células fase G0 /G1 tendeu a aumentar quando as células em fase S diminuiu significativamente em 10% na presença de ADSC-CM (Figura 2B).

A. células Capan-1 foram cultivadas com ou sem ADSCs adicionou-se meio condicionado. 48 horas mais tarde, a proliferação e conteúdo de ADN foram analisadas por citometria de fluxo utilizando a incorporação de BrdU e iodeto de propidio tal como descrito em Material e Métodos. gráficos de pontos são representativos de 3 experiências independentes realizadas com ADSCs amostra de doadores diferentes. B. Quantificação da análise do ciclo celular utilizando o software ModFit. Capan cultivadas em condições de controlo foram representadas em barras pretas em contraste com Capan tratada com ADSC-CM representado por barras abertas. Os valores são médias ± S.E.. de três experiências separadas com ADSCs de diferentes dadores. células C. Capan-1 foram semeadas em lâminas de câmara 4 durante 48 h com ou sem ADSC-CM. fragmentação de ADN foi medida pelo método TUNEL (representativos de três experiências separadas). D. Capan-1 cultivadas em meio de controlo (barras pretas) ou tratadas com sobrenadantes adsc (barras abertas) foram ensaiadas para anexina e iodeto de propídio rotulagem tal como descrito em Material e Métodos. Os valores são médias ± S.E.. de três experiências separadas com ADSCs de diferentes dadores. ***: P 0,001

A seguir, determinar se ADSC-CM poderia afetar a morte celular.. Para este fim, primeiro monitorizada a fragmentação do ADN em células Capan-1 pelo ensaio de TUNEL. Como mostrado na figura 2C, a fragmentação de ADN de células-derivadas PDAC foi fortemente induzida por ADSC-CM. A seguir, quantificado o número de células cancerosas que entram a apoptose e /ou necróticos após exposição a ADSC-CM. Os resultados apresentados demonstram que a Figura 2D ADSC-CM induziu um aumento de 3 vezes em células necróticas de iodeto de propídio,-positiva, sem evidência de apoptose precoce monitorizada por marcação da anexina. Mais uma vez, a partir de CM BM-MSC foi ineficaz em alterar significativamente a viabilidade de células tumorais (dados não apresentados).

morte de células tumorais induzida por meio condicionado ADSC é mediada pela inibição da progressão do ciclo celular

seguinte investigou o mecanismo pelo qual o ciclo de célula de tumor é preso por ADSC-CM. Medimos a expressão das principais proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular. Descobrimos que ADSC-CM induz uma profunda inibição da fosforilação de Rb em células Capan-1, sem efeito na expressão da proteína (Figura 3A, 3B). expressão visivelmente de CDK4 e ciclina D1, que são críticos para a fosforilação Rb, diminuiu concomitantemente. Expressão de Ciclina E, que não está envolvido na transição G1-S, permaneceu inalterada (Figura 3A; 3B). De importância, não foram observadas alterações nos níveis de expressão de caspase-3, caspase-8, caspase-9, caspase-6, caspase-7, e PARP, após o tratamento das células com ADSC-CM (dados não mostrados). Além disso, os níveis de expressão do citocromo C, Bcl2 BclXl e permaneceu relativamente inalterada em nossas condições experimentais (dados não apresentados).

. células Capan-1 foram cultivadas com ou sem ADSC-CMfor 48 horas. As proteínas foram então extraído e sujeito a imunotransf erência das proteínas indicadas, como descrito em Material e Métodos. Os resultados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes. B. Quantificação de densitometria de immunoblot em culturas de controlo (barras pretas) ou culturas tratadas com ADSC-cm (barras abertas). Os valores são médias ± S.E.. de três experiências separadas com ADSCs de diferentes dadores. *: P 0,05; **: P 0,01

