Abstract

RGS10 regula o crescimento de ovário célula cancerosa e sobrevivência, e RGS10 expressão é reprimida em modelos de células de cancro do ovário quimioresistência. No entanto, os mecanismos que regem a expressão RGS10 no câncer de ovário são mal compreendidos. Aqui relatamos a supressão RGS10 em cancro do ovário primário e Caov-3 células de cancro do ovário em relação às células epiteliais imortalizadas do ovário superfície (Iosé), e em células A2780 AD-quimiorresistentes em comparação com as células A2780 progenitoras. RGS10-1 e RGS10-2 transcritos são expressos em células de cancro do ovário, mas apenas RGS10-1 é suprimida em células A2780-AD e células Caov-3, e o promotor RGS10-1 é enriquecido exclusivamente em dinucleótidos CpG. inibição farmacológica de DNA metil-transferase (DNMTs) aumento da expressão RGS10, sugerindo regulação potencial de metilação do DNA. análise de sequenciação de bissulfito identificada uma região do promotor RGS10-1 com metilação de ADN significativamente melhorada em células A2780 AD-quimiorresistentes em relação a células A2780 progenitoras. A metilação do DNA em células Caov-3 e Iosé foi semelhante para as células A2780. Foram observadas diferenças mais acentuadas na acetilação das histonas do promotor RGS10-1. Histona H3 acetilada associada com o promotor RGS10-1 foi significativamente menor nas células A2780-AD em comparação com as células parentais, com um aumento correspondente na histona desacetilase (HDAC) associação enzima. Do mesmo modo, os níveis de histonas acetiladas no promotor RGS10-1 foram marcadamente inferior em Caov-3 células em comparação com as células Iosé, e a ligação de HDAC1 foi duplicada em células Caov-3. Finalmente, mostra-se que a inibição farmacológica de enzimas HDAC em DNMT ou células A2780 AD-quimiorresistentes aumenta a expressão RGS10 e aumenta a toxicidade da cisplatina. Estes dados sugerem que a histona de-acetilação e metilação do DNA correlaciona com supressão RGS10 quimiorresistência e no cancro do ovário. Marcadores para perda de expressão RGS10 pode identificar células cancerosas com resposta única à terapêutica

Citation:. Ali MW, Çaçan E, Liu Y, Pierce JY, Creasman WT, Murph MM, et al. (2013) Supressão da transcrição, DNA metilação e histona desacetilação do Regulador de G-proteína de sinalização 10 Gene (RGS10) em células de câncer de ovário. PLoS ONE 8 (3): e60185. doi: 10.1371 /journal.pone.0060185

Editor do Academic: James Porter, da Universidade de Dakota do Norte, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de novembro de 2012; Aceito: 22 de fevereiro de 2013; Publicação: 22 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ali et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento para este trabalho foi fornecido por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (CA151006 a SBH e MM, CA131200 para Ste), a American Cancer Society (para SFG), eo Rivkin Centro de Marsha para Ovarian Cancer Research (a SBH). (Www.nih.gov/, www.cancer.org/, www.marsharivkin.org/) Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As células cancerosas explorar o crescimento mediado por receptores múltiplos e sobrevivência vias de sinalização para evadir respostas normais quiescência e morte celular. A amplificação destas vias é um mecanismo comum na progressão do cancro. A activação dos receptores acoplados à proteína G pelo ligandos de ácido lisofosfatídico (LPA), a endotelina, estromal de crescimento derivado factor-1 (SDF1), prostaglandinas, e a trombina contribui para a progressão de vários cancros, e os fármacos que bloqueiam estes receptores estão actualmente em diferentes fases de ensaios clínicos como agentes terapêuticos do cancro [1]. Estes GPCRs iniciar o crescimento e sobrevivência cascatas de sinalização ativando proteínas G celulares. actividade de proteína G é terminada pelo regulador de sinalização de proteína G (RGS) proteínas que desactivar rapidamente proteínas G e controlar a intensidade e a duração de vias-GPCR iniciadas [2]. proteínas RGS que suprimem sinais oncogênicos mediados por ligantes de GPCR estão preparados para inibir o crescimento do câncer. Com efeito, as proteínas RGS específicos têm sido mostrados para suprimir o crescimento estimulada por receptor e na sobrevivência de sinalização da mama, da próstata, e cancro do ovário [3] – [5]

o cancro do ovário é a principal causa de morte por cancro ginecológico. ea quinta causa mais comum de morte por câncer em mulheres. Menos de 50% dos pacientes com câncer de ovário sobrevivem cinco anos após o diagnóstico [6]. Embora o cancro do ovário é caracterizada por uma elevada taxa de resposta à quimioterapia, a sua elevada taxa de mortalidade é em grande parte devido ao desenvolvimento de resistência aos agentes quimioterapêuticos de primeira linha [7]. A maioria dos doentes que respondem inicialmente à quimioterapia com recaída da doença resistente à quimioterapia, no prazo de dois anos [8]. Compreender as alterações moleculares e genéticos que conduzem a progressão do câncer de ovário e o desenvolvimento de chemoresistance adquirida pode levar a estratégias para prever e evitar a ocorrência de doença refratária.

Temos demonstrado que as proteínas RGS endógenos suprimir o crescimento de células de câncer de ovário, a migração e a activação da MAP cinase em resposta ao LPA, um factor de crescimento autócrino importante no cancro do ovário [3], [9]. Mais recentemente, foram identificados RGS10 como um importante regulador da sobrevivência celular e quimioresistência. RGS10 expressão transcrição é regulada negativamente em vários modelos de quimioresistência adquirida em cancro do ovário, e os niveis de expressão RGS10 alterar a sensibilidade de células de cancro do ovário a cisplatina e taxano citotoxicidade [10]. Estas observações sugerem que a supressão da expressão RGS10 pode contribuir para a progressão do cancro do ovário e o desenvolvimento de quimioresistência amplificando crescimento mediada por GPCR e os percursos de sobrevivência de sinalização. No entanto, o mecanismo de supressão da expressão RGS10 em cancro do ovário não foi estabelecida.

RGS expressão da proteína é regulada de forma dinâmica em sistemas neural e cardiovasculares [11] e na progressão do cancro [12], permitindo o controle sobre o complexo GPCR vias de sinalização. Transcricional e mecanismos pós-traducionais de controlo de expressão são bem definido RGS [13] – [16], enquanto que o controle de expressão epigenética RGS por modificações covalentes de ADN ou histonas tem sido amplamente inexplorado. Gene silenciamento por metilação de ADN e histona desacetilação é um mecanismo estabelecido na progressão de muitos cancros [17], incluindo o cancro do ovário [18] – [20]. A adição de grupos metilo para dinucleótidos CpG por ADN-transferase metil enzimas (DNMT) e a remoção de grupos de acetilo nos resíduos de lisina em proteínas histona desacetilase de histona (HDAC) As enzimas coordenadamente suprimir a actividade de transcrição [21]. A metilação do DNA e aumento da expressão de DNMT na progressão do cancro do ovário [22], e histona desacetilases (HDACs) também são sobre-expressos em tecidos de cancro do ovário [23]. Isto sugere que a regulação epigenética de genes RGS também podem contribuir para a sua expressão dinâmica na progressão do cancro.

No presente estudo, foi investigada a regulação epigenética da expressão RGS10 em células de cancro do ovário. Nós nos concentramos em dois modelos de supressão RGS10 – 3 Caov-células de cancro do ovário em comparação com células benignas do ovário epiteliais e células A2780-AD quimiorresistentes e suas células parentais quimiossensíveis. Identificamos aumentos significativos na metilação do DNA em células quimiorresistentes, e uma diminuição marcada na acetilação das histonas e aumentos em associação HDAC1 no promotor RGS10 em ambas as células Caov-3 e A2780-AD. Os nossos resultados sugerem que as modificações das histonas epigenética pode contribuir para a perda de expressão RGS10 em células de cancro do ovário, e que a metilação de ADN pode contribuir para uma maior perda de expressão durante quimiorresistência adquirida.