ADSCs reduzir o

in vivo

crescimento de tumores pancreáticos humanos

A seguir, estendidos ADSCs actividades antiproliferativa à inibição de tumores pancreáticos. ,

in vivo

. Assim, os tumores humanos foram PDAC estabelecida em ratinhos atímicos após a injecção subcutânea de células Capan-1 como um modelo muito agressivo de PDAC [42], [43]. Catorze a 17 dias seguintes enxerto do tumor, uma dose única de ADSCs, correspondente a 10

3 ADSCs /mm

3 de tumor foi transferido

in vivo

em tumores em crescimento. Os tumores de controlo foram injectados quer com veículo ou com paraformaldeído (PFA) ADSCs fixos. Os tumores de controlo cresceram rapidamente, em média 4076 ± 556 milímetros

3 em tamanho por 28 dias após a implantação (Figura 4A, 4B). Em contraste, o crescimento de tumores Capan-1 que receberam injecção ADSC foi fortemente inibida (2556 ± 232 milímetros

3; Figura 4A, 4B). A inibição da progressão do crescimento do tumor pancreático atingiu -58% ± 8,9% (p 0,001), duas semanas após uma única injecção intratumoral de ADSCs (Figura 4C). O peso do tumor também foi significativamente reduzida após o implante ADSCs (controlo: 4,6 g ± 0,8 vs ADSCs tratados com 2,2 g ± 0,2, p 0,05). Como mostrado na Figura 4D, o crescimento de tumores injectados com veículo ou PFA-tratada ADSCs eram comparáveis, o que mostra que a inibição do crescimento do tumor não foi devido a um efeito não específico de dilacerações tumorais e dependente de secreção ADSC, respectivamente.

Capan-1 tumores foram implantados em ratinhos nus atímicos (quatro a seis animais por grupo) como descrito em material e Métodos. Duas semanas mais tarde, foram injectados ADSC dentro do tumor, e a progressão foi então monitorizada. A. representativas tumores ressecados a partir de ratinhos nus atímicos depois de 15 dias que não receberam tratamento (à esquerda) ou de uma dose única intra-tumoral de 5 × 10

5 ADSCs (direita). B. O volume de controlo (símbolos pretos) ou ADSC tratada (símbolos abertos) tumores foi monitorizado a cada 2 dias, até 28 dias após a implantação (13 dias após a injecção ADSCs). C. Percentagem de controlo (barras pretas) ou ADSC tratados (barras abertas) a progressão do tumor foi medido no momento indicado a seguir

in vivo

ADSCs injeção. D. Os tumores foram injetados ADSCs, quer com o veículo, PFA fixos ou ADSCs e sua progressão foi medido 6 dias após a entrega de células intratumoral. seções E. histológicos de tumores pancreáticos injetado ou não com ADSC foram analisadas para a proliferação de Ki67 imunocoloração (índice de marcação Ki67, painel superior) ou para a fragmentação do DNA pelo ensaio de TUNEL (painel inferior), 6 dias após a injeção ADSC. A percentagem de núcleos marcados foi medida em 15 campos de grande aumento (× 400), usando o sistema de análise de visiolab 2000. Todos os resultados foram representativos de 3 a 4 expericias independentes (3 a 5 tumores por grupo) realizados com ADSCs amostrados a partir de diferentes dadores saudáveis. Os valores são médias ± S.E.. *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,01

A seguir, investigou os mecanismos envolvidos nos efeitos de ADSCs humanos em tumores PDAC

in vivo

.. Os tumores tratados ou não com ADSCs foram processados ​​para imuno-histoquímica para o antígeno nuclear Ki67, a fim de detectar células em proliferação (figura 4E, painel superior), ou processado para análise de TUNEL para quantificar as células mortas (Figura 4E, painel inferior), 6 dias após a injecção . Quantificação de imunocoloração demonstrou uma diminuição significativa no número de células em proliferação, em tumores ADSCs-transferidos, quando comparado com o controlo (-66,5% ± 3,8%; P 0,01). Além disso, ADSCs induziu um aumento de 5 vezes na morte celular em tumores pancreáticos como medido pelo ensaio de TUNEL.