Procedimentos Experimentais

Células e reagentes

Caov-3 e SKOV-3 foram adquiridos a American Type Culture Collection (ATCC) e mantida em meio de Dulbecco modificado de Eagle (ATCC) e meio de McCoy 5A (Mediatech, Inc.), respectivamente, suplementado com FBS a 10% (PAA Laboratories, Inc.). A linha de quimiossensíveis A2780 parental célula e suas células A2780-AD multi-resistente a medicamentos de contrapartida filha (derivado como descrito [24]) foram generosamente fornecidos pelo Dr. Bob Brown, Imperial College London. Estas células foram mantidas em meio RPMI 1640 (ATCC) suplementado com 10% de FBS e 5 mM de L-glutamina. As células foram adicionalmente resistente à quimioterapia, mantida em 1,5 pM de cisplatina. células epiteliais da superfície do ovário imortalizados (Iosé-80, [25]) foram generosamente fornecidos pelo Dr. Nelly Auersperg (University of British Columbia) e mantido no Media 199: MCDB 105 (01:01) suplementado com 15% FBS. Todas as células foram cultivadas em 5 mM de penicilina-estreptomicina a 37 ° C com dióxido de carbono a 5%.

5-aza-2′-desoxicitidina e cisplatina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Os anticorpos que reconhecem de histona H3 e histona H3 acetilada eram da Millipore (Lake Placid, NY). Anticorpo que reconhece histona H3 (acetil K18) foi de Abcam (Cambridge, MA). Os anticorpos que reconhecem RGS10 e HDAC1 foram obtidos de Santa Cruz (Santa Cruz, CA).

Viabilidade celular Ensaios

1 × 10

4 A2780 ou A2780-AD células foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços e deixadas a aderir durante 24 horas antes do tratamento com as concentrações indicadas de cisplatina durante 48 horas. ensaio de viabilidade celular foi realizado em meio sem soro contendo reagente CellTiter-Blue® (Promega Corporation) como anteriormente descrito [10].

Quantitative real-time PCR

O ARNm foi isolado utilizando o reagente Trizol ( Invitrogen) e o ADNc foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total utilizando o kit High Capacity cDNA de transcriptase reversa (Applied Biosystems /Life Technologies). reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo foi realizado usando o kit Superscript III para RT-PCR (Invitrogen) e o reagente de alimentação SYBR Green (Applied Biosystems). As reacções foram normalizados utilizando o gene GAPDH de limpeza e os cálculos foram realizados de acordo com o 2

-ddCT método. mudança vezes na expressão foi determinada em triplicado em três experiências independentes e repetições experimentais foram testados para diferenças significativas entre os grupos utilizando testes t pareados. Os iniciadores utilizados foram baseados em sequências geradas por algoritmos de Primer Bank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). RGS10 Forward: GAC CCA GAA GGC GTG AAA AGA, RGS10 reversa: GCT GGA CAG AAA GGT CAT GTA GA, RGS10 variante-1 Forward: CCC GCG GCG ATG TTC AAC C, RGS10-variant-1 reverso: CTC CAG GGA TGC CGC CCA TT, RGS10-variant-2 Forward: TGC GTG GAA CTT CTC AGG TGG ACA, RGS10 variante-2 reversa: CCG CCC ATT TGG CTG TGC TCT, RGS2 Forward: AAG ATT GGA AGA CCC GTT TGA G, RGS2 reversa: GCA AGA CCA TAT TTG CTG GCT, RGS5 Forward: CCC ACT CAT GCC TGG AAA GG, RGS5 reversa: CTT GGC TGG TTT CTC TGG CT, GAPDH Forward: GCC AAG GTC ATC CAT GAC AAC T, GAPDH reversa: GAG GGG CCA TCC ACA GTC TT.

para determinar o efeito da exposição a 5-Aza-2′-desoxicitidina em expressão transcrição RGS, 7 × 10

5 células SKOV-3 foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 100 mm e deixadas a aderir durante a noite. No dia seguinte, o meio foi aspirado e substituído com 20? M de 5-aza-2′-desoxicitidina em controlo de veículo de DMSO ou DMSO. Após 3, 5, 7 e 9 dias de incubação de drogas, o meio foi aspirado e foi adicionado 7 mL Trizol reagente (Invitrogen). isolamento do RNA, a síntese de DNA, e qRT-PCR foram realizadas como acima.