Discussão

Foi demonstrado no presente estudo que ADSCs humanos amostrados a partir de um grande painel de diferentes dadores saudáveis ​​auditivos eficientemente o crescimento de um cancro muito agressivo, isto é PDAC, tanto in

in vitro

e

in vivo

por inibição da proliferação de células de cancro e de promover a morte de células de cancro na sequência L

1 bloco monofásica. O efeito inibitório último foi estendido para linhas de células malignas a partir de diversas origens.

Vários do nosso

In vitro

observações relatadas aqui mostram que ADSCs têm a capacidade de interferir com a proliferação de células tumorais através da alteração a progressão do ciclo celular. O

in vitro

dados moleculares mostraram que as células tumorais que tinha estado em contacto com ADSC-CM estavam em um estado de repouso (G

0 /G

1), e para baixo regulada CDK4 e cyclinD1. Curiosamente, não fomos capazes de identificar qualquer extrínseco ou morte celular intrínseca mediada por apoptose após a exposição das células cancerosas para ADSCs meio condicionado. Esta capacidade de interferir com o ciclo celular já foi descrito para as células do estroma a partir de outras origens [44], [45]. Anormalidades do G

reguladores de transição 1-S, e mais especificamente da via Rb, têm sido reconhecidos como fatores importantes no desenvolvimento de cancros humanos. Por conseguinte, a modulação da CDK é um alvo importante para a prevenção e terapia de tumor que pode explicar porque ADSCs inibir a proliferação de células derivadas de vários cancros epiteliais.

O uso de ADSC como veículo em terapia génica do cancro foi recentemente proposto [36], [46], [47]. Na verdade ADSCs projetado para converter pró-fármaco anticancerígeno pode ser veículos eficientes para inibir de forma potente o crescimento do cólon ou próstata tumores humanos xenoenxertados [36], [46]. No entanto, apenas alguns estudos que mostram resultados conflitantes foram realizados com células naive isolados a partir de tecido adiposo [36] – [38], [48]. Estas discrepâncias podem ser explicadas pelo processo de isolamento e de passagem ADSC, o número de células injetadas e os procedimentos utilizados para

in vivo

ou

in vitro

estudos. Na verdade, em alguns estudos, ADSC foram injetados

in vivo

juntamente com as células cancerosas, é, portanto, difícil de comparar os efeitos de ADSC no tumor instalado (neste estudo) versus tumor em crescimento [36] – [38 ]. Além disso, alguns dados foram obtidos com células de rato [38] enquanto que o nosso modelo é feito de células de origem humana, e células cancerosas de diferentes origens foram usadas, embora nós demonstramos que ADSC-CM não afectou a viabilidade das células de tumor na mesma medida. Last but not least, a natureza da ADSC varia de acordo com os diferentes estudos, uma vez que na maioria dos casos foram utilizadas células subculturas [36] – [38], [48] enquanto realizamos experimentos com culturas primárias. Isto pode ser de importância como ADSC fenótipo e função potencialmente são modificados com passagens [49]. Esta variabilidade dos efeitos potenciais de células estromais sobre a proliferação de células de cancro, também foi descrito em estudos utilizando medula óssea as células estaminais mesenquimais [16] – [18], o que sugere que os diferentes mecanismos podem estar envolvidos de acordo com vários factores que continuam a ser identificado. Por exemplo, demonstramos aqui que a célula de contacto das células não é inteiramente necessário que efeitos anti-proliferativos foram observados tanto nos ensaios de co-cultura directa utilizando Transwell (nenhuma célula de contacto) e em experiências utilizando ADSCs meio condicionado. Em contraste, Khakoo

et al

recentemente demonstrado que a BM-MSCs exerceu um efeito potente sobre antioncogenic sarcoma de Kaposi através de celular para contato celular e Akt inativação [18]. Este foi mais tarde confirmada

in vitro

por Ramasamy

et al

[45].

A identificação dos mecanismos envolvidos nas células do estroma e câncer interações e especialmente o fator secretado responsável pelo efeito anti-proliferativo de ADSC está actualmente sob investigação. Muitos candidatos secretadas por ADSCs (tais como β1 TGF, SDF1, RANTES), interleucinas (tais como IL6, IL-1 β, IL8, GSF, IL11) ou as prostaglandinas (PGE2, PGI2, PGJ2) são conhecidos por exercer um anti-proliferativa /pró efeito -apoptotic. Estudos realizados com migratórias Capan revelou que ADSC-CM não apresentam actividade quimioatractora (Figura Suplementar S2 e S1 texto), sugerindo que o factor envolvido no efeito anti-proliferativo ADSC não é uma quimioquina. Recentemente, as PG têm sido demonstrados para mediar a inibição mista ADSCs reacção linfocitária [35]. Durante a preparação deste manuscrito, um estudo propôs que DKK-1 pode ser um desses fatores (48). IL-6 foi recentemente envolvida na protecção das células epiteliais normais e pré-malignas da apoptose no cancro associado a colite (50). Isto sugere que esta interleucina podem desempenhar papéis opostos, dependendo do estado inflamatório, o estágio do tumor e /ou tipo.

In vivo

, obteve-se um efeito anti-proliferativo, mas eficaz, mas transitória na progressão do tumor. ADSCs marcado com GFP foram detectados ao redor dos vasos tumorais periféricas e dentro acelular central e periférico e áreas de necrose do tumor, até 5 dias após a injeção (Figura Suplementar S3 e texto S1). Com base nesta observação, a concentração e /ou a semi-vida dos factores solúveis responsáveis ​​pelo efeito anti-proliferativa /anti-tumoral são, provavelmente, não é suficiente para manter as células tumorais num estado de repouso por um longo período de tempo, mas são adequados para inicialmente antagonizar a proliferação de células cancerígenas. Tal efeito transitório pode ser resgatado por injecção múltipla, intratumoral de ADSCs. Cumprindo as células humanas em um xenoenxerto rato com células cancerosas humanas pode resultar em uma resposta imunológica xenogenética não específica dentro do destinatário para neutralizar

in vivo

tumorigênese. No entanto, porque (i) células Capan-1 não expressam MHC de classe I e II (dados não mostrados), e (ii) o sistema imunitário ratinhos atímicos (apenas mediada por células NK) é menos importante do que em animais não imunes, que razoavelmente excluir uma resposta imune não específico no efeito observado. Considerando a capacidade da ADSC para participar na estrutura formação vascular-like [23], não podemos descartar um efeito pró-angiogénicos específico de ADSC no contexto do crescimento do tumor pancreático. No entanto, este efeito, se algum, parece ser menor na fase da doença, isto é, durante a fase exponencial de crescimento do tumor como testadas neste trabalho. Além disso, não fomos capazes de identificar alterações na densidade vascular, quer a partir de rato ou de origem humana, após a injecção intratumoral de ADSCs (dados não mostrados). mudanças alternativas em ADSCs fenótipo após injecção intratumoral devem ser cuidadosamente monitorizados. De facto, mostrámos que recentemente ADSCs rapidamente e maciçamente adquirida elevada actividade fagocítica e índice, quando injectados para dentro da cavidade peritoneal de ratinhos nus [51].

No total, o nosso trabalho representa o primeiro estudo utilizando células não-manipuladas para tratar PDAC. Este efeito anti-proliferativo em células de ADSC cancro do pâncreas é mediada, pelo menos em parte, por um factor secretado, mas também é tentador especular que

In vivo

ADSC pode modificar o microambiente do tumor e, assim, inibir a sua proliferação . Em conclusão, a capacidade ADSCs para bloquear G transição de fase 1-S

e, posteriormente, para inibir a proliferação de células cancerosas

in vitro

e

in vivo

pode ser uma abordagem eficiente e viável para o tratamento de 85% dos pacientes PDAC que não podem ser operados de forma curativa devido a uma doença localmente avançada.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

tecido adiposo humano foi obtido como resíduos de procedimentos de cirurgia estética. Todos os pacientes deram o seu consentimento por escrito. Os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética regional “Comité de protection des personnes Sud Ouest et Outre Mer I”.