isolamento de células do cancro do ovário De peritoneal ascite

ascite peritoneal de pacientes com câncer ovariano na Medical University of South Carolina (MUSC ) foram obtidos em MUSC Institutional Review Board (IRB) protocolo # 18983, que incluiu uma revisão da ética do estudo e, especificamente, aprovou o estudo. Este protocolo envolve a utilização de amostras humanas identificou-de para o estudo da expressão e modificação de proteínas envolvidas na sinalização celular e resistência a drogas em células de cancro do ovário primárias. Remoção de ascite peritoneal é um padrão de tratamento para pacientes com câncer ovariano e ascite são normalmente descartados. Todas as amostras recebidas foram de-identificados antes da entrega para o pessoal de laboratório. Os pacientes foram informados sobre a opção de participar no estudo e consentimento verbal foi obtido pelo médico. consentimento por escrito foi considerado um risco ao paciente confidencialidade por parte do IRB, desde a assinatura de um termo de consentimento para permissão para usar uma amostra identificou-de seria o único registro de identidade e participação do paciente e, portanto, o único risco de uma quebra na confidencialidade do paciente. Um registro de amostras recebidas no laboratório foi registrada apenas pela data de colheita. Remoção de ascite peritoneal é um padrão de tratamento para pacientes com câncer ovariano. Nenhuma informação paciente identificação foi obtida por pesquisadores no laboratório. ascite peritoneais foram centrifugadas a 1000 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente e os peletes de células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células sanguíneas vermelhas foram lisadas em tampão de lise de RBC (eBioscience, San Diego, CA) durante 5 min à temperatura ambiente. O tampão de lise foi diluída com PBS, as células centrifugadas como acima e resuspensas em meio RPMI com 10% de FBS. As células foram incubadas durante 1 h a 37 ° C com 5% de CO2 para permitir a ligação dos fibroblastos e macrófagos. células epiteliais não ligadas foram removidos e incubados separadamente em meio RPMI completo contendo 10% de soro fetal de bovino.

Rgs10 Imunotransferência

Para avaliar a expressão RGS10 em ascites e células primárias Iosé, os lisados ​​celulares foram gerados em RIPA tampão (pH 7,4, 10% de glicerol, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X100, 0,5% de SDS, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM, Na4P2O7 5 mM, β-glicerofosfato 40, NaF 50 mM, de fenilmetilsulfonilo 50 mM de Tris 2 mM fluoreto e aprotinina). Depois de sonicação e centrifugação, quantidades iguais de proteína solúvel foram corridos num gel de SDS-PAGE 10-12%, transferidos para nitrocelulose, e imunotransferidas com anticorpo RGS10. Para avaliar a expressão em linhas celulares RGS10, 10

5 as células foram lisadas em tampão de amostra de SDS-PAGE. Os lisados ​​foram fervidas durante cinco minutos e foi analisada utilizando SDS-PAGE. As membranas foram incubadas com anticorpos primários RGS10 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) e anticorpos secundários de coelho conjugados com HRP (Pierce) e visualizada utilizando reagentes ECL (Pierce). As membranas foram posteriormente apagado com anticorpos GAPDH (Life Technologies) como um controlo de carga.

Bissulfito Sequencing

O site Methprimer [26] (https://www.urogene.org/methprimer/index1 .html) foi utilizado para analisar o conteúdo CpG de promotores RGS e para desenhar iniciadores dirigidos a diferentes regiões do promotor RGS10-1. Quatro pares de primers diferentes foram projetados, RGS10-BS1, RGS10-BS2, RGS10-BS3 e RGS10-BS4: RGS10-BS1forward: AAG AAA ATG GGG GTT AAT GAT ATT T, RGS10-BS1reverse: TAC CTC TAA CAA AAC CTT CAA ACT C , a região de amplificação RGS10-BS1: -121.303.236–121.303.086. RGS10-BS2forward: TGT TTT TAA AGT TAG AGA AGT GTT T, RGS10-BS2reverse: CAC AAA CTA AAA AAC CTA AAC CTC, a região de amplificação RGS10-BS2: -121.303.076–121.302.726. RGS10-BS3forward: GAG GAG GTA AAG GTT ATA GGT TGG, RGS10-BS3reverse: AAA TAC ACT AAC CCA AAA AAA ACC CC, a região de amplificação RGS10-BS3: -121.302.800–121.302.514. RGS10-BS4forward: GTT TGG TTA GGA GGA GG, RGS10-BS4reverse: CTC CAA TCT AAA AAA TAC CAC, a região de amplificação RGS10-BS4:. -121.302.327–121.301.988

O DNA genômico foi colhida a partir de células e bisulfite- convertidos utilizando Kit EZ DNA metilação-direta (Zymo Research Corp). ADN ZymoTaq ™ polimerase (Zymo Research Corp) foi utilizada para amplificar diferentes regiões em RGS10 promotor de ADN genómico tratado com bissulfito e produtos de PCR foram analisados ​​por geles de ADN-agarose a 2,5% e purificado utilizando PureLink Breve Gel Extraction e Kit de PCR Purificação de combinação (Invitrogen ). Os produtos purificados foram ligados em plasmídeos utilizando StrataClone PCR Cloning Kit (Agilent Technologies), que foram, em seguida, transformados em bactérias competentes. 20 colónias individuais foram isolados a partir de carbenicilina placas de LB-agar e expandido. QIAprep spin kit miniprep (Qiagen Amostra Ensaio Technologies) foi usado para purificar os plasmídeos de cada colónia, as quais foram, em seguida, enviado para a sequenciação utilizando T7 e /ou T3 promotor iniciadores de sequenciação em UGA Genomics Facility. sequências de clones foram submetidos a telas de qualidade e conversão completa, e alinhados ao DNA promotor RGS10 genómico utilizando software BIQ Analyzer [27].

Cromatina imunoprecipitação (chip) Ensaio

As células foram colocadas em uma densidade de 2,5 x 10

6 em placas de cultura de 15 cm do tecido e reticulado com 1% de formaldeído durante 8 minutos à temperatura ambiente. A reacção de reticulação foi terminada pela adição de 0,125 M de glicina durante cinco minutos à temperatura ambiente. núcleos celulares foram isoladas e concentradas por lise em tampão de lise de SDS fresco (SDS a 1%, EDTA a 10 mM, Tris 50 mM, pH 8,0, dH

2O) mais inibidores de protease, durante 25 minutos em gelo, seguido de congelamento de flash em azoto líquido. Os núcleos foram sonicadas usando um Bioruptor banho de água sonicador durante 30 segundos “On”, 30 seg “Off” 3X para gerar uma média de 500 pb de DNA cortado. tosquia ADN foi confirmada submetendo os lisados ​​a electroforese em gel de agarose a 1% e visualização por coloração com SYBR segura. Os lisados ​​foram então sonicados pré-aclarados com grânulos de salmão-esperma /agarose (Upstate) e 5% do total de lisado foi armazenada como uma entrada para a normalização. Metade do lisado remanescente foi imunoprecipitada com 5 ug de anticorpo indicado durante a noite a 4 ° C e a outra metade foi imunoprecipitada com anticorpo de controlo. Na sequência de uma imunoprecipitação adicional de duas horas com 60 uL de revestido salmão esperma-esferas de agarose, todas as amostras foram lavadas com cada um dos seguintes tampões: tampão de baixo teor de sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 2 mM de EDTA, 20 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, de dH2O), tampão de alto teor salino (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM, de dH2O), LiCl (0,25 M de LiCl, 1% NP40, 1% de DOC, EDTA 1 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, dH 2 O), e 1xTE. O ADN foi eluído com tampão de eluição de SDS (SDS a 1%, NaHCO3 0,1 M, de dH2O). Após eluição, ligações cruzadas foram revertidas durante a noite com 5 M de NaCl a 65 ° C e o ADN foi isolado imunoprecipitadas utilizando fenol: clorofórmio: mistura de isopropanol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. ADN isolado foi quantificado por PCR em tempo real num ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando os seguintes iniciadores e sonda para a frente: RGS10, 5′-GGA AGT ACC GCG CCT CAC-3 ‘, reverso, 5’ -CCC GGA GCT CTA GGT CCC-3 ‘e sonda, 5′-TGG CTA GGA GGA GGG CGG CG-3′; e para GAPDH: encaminhar, 5’-AAT GAA TGG GCA GCC GTT A-3 ‘, reverso, 5′-TAG CCT CGC TCC ACC TGA CT-3′ e sonda, 5’-CCT GCC GGT GAC TAA CCC TGC GCT CCT -3 ‘. Valores gerados a partir de reações de PCR em tempo real foram calculados com base nas curvas padrão geradas, foram executados em reações triplicado, e foram analisados ​​usando o programa SDS 2.0.

Resultados

Supressão Do Rgs10 expressão no câncer de ovário células

Os nossos dados anteriores demonstraram downregulation de transcritos RGS10 em linhas celulares de cancro do ovário com chemoresistance adquirida [10]. Para determinar se RGS10 também é regulada negativamente em células de cancro do ovário primárias, que imunotransferidas lisados ​​de o, células imortalizadas Iosé benigna e a partir de seis amostras de células epiteliais do cancro do ovário isolados primários a partir de ascites de doentes (Figura 1A). a expressão da proteína RGS10 foi marcadamente mais baixa em células de cada paciente, o que sugere que a expressão RGS10 é suprimida na clínica do cancro do ovário. Uma vez que as amostras do paciente são heterogéneas e não renovável, a sua utilização na definição dos mecanismos de supressão é limitada. Para estabelecer um modelo de células renovável, homogénea da perda de expressão RGS10 em cancro do ovário, comparamos RGS10 expressão em células Iosé e a linha celular de cancro epitelial de ovário seroso Caov-3 (Figura 1B, C). RGS10 transcrição e proteínas foi significativamente menor no Caov-3 células, em comparação com células de controlo Iosé.

A. células cancerosas do ovário foram isolados a partir de ascites malignas do paciente e os níveis de expressão RGS10 foram comparadas com células Iosé através de Western blotting. B.-C. RGS10 transcrição (B) e os níveis de expressão de proteína (C) foram comparadas em Caov-3 linhas de células de cancro do ovário e células epiteliais do ovário benignos Iosé utilizando qRT-PCR e transferência de Western. D. Cisplatina curvas de dose-resposta foram determinadas usando ensaios de viabilidade CellTiter-Azul em células A2780 e A2780-AD. E.-F. RGS10 transcrição (E) e os níveis de proteína (F) foram comparadas em células A2780 AD-quimiorresistentes em relação à sua linha de células parental A2780 quimiossensíveis. **: P 0,01, ***:. P 0,0001

A nossa observação anterior que RGS10 é suprimida em células quimiorresistentes foi feita em conjuntos de dados de expressão de transcritos publicados de pares de células de cancro do ovário quimiossensíveis e quimiorresistentes [ ,,,0],10]. Para o estudo atual, obteve-se células de cancro do ovário A2780 e sua multi-resistente derivado A2780-AD. células A2780-AD foram derivadas de células A2780 parentais através da exposição crônica à droga citotóxica baixa dose, e, portanto, representam um modelo para chemoresistance adquirida [28], [29]. Foi confirmada a perda de sensibilidade para a citotoxicidade induzida por cisplatina em células A2780-AD, e demonstraram que a transcrição e expressão de proteína RGS10 é reduzido em células A2780-AD em comparação com as células A2780 progenitoras (Figura 1 D-F). Tomados em conjunto, transcrição e expressão de proteína RGS10 é reduzida em células de cancro do ovário primário e o Caov-3 de células de cancro em relação a linha de células epiteliais imortalizadas do ovário, células A2780 e em relação às células parentais. Estamos focados os seguintes estudos sobre estas duas comparações.

Rgs10 Promotores

O gene RGS10 humana reside na cadeia negativa do cromossomo 10 e contém dois locais de início da transcrição, dando origem a duas transcrições distintas e produtos do gene (Figura 2A, B). As variantes têm únicas primeiros exons, e compartilhar quatro exons comuns. O transcrito já não RGS10-1 dá origem a um 21 RGS10a kDa contendo 181 aminoácidos. Quanto mais curto RGS10-2 variante transcrição dá origem a um RGS10b 19,5 kDa composta por 167 aminoácidos. Apenas uma única banda imunorreactiva RGS10 é detectável em células do ovário, e é consistente com o peso molecular previsto de RGS10a (Figura 1). Para determinar se ambas as transcrições são detectáveis ​​e semelhante suprimida em cancro do ovário, foi realizada qRT-PCR utilizando iniciadores específicos de variantes. Ambos os longas e curtas transcritos foram detectados em todas as linhas celulares por qRT-PCR, mas RGS10-2 foi expressa em níveis muito mais baixos do que RGS10-1. expressão transcrição RGS10-1 em Caov-3 células de cancro do ovário é de aproximadamente 20% do nível de expressão observado nas células Iosé, comparável à redução observada dobra para transcrição total de RGS10. No entanto, o transcrito mais curto, RGS10-2, não é significativamente diferente entre as duas linhas de células (Figura 2C). Além disso, a expressão RGS10-1 transcrição foi regulada negativamente na linha celular derivada A2780-AD resistente à quimioterapia, enquanto que os níveis RGS10-2 foram aumentados (Figura 2D). Estes resultados sugerem que a supressão da RGS10 transcrição em Caov-3 e células de cancro do ovário A2780-AD é exclusivo para RGS10-1, e sugere que o mecanismo pode ser direcionados para a região promotor único.

A. O gene RGS10 (geneID: 6001) localiza-se na cadeia negativa do cromossoma 10 (de acesso NCBI: NC_000010.10) na posição -121.302.222–121.259.339. Duas variantes de transcrição RGS10-1 (adesão: NM_001005339) e RGS10-2 (adesão: NM_002925) têm sido relatados para RGS10 baseado em sítios de iniciação alternativo que resultam em primeiros exões distintos. B. O isoformas da proteína resultante RGS10a (adesão: NP_001005339) e RGS10b (adesão: NP_002916) variam de acordo com apenas os primeiros 18 ou três aminoácidos. O domínio RGS conservada é sublinhado. CD. A expressão do transcrito total de RGS10 (RGStot), RGS10-1, e RGS10-2 foram determinados em células Iosé e Caov-3 (C) e em células A2780 progenitoras e células A2780 AD-quimiorresistentes (D). **: P 0,01, ***:. P 0,0001

metilação de DNA de Rgs10 Promotores em células de cancro do ovário

Promotores contendo G-C ricos “ilhas CpG” tipicamente têm baixos níveis de metilação em tecidos normais, mas tornam-se hipermetilado durante a progressão do cancro [30], [31], sugerindo que os genes com ilhas CpG nos seus promotores são alvos potenciais para o silenciamento transcricional por metilação do DNA promotor em células cancerosas. Análise de uma região 1 quilobase a montante dos locais de iniciação de transcrição e de 0,5 quilobases a jusante dos locais de iniciação dos transcritos RGS10-1 e RGS10-2 revela uma notável diferença no conteúdo GC e o número de dinucleótidos CpG entre as duas regiões promotoras RGS10 ( Figura 3A). A região promotora de RGS10-1 contém 60-80% de teor de GC e inclui cerca de 120 dinucleótidos CpG, enquanto o promotor RGS10-2 contém menos de 30. Em comparação, a análise do promotor RGS2 tem um conteúdo similar ao CpG RGS10-1, enquanto o promotor de RGS5 contém alguns dinucleótidos CpG.

a. As regiões promotoras de RGS10-1, RGS10-2, RGS2, e RGS5 foram analisadas quanto ao teor de CpG utilizando o site Methprimer. Para cada um promotor, uma região do ADN genómico de 1000 pares de bases 5 ‘do local de início da transcrição e 500 pares de bases a 3’ do local de início foram avaliadas quanto teor percentual de GC e dinucleótidos CpG individuais. posição de nucleótido está indicado ao longo do eixo-x conteúdo GC e é representada graficamente no eixo Y; ilhas CpG estão indicados com sombreado. Cada dinucleótido CpG é indicado por uma marca de hash abaixo da numeração de nucleótidos, e o local de início da transcrição está indicado com uma seta. regiões de amplificação para quatro pares de primers de seqüenciamento bissulfito são indicados por barras horizontais (BS10-1, BS10-2, BS10-3, BS10-4). B. células SKOV-3 foram tratados com veículo ou o inibidor DNMT 5-Aza por nove dias, e os níveis de transcrição da RGS indicados e controles GAPDH foram medidos em 3, 5, 7 e 9 dias de tratamento. A transcrição RGS foi normalizado para o GAPDH, e é representada graficamente em relação à expressão nos controlos tratados com veículo em cada ponto de tempo.

A concentração elevada de dinucleótidos CpG no promotor RGS10-1 sugere que o gene é RGS10 um alvo potencial para a regulação por enzimas DNMT e pode ser suprimido na progressão do cancro do ovário por metilação de DNA aumentada. Para testar esta previsão, determinou-se o efeito de inibição de metilação do DNA na expressão RGS10. O DNMT inibidor de 5-aza 2’desoxicitidina (5-Aza) bloqueia a adição de grupos metilo para dinucleótidos CpG no ADN sintetizado de novo de células em proliferação [32]. Assim, os efeitos de 5-Aza sobre a metilação do DNA e a expressão do gene são manifestos depois de vários ciclos de divisão celular. As células foram tratadas com veículo ou 5-Aza para um total de nove dias, e o efeito sobre os níveis de transcrição de RGS10-1, RGS2 e RGS5 foi determinado de dois em dois dias. Consistente com as previsões ilha CpG, expressão RGS5 não muda com 5-Aza tratamento, enquanto RGS10-1 e RGS2 níveis de transcrição são de aproximadamente 8 vezes superior em 5-Aza células tratadas em comparação com as células tratados com veículo (Figura 3B). Este resultado sugere que as enzimas DNMT provavelmente contribuem para a supressão dos níveis de transcrição RGS10-1.

Bissulfito sequenciação do Rgs10-1 Promotores

Nós ainda previu que a frequência de metilação no promotores RGS10-1 faria ser maior em células de cancro do ovário com níveis de expressão mais baixos RGS10-1. resíduos de citosina metilados e não-metilado são distinguíveis por tratamento com bissulfito, que converte não metilado, mas não metilado, bases de citosina em uracilo. Nós primeira realizada seqüenciamento bissulfito para comparar a frequência de metilação do DNA de promotores RGS10-1 entre A2780 parental e as células quimiorresistentes A2780-AD. ADN genómico-bissulfito tratado foi amplificado utilizando-se quatro pares de iniciadores que se sobrepõem concebidos para cobrir integralmente a partir de uma região de 1000 pares de bases a montante de 200 pares de bases a jusante do local iniciar RGS10-1 transcricional. Os clones isolados de ADN genómico tratado com bisulfito foram sequenciados e alinhados com o ADN genómico utilizando o software BIQ Analyzer para determinar o estado de metilação de CpG em cada local do promotor RGS10-1 em pelo menos 10 clones. Os resultados obtidos com o par de iniciadores BS10-2 são mostrados na Figura 4, e os resultados obtidos utilizando BS10-1, BS10-3, e BS10-4 são mostrados na Figura S1.

ADN genómico promotor RGS10 foi alinhado com sequências individuais de produtos de PCR clonados a partir de amplificação BS10-2 par de iniciadores de ADN tratado com bisulfito genómico a partir das linhas celulares indicadas. As sequências foram submetidos à análise de controle de qualidade e alinhadas usando software BIQ Analyzer. Nesta representação convencional “lollipop”, cada site CpG na região (-121303076 -121302726 →) é indicado com um círculo; círculos preenchidos são metilado, círculos não preenchidas são não metilado. Lollipop representações do estado de metilação de cada sítio CpG em regiões promotoras RGS10-1 amplificado por BS10-1, BS10-3, e conjuntos de iniciadores BS10-4 estão disponíveis no informações de apoio.

Usando o dados de seqüenciamento bissulfito, determinou-se a frequência de metilação dos locais de CpG em todo o promotor RGS10-1 em A2780 e A2780 células-AD (Figura 5, Tabela S1). A frequência de metilação em locais CpG em todo o promotor RGS10-1 foi baixa; a maioria dos locais de CpG foram completamente não metilado ou metilado foram em 10-20% dos clones. Uma excepção foi o dinucleótido na posição -121030162, que foi altamente metilada em ambas as linhas celulares. Durante a totalidade do promotor, a taxa de metilação foi ligeiramente superior em células A2780-AD do que em células A2780 progenitoras (Figura 5A, inserção). Esta diferença foi mais pronunciada em vários locais CpG adjacentes na região -121303155 -121303007 → (indicado por pontilhada barra horizontal, Figura 5A). A taxa global de metilação em toda esta região foi duplicada nas células quimiorresistentes em comparação com as células parentais (Figura 5A, inserção). Estes dados sugerem que a metilação de DNA melhorada local em uma região de aproximadamente 800 pares de bases a montante do local de início da transcrição está correlacionada com a perda de expressão RGS10 na quimiorresistência adquirida. A seguir, realizada a mesma análise sobre promotores RGS10-1 em Iosé e células Caov-3. taxas de metilação em toda a RGS10-1 promotor e da região identificada acima foram semelhantes em células Iosé e Caov-3 (Figura 5B).