Chemicals

Para a digestão do tecido adiposo, colagenase foi comprado da Roche (Roche Diagnostic, Alemanha). albumina de soro bovino (BSA), a dexametasona, ascorbato-2 fosfato, ácido pantoténico, e suplemento de selenito de insulina-transferrina-sódio foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. Quentin Fallavier, França). de soro de vitelo fetal (FCS), a tripsina, DMEM, RPMI-1640, fungizona, penicilina, estreptomicina, e PBS foram fornecidos por Invitrogen (Cergy-Pontoise, França). de soro bovino fetal (FBS) para a cultura ADSC foi comprado de Perbio (Paris, França). O agente antimycoplasma, Plasmocin ™ foi fornecida por Invivogen (Toulouse, França) |

cultura de células de tumor

Capan-1, Capan-2, BxPC-3, MiaPaCa-2 e Panc-1. As linhas celulares derivadas de PDAC humana foram cultivadas como descrito anteriormente [52]. células HuH7 e HepG2, derivadas de carcinoma hepatocelular, foram cultivados como descrito noutro local [53]. PC3 (cancro da próstata humano) e células Caco-2 (carcinoma do cólon humano) foram cultivadas em DMEM 1 g /l de meio de glicose, suplementado com FCS a 10%. HeLa (carcinoma cervical humano), foram cultivadas em DMEM a 4,5 g /l de meio de glicose, suplementado com FCS a 10%. Todos os meios foram suplementados com fungizona, antibióticos, L-Glutamina, e reagente antimycoplasma (Plasmocin ™, Invivogen). As células foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO2.

preparação ADSCs Humanos e da cultura

ADSCs humanos foram amostrados de 20 doadores saudáveis. fração vascular estroma foi isolado a partir de tecido humano adiposo obtido a partir de dermolipectomia abdominal no departamento de cirurgia plástica do Hospital Rangueil (Toulouse, França), como descrito anteriormente [19]. Resumidamente, as células SVF foram plaqueadas em frascos T75 durante a noite em DMEM-F12 (01:01) suplementado com 5% de FBS, 100 ug /ml de ácido pantotênico, 100 uM de ácido ascórbico, 16 uM de biotina, 250 ug /ml de anfotericina, 5 ug /ml de estreptomicina e 5 U /ml de penicilina. Após 24 h, as culturas foram lavadas extensivamente com PBS para remover as células não-aderentes residuais. crescimento HADSC foi perseguido até que as células atingiram 75% de confluência (passagem 0).

In vitro

de avaliação do número de células

50 × 10

3 Capan-1 células

foram cultivadas em meio RPMI completo durante 24 h em placas de 35 mm, antes de privação de soro durante 16 horas. As células foram cultivadas em triplicado na presença ou não de ADSCs ou meio de cultura BM-MSCs condicionado por mais 48 horas. As células de controlo foram cultivadas em meio DMEM-F12 (01:01) suplementado com FBS a 5%. O crescimento celular foi medida por contagem celular utilizando um contador de Coulter de modelo ZM. Para os ensaios de co-cultura, as células Capan-1 foram primeiramente semeadas em cultura de células com 4 ^ M insere poros (BD Biosciences) em meio completo durante 24 h. Após um passo de privação de 16 h, as células Capan-1 foram transferidas para placas de 35 mm na presença de ADSCs em diferentes proporções. Todos os experimentos foram realizados com ADSCs e MSCs purificadas de diferentes doadores saudáveis.

In vitro

viabilidade celular ensaio

As células alvo (15 × 10

3) foram cultivadas em meio completo em de fundo plano de placas de 96 poços durante 24 h, antes de privação de soro durante 16 horas. As células foram cultivadas em triplicado na presença ou não de forma ADSC-condicionadas durante mais 48 horas. As células de controlo foram cultivadas em meio DMEM-F12 (01:01) suplementado com FBS a 5%. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTS, de acordo com as recomendações do fabricante (CellTiter96 Aqueous Assay, Promega France, Charbonnières, França). As experiências foram conduzidas com ADSCs purificadas a partir de diferentes dadores saudáveis. Os resultados são expressos como percentagem dos valores obtidos em condições de controlo.

A citometria de fluxo de análise de proliferação e morte celular

Capan-1 As células foram cultivadas e tratadas com ADSCs-CM como descrito em

“in vitro de células avaliação número”

seção. As células foram incubadas com BrdU 10 uM (Sigma Aldrich) por 4 h a 37 ° C. Capan foram recolhidos, lavados uma vez com PBS, em seguida, fixado em gelo-etanol a 70% frio 1 h a 4 ° C. As células foram recolhidas por centrifugação a 600 g, lavadas em PBS contendo BSA a 0,5% e Tween-20 a 0,5%, e ressuspenderam-se em HCl 2N e incubou-se durante 30 min à temperatura ambiente. Após lavagem, as células foram suspensas em tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 9) para neutralizar o ácido residual. As células foram coradas com anticorpo monoclonal anti-BrdU (Becton Dickinson) durante 30 min à temperatura ambiente. Após as lavagens, as células Capan-1 foram ressuspensas em solução de coloração com iodeto de propídio (5 ug /ml) antes da análise de fluxo cyotmeter (CantoII, Becton Dickinson). Para anexina-V e detecção de iodeto de propídio, As células foram marcadas quer com anexina-FITC (FITC Apoptotest, DakoCytomation), ou iodeto de propídio (Invitrogen) de acordo com a recomendação do fabricante. Apoptótica e células necróticas foram quantificados usando um BD FACS Calibur (Beckton Dickinson) e software pro celular quest (Beckton Dickinson).

TUNEL

ensaios

A detecção de morte celular por ensaio TUNEL em Capan-1 tumores foi feito como descrito noutro local [42]. Para

In vitro

ensaios de morte celular, 50 × 10

3 células Capan-1 foram semeadas em lâminas de vidro em 4 poços (slides câmara Lab-Tek II, Nalge Nunc International, Naperville IL) em meio completo durante 24 h. Após privação de soro durante 16 horas, as células foram cultivadas em triplicado na presença ou não de ADSC-CM durante mais 48 horas. As células de controlo foram cultivadas em meio DMEM-F12 (01:01) suplementado com FBS a 5%. A detecção dos estágios iniciais da repartição cromossomo foi realizada utilizando Apopdetek, seguindo as recomendações do fabricante (ApopDETEK, ciências da vida Enzo, Farmingdale, NY, EUA).

Western Blot análise

As proteínas foram extraídas de células Capan-1, resolvidos em géis de SDS-poliacrilamida, e transferidos para membrana de nitrocelulose, tal como descrito noutro local [53]. Depois, à temperatura ambiente de bloqueio durante 1 h, as manchas foram incubadas com anticorpos adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Heidelberg, Alemanha) dirigido contra cyclinD1 (SC-124), CDK4 (SC-260), ciclina (SC-247), βactin (SC- 8432) ou desidrogenase glyceraldehydes-3-fosfato (GAPDH) (SC-24778). Rb e Rb anticorpos fosfoespec�ico eram da Cell Signaling Technology (Ozyme, St Quentin en Yvelines, França). Os anticorpos secundários conjugados com HRP (Perbio Science, Erembogdegem-Aalist, Bélgica) foram adicionados, e as manchas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente.