Abstract
associada à metástase gene 1 (MTA1) é altamente associado com a metástase do câncer de próstata humano; No entanto, as funções moleculares de MTA1 que facilitam a metástase permanecem obscuros. Neste estudo, demonstra-se que o silenciamento de ARNsi MTA1 por tratamento resulta na sobre-regulação da expressão de E-caderina pela fosforilação de AKT (p-AKT) e diminui a capacidade de invasão de células cancerosas da próstata. Mostramos que MTA1 é expresso em mais de 90% de tecidos de cancro da próstata, especialmente tecido de cancro da próstata metastático, em comparação com não-expressão no tecido da próstata normal. A análise de RT-PCR e análise Western blot mostrou que a expressão MTA1 é significativamente maior em células de cancro da próstata PC-3M-1E8 altamente metastáticas (1E8) do que em células de cancro da próstata metastático PC-3M-2B4 mal (2B4). Silenciamento expressão MTA1 por tratamento siRNA em células 1E8 aumentou os caracteres malignos celulares, incluindo a capacidade adesiva celular, diminuiu a capacidade invasiva celular alterado e a polaridade do citoesqueleto celular. células 1E8 sobre-expressar MTA1 tinha uma expressão reduzida de E-caderina, enquanto as células 1E8 tratados com MTA1 siRNA teve uma maior expressão da caderina-E. A expressão de AKT fosforilado (p-AKT) ou a inibição da P-Akt por tratamento com wortmanina (100 nM), alterou significativamente a função de MTA1 na regulação da expressão de E-caderina. Alterações na expressão de E-caderina mudou o papel da p-AKT em caracteres malignos celulares. Todos estes resultados demonstram que MTA1 desempenha um papel importante no controlo da transformação maligna de células de cancro da próstata através da via da p-AKT /E-caderina. Este estudo também fornece um novo papel mecanicista para MTA1 na regulação da metástase do câncer de próstata
Citation:. Wang H, Fan L, Wei J, Weng Y, Zhou L, Shi Y, et al. (2012) Akt medeia Metástase-Associated Gene 1 (MTA1) regulação da expressão de E-caderina e promover a invasão das células cancerosas da próstata. PLoS ONE 7 (12): e46888. doi: 10.1371 /journal.pone.0046888
editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América
Recebido: 30 de maio de 2012; Aceito: 06 de setembro de 2012; Publicação: 05 de dezembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Natural Science Foundation da China (30973184) (www.nsfc.gov.cn). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata é um dos cânceres malignos mais comuns e é a segunda principal causa de morte por câncer em homens americanos [1]. O insucesso do tratamento ocorre para câncer de próstata muitas vezes devido ao nó de linfa e /ou metástase órgão distante. Os mecanismos moleculares de metástases de cancro da próstata e invasão não estão bem esclarecidos. Evidências crescentes indicou que o gene associado a metástase humana 1 (MTA1) é um factor chave em metástase tumoral [2]. Um estudo que utilizou uma análise serológica de bibliotecas de expressão de cDNA recombinante (SEREX) descobriram que MTA1 foi preferencialmente expresso num painel de tecidos de carcinoma da próstata malignas em comparação com tecidos normais, o que sugere que MTA1 pode ser necessária para o carcinoma da próstata metástase [3] Um outro estudo descobriram que MTA1 foi seletivamente sobre-expressa no cancro da próstata metastático em relação ao cancro da próstata clinicamente localizado e no tecido da próstata benigna [4]. Estes estudos demonstraram que MTA1 pode desempenhar um papel importante na metástase do cancro da próstata; No entanto, o papel mecanicista da MTA1 no processo de metástase do cancro da próstata é ainda mal compreendido.
MTA1 foi originalmente identificada por rastreio diferencial de ADNc utilizando linhas celulares do cancro da mama altamente metastáticas [5]. O gene MTA1 codifica uma nova proteína que contém uma região rica em prolina (SH3 se ligam ao motivo), um motivo de dedo de zinco putativa, um motivo de fecho de leucina e 5 cópias do motivo de ligação ao ADN SPXX [6]. A proteína MTA1 foi encontrado no complexo nucleossoma remodelação da desacetilase de histona (NURD), o que foi mostrado para modificar ou cromossomas remodelar [7]. MTA1 interage fisicamente com histona-desacetilase (HDAC), que desempenha um papel importante na desacetilação das histonas e a alteração de controlo transcricional [8]. Como um importante regulador de destino da célula com um papel na oncogénese e a progressão de diversos tumores malignos, MTA1 tem atraído a atenção geral [2].
(A-C) Os resultados típicos para o padrão de coloração imuno-histoquímica MTA1 determinada pela são mostrados em tecido normal da próstata (a), tecido de cancro da próstata localizado (B), e tecido de cancro da próstata metastizado (C). Os resultados em B e C mostraram expressão MTA1 em ambos os núcleos e citoplasma. A ampliação original para A-C é 200 vezes e detalhado com vista ampliada é de 400 vezes. (D) A RT-PCR quantitativo de análise dos níveis de ARN em MTA1 2B4 e células 1E8 (topo). Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células 2B4. (E) Os níveis de expressão de proteína de MTA1 em 2B4 e 1E8 células foram analisadas por transferência de Western utilizando anticorpos específicos, e os resultados foram quantificados (topo). Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células 2B4. Os experimentos foram repetidos três vezes.
Para as células epiteliais de se transformar em células cancerosas, o mesenquimais transição epitelial (EMT) deve ocorrer [9]. A EMT leva camadas de células epiteliais para perder polaridade e célula-célula contactos e desencadeia a remodelação do citoesqueleto celular [10], [11]. E-caderina é considerado como um dos principais indicadores da ocorrência da EMT [12]. E-caderina desempenha papéis importantes em fenótipos malignas, incluindo a adesão celular, a diferenciação celular, e a estrutura da célula. A regulação positiva da E-caderina tem sido implicado na inactivação da EMT [13], [14]. Assim, a E-caderina tem sido sugerido para servir como um supressor tumoral forte no desenvolvimento do cancro [14], [15]. desacetilação histona e /ou a hipermetilação das ilhas de CpG em E-caderina tem sido demonstrado ser os principais mecanismos para silenciamento de E-caderina em tumores [15], [16], [17]. MTA1 tem sido mostrado ter um papel na desacetilação de histona, a alteração da estrutura da cromatina e de controlo transcricional [18], [19]. Estes resultados sugerem que MTA1 pode possivelmente regular E-caderina. Além disso, tem sido mostrado MTA1 para influenciar fenótipos EMT [20], [21]. Anteriormente, mostramos que a expressão de E-caderina é regulado positivamente em células de cancro cervical e o melanoma tratadas com siRNA MTA1 [22]. No entanto, estes estudos não se concentrou sobre o mecanismo que regula as mudanças na expressão gênica E-caderina por MTA1. A fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt acredita-se desempenhar um papel importante na progressão do cancro humano, incluindo a progressão do cancro da próstata [23], [24]. MTA1 foi encontrado para regular a expressão de AKT [25]. Para alterar o fenótipo maligno de células de cancro, a via MTA1 /AKT podem activar genes e antagonizam os genes que suprimem a proliferação e /ou metástases de células. Recentemente, a via PI3K /AKT tem sido mostrado para ser um regulador central da EMT [26], [27]. E-caderina é também um regulador chave da EMT e um inibidor de desenvolvimento de cancro que podem ser regulados pela via PI3K /AKT [28]. Neste estudo, foi demonstrado que MTA1 muda o fenótipo maligno de células de cancro da próstata e regula a expressão de E-caderina através de um mecanismo dependente da fosforilação de AKT. Este estudo pré-clínico fornece uma melhor compreensão dos papéis de MTA1 e constitui a base para posterior estudo clínico de MTA1 como um gene alvo.
(A) O tratamento com ARNsi MTA1 diminuição da expressão MTA1 eficiente e reforçada expressão de E-caderina . Os níveis de proteína foram analisados por meio de transferência de Western e foram normalizados para a p-actina. A quantificação das intensidades das bandas é mostrado (em cima). Um asterisco (*) ou diamante (◊) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) nos níveis mta1 ou E-caderina, respectivamente, em comparação com as células não tratadas e as células transfectadas com ARNsi de controlo negativo, n = 3. (B) a taxa de adesivo foi quantificada pelo ensaio de MTT, e uma experiência representativa é mostrada. A capacidade das células para aderirem a uma superfície sólida foi significativamente regulada positivamente em células que tinham sido tratadas com siRNA MTA1. Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células não tratadas e células transfectadas com ARNsi de controlo negativo. (C, D, e E) Utilizando um Matrigel
sistema Transwell revestidas com TM, a capacidade invasiva das células tratadas MTA1 siARN foi testado. A quantificação do número de células invasivas do fundo das inserções Transwell é mostrada no painel inferior. Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células não tratadas e células transfectadas com ARNsi de controlo negativo. (F, G, e H) As alterações no citoesqueleto estrutura foram detectados por microscopia confocal: coloração vermelha representa α-tubulina. coloração azul representa os núcleos. Os “pés” foram encurtados, ea polarização foi enfraquecido em células tratadas com MTA1 siRNA. Essas mudanças indicam uma reduzida capacidade de se mover (400 vezes). Um resultado representativo de três experiências independentes é mostrado para todos os dados.
Materiais e Métodos
Os anticorpos e corantes
Todos os reagentes neste estudo foram de grau analítico e estão comercialmente disponíveis. Os anticorpos primários utilizados neste estudo foram adquiridos a partir das seguintes empresas: o anticorpo MTA1 foi a partir de Santa Cruz Biotech, EUA; o anticorpo de E-caderina foi de Epitomics Inc, EUA; o α-tubulina e anticorpos de p-actina foram da Sigma, Alemanha, e o anticorpo (Ser473) p-AKT foi de Cell Signaling Technology, EUA. As IgG alcalina anti-coelho conjugado com fosfatase, anti-ratinho ou anti-cabra, também foram adquiridos a partir de Sigma. As IgG FITC e Cy3 conjugados foram compradas a partir do laboratório de EPP, EUA. DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindole, dicloridrato, (2 ug /ml de metanol)) foi adquirida a partir de Taufkirchen, Alemanha. A wortmanina também foi adquirido a Sigma.
(A) os resultados de transferência de Western demonstrou que o tratamento com siRNA MTA1 aumento da expressão de E-caderina após 48 horas. Um asterisco (*) ou diamante (◊) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) nos níveis mta1 ou E-caderina, respectivamente, em comparação com as células transfectadas com ARNsi de controlo negativo. (B) A análise de transferência de Western demonstrou também que a transfecção transiente com um plasmídeo que codificava de comprimento completo MTA1 diminuição da expressão de E-caderina após 48 horas. Um asterisco (*) ou diamante (◊) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) nos níveis mta1 ou E-caderina, respectivamente, em comparação com as células transfectadas com um vector vazio. As mudanças foram quantificados (superior). Todos os experimentos foram repetidos três vezes.
Amostras de tecidos e linhas celulares
As amostras de tecidos de próstata normal, câncer de próstata localizado e câncer de próstata metastático foram obtidos do Departamento de Patologia de Tongji Hospital, que é afiliado com a Universidade Huazhong da Ciência e Tecnologia. Todos os tecidos de câncer de próstata metastático foram retirados de pacientes que tinham documentado doença metastática e submetidos a uma ressecção transuretral da próstata (RTU) para aliviar a obstrução urinária (metástases à distância e cintilografia óssea positiva, M1 no tumor-nódulo-metástase TNM) . Este estudo foi aprovado pelo comitê local de ética em pesquisa (REC) no Hospital Tongji de Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia, em conformidade com o princípio da Declaração de Helsinki II. Todos os documentos de consentimento informado por escrito de cada participante foram obtidos durante a fase de inscrição. A linha de mal metastático humano adenocarcinoma da próstata PC-3M-2B4 celular (2B4) eo adenocarcinoma da próstata humana linha de células PC-3M-1E8 altamente metastático (1E8) foram adquiridos de Professor Zhengjie (Universidade de Pequim, China). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco-BRL, EUA) com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (Si Jiqing, Hangzhou, China).
(a) uma análise Western blot mostrou que o tratamento com siRNA MTA1 poderia inibir a fosforilação de AKT, após um tratamento de siARN 48 horas. Um asterisco (*) e diamante (◊) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) nos níveis mta1 e E-caderina, respectivamente, em comparação com as células transfectadas com ARNsi de controlo negativo. (B) As células foram incubadas com a wortmanina p-AKT inibidor (100 nM) ou DMSO para várias vezes a partir de 24 horas a 48 horas, e as proteínas celulares foram extraídos. Uma análise de transferência de Western mostrou que o tratamento com wortmanina promovida a expressão de E-caderina e inibiu a expressão de MTA1 após 24 horas. Um asterisco (*), diamante (◊), ou triângulo (Δ) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) no MTA1, E-caderina ou os níveis de p-AKT, respectivamente, em comparação com as células tratadas com DMSO. (C) A expressão forçada através de P-Akt por transfecção transiente do plasmídeo MYR-AKT diminuiu a expressão de E-caderina e aumentou a expressão de MTA1 após 24 horas. A quantificação das bandas é mostrado (em cima). (D) As células foram transfectadas com ARNsi MTA1 na presença ou ausência do plasmídeo de MYR-AKT ou wortmanina durante 48 horas. A análise Western blot foi usado para avaliar as alterações na expressão de E-caderina. Um asterisco (*), diamante (◊), ou no triângulo (Δ) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) nos MTA1, E-caderina ou p-AKT níveis, respectivamente, em comparação com o controlo negativo transfectadas com siRNA células. A quantificação de intensidades de bandas é mostrado (em cima). Todos os experimentos foram repetidos três vezes.
Imunohistoquímica
Uma análise imuno-histoquímica de MTA1 foi realizada utilizando o método do complexo avidina-biotina peroxidase. Desparafinados e secções de tecido re-hidratadas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo anti-humano MTA1 monoclonal de ratinho a uma diluição 1:100 e, em seguida, lavadas com PBS. biotinilado de cabra anti-imunoglobulina de coelho (DAKO, Quioto, Japão) foi então adicionada às secções durante 30 minutos à temperatura ambiente. Depois, as secções foram lavadas com PBS, foi em seguida aplicado conjugado com peroxidase de avidina (DAKO). A actividade da peroxidase foi detectada expondo as secções a uma solução de 0,05% de 3, 3-diaminobenzidina e 0,01% H
2O
2 em tampão de Tris-HCl (3, solução de 3-diaminobenzidina) durante 3 a 6 minutos à temperatura ambiente. As secções foram contrastadas com hematoxilina.
(A) As células foram tratadas com o plasmídeo MYR-AKT ou vector vazio durante 48 horas na presença ou ausência de E-caderina de siRNA. A capacidade adesiva foi testada utilizando o ensaio de MTT, e um resultado experimental típico é mostrado. Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células transfectadas com um vector vazio. Um triângulo (Δ) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células transfectadas com o plasmídeo MYR-AKT de codificação, na ausência de E-caderina de siRNA. (B) As células foram incubadas com wortmanina (100 nM) ou DMSO durante 24 horas e depois tratou-se com ou sem a E-caderina ARNsi durante 48 horas. Utilizando o ensaio de MTT, a capacidade adesiva das células foi testada. Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células tratadas com DMSO. Um triângulo (Δ) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células tratadas com wortmanina na ausência de E-caderina de siRNA. (C, D, e E) As células foram tratadas com o plasmídeo MYR-AKT ou um vector vazio durante 48 horas na presença ou ausência do plasmídeo de E-caderina. A Matrigel
sistema Transwell revestidas com TM foi utilizado para analisar as capacidades invasivas das células. A quantificação do número de células invasivas do fundo das inserções Transwell é mostrado (painel da direita). Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células transfectadas com um vector vazio. Um triângulo (Δ) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células transfectadas com um plasmídeo MYR-AKT de codificação, na ausência de E-caderina de siRNA. (F, G, e H) As células foram tratadas com o plasmídeo MYR-AKT ou um vector vazio durante 48 horas na presença ou ausência do plasmídeo de E-caderina. As alterações no citoesqueleto celular foram monitorizados por microscopia confocal. coloração vermelha representa α-tubulina e coloração azul representa os núcleos (400 vezes). (I, J, e K) As células foram tratadas com wortmanina (100 nM) ou DMSO durante 24 horas e depois tratou-se com ou sem a E-caderina ARNsi durante 48 horas. A Matrigel
sistema Transwell revestido-TM foi utilizado para medir alterações na capacidade invasiva celular. A quantificação do número de células invasivas do fundo da inserção é mostrada Transwell (painel da direita). Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células tratadas com DMSO. Um triângulo (Δ) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em comparação com as células tratadas com wortmanina na ausência de E-caderina de siRNA. (G, H, e N) As células foram tratadas com wortmanina (100 nM) ou DMSO durante 24 horas e depois tratou-se com ou sem a E-caderina ARNsi durante 48 horas. As alterações no citoesqueleto celular foram monitorizados por microscopia confocal. coloração vermelha representa α-tubulina e coloração azul representa os núcleos (400 vezes). Um resultado representativo de três experiências é mostrado para todos os dados.
RT-PCR e immunoblotting
Para a análise de RT-PCR, o ARN total foi isolado a partir das linhas de células usando o Trizol reagente (Invitrogen, Cergy Pontoise, França), e o ADNc foi sintetizado com M-MLV de transcriptase reversa (Promega, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A PCR foi realizada utilizando um sistema de amplificação de PCR (Biometra, EUA). Os iniciadores foram concebidos utilizando o software Oligo 6, identificado pelo Alinhamento Local Básico Search Tool (BLAST; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) e foram adquiridos à Invitrogen. As sequências dos iniciadores mta1 foram como se segue: Para a frente: 5′-CTCTGCGCATCTTGTTGGACATA -3 ‘e reverso: 5′-TCAGCTTCGTCGTGTGCAGATAG -3’. Para um padrão interno, as sequências dos iniciadores de p-actina foram como se segue: Para a frente: 5′-GCACCACACCTTCTACAATG -3 ‘e reverso: 5′-TGCTTGCTGATCCACATC TG -3’.
Para as análises de transferência de Western, as células foram lisadas em tampão RIPA (50 mM Tris /HCl, pH 7,2, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, e 0,5% (w /v) de desoxicolato de sódio). quantidades equivalentes dos extractos celulares (150 ug) foram separados num gel de dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10% de sódio e transferida para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas em Tris 25 mM (pH 8,0) contendo NaCl 125 mM, 0,1% de Tween 20, e 5% de leite desnatado durante 1 hora e, em seguida, incubadas com os anticorpos primários diluídos (MTA1: 1:200, caderina-E e P -Akt: 1:2000 e β-actina: 1:1000) a 4 ° C durante a noite. Após incubação com os anticorpos primários, os anticorpos secundários foram adicionados a uma diluição 1:1000. As bandas imunorreactivas foram visualizadas com fosfatase alcalina e coloração com BCIP /NBT.
quantitativa PCR em tempo real
Para quantitativa PCR em tempo real, o ARN total foi isolado a partir de linhas celulares em reagente Trizol (Invitrogen , Cergy Pontoise, França). a síntese de ADNc de primeira cadeia foi efectuada usando um kit de síntese de ADNc (Amersham Bioscience, NJ). Quantitative PCR em tempo real foi realizada num Prism 7700 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems, CA) utilizando um kit de QuantiTect SYBR Green (Qiagen, CA). Os iniciadores foram concebidos utilizando software 3.0 Primer Express, identificado por Básico Local Alignment Tool Search (BLAST) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) e comprado de Invitrogen. Cada amostra foi executado em triplicado. Condições de reacção de PCR quantitativo foram como se segue, um ciclo de 50 ° C durante 15 min, um ciclo de 94 ° C durante 2 min, 40 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 56 ° C durante 20 s, e 70 ° C durante 20 s. No final da reacção de PCR, as amostras foram submetidas a uma análise de fusão para confirmar a especificidade do fragmento amplificado. As sequências MTA1 primers foram: Forward: 5’GCAGCTGAAGCTGAGAGCAAGTTA-3 ‘; Reverso: 5’-CCTTGACGTTGTTGACGCTGA -3 ‘. As sequências dos iniciadores E-caderina foram: Forward: 5’TACACTGCCCAGGAGCCAGA -3 ‘; Reverso: 5 ‘TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3’; Para o padrão interno, as sequências de iniciadores de GAPDH foram: para a frente: 5 ‘CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′; Reverso:. ACCCTGTTGCTGTAGCCA 5’- -3 ‘
transfecção celular
As linhas de células foram cultivadas em placas de 6 poços de cultura de tecidos ou frascos a 37 ° C com 5% de CO2 numa incubadora humidificada (Heraeus, Alemanha). Para a transfecção siRNA, as células foram transfectadas com 200 pmol /ml de siRNA duplex utilizando 5 ul de Lipofectamina
TM 2000 (Invitrogen) quando as células estavam confluentes a 20% de acordo com o protocolo do fabricante. Os controlos incluíram células não transfectadas e células que tinham sido transfectadas com um ARNsi de controlo negativo mexidos (Ruibo, China). Para a transfecção de plasmídeo, 4 × 10
5 células foram plaqueadas numa placa de 6 poços e foram transfectadas, utilizando 4 ng de plasmídeo e 10 uL de lipofectamina
TM 2000 por poço. O plasmídeo MTA1 full-length (pEGFP-C1 /MTA1) foi gentilmente cedido pelo Professor Meu Mahoney (Thomas Jefferson University), e o vector vazio (pEGFP-C1) foi preservado pelo nosso laboratório. O plasmídeo pCMV-SPORT6 E-caderina foi comprado de YRBIO (China), eo gene da E-caderina foi subclonado no vector pcDNA pelo nosso laboratório. O pcDNA MYR-HA-AKT2 (MYR-AKT) plasmídeo foi comprado de Addgene (https://www.addgene.org/; Addgene plasmídeo 9016), e o vector vazio pcDNA também foi preservada no nosso laboratório. As células foram colhidas 48 h após a transfecção, e os níveis de proteína foram medidas por Western blot. As sequências de siRNA mta1 foram como se segue: Para a frente: 5 ‘CCCUGUCAGUCUGCUAUAA dTdT 3’ e Reverso: 3 ‘DTDTGGGACAGUCAGACGAUAUU 5’. As sequências de siRNA E-caderina foram os seguintes: Forward: 5’CAGACAAAGACCAGGACUA dTdT 3 ‘e Reverso: 3’ dTdT GUCUGUUUCUGGUCCUGAU 5 ‘
A invasão ensaio
Para o ensaio de invasão, 5 ×. 10
3 as células foram semeadas em 100 ul de meio RPMI 1640 no topo de tereftalato de polietileno (PET), membranas revestidas com Matrigel
TM (1,5 mg /ml, BD Biosciences) dentro Transwell inserções de cultura de células (inserções de 24 poços , 8 mm de tamanho de poro; Corning Life Sciences, Corning, NY). A câmara inferior foi preenchida com 600 ul de RPMI 1640 contendo FBS a 20% e o sobrenadante a partir de células NIH-3T3 (linha celular de fibroblastos embrionários de ratinho) para actuar como um factor quimiotáctico (CF). As células foram incubadas durante 48 horas a 37 ° C com 5% de CO
2. Subsequentemente, as células foram fixadas em 2,5% (v /v) de glutaraldeído e coradas com violeta de cristal. As células invasivas sobre a parte inferior de gel foram visualizadas sob um microscópio (Leica, Alemanha) e quantificada por contagem do número de células em três campos escolhidos aleatoriamente com uma ampliação de 100 vezes.
O ensaio de adesão em fase sólida
o ensaio de ades foi realizada utilizando o ensaio colorimétrico à base de tetrazólio (MTT). Números iguais de células (4 x 10
4 culas por po) foram semeadas em placas de 96 poços que tinha sido pré-revestidas com 1 ug /ml de fibronectina (FN) (Sigma, Alemanha). A título de comparação, um número igual de células foi também semeadas em placas revestidas com albumina de soro bovino (1% w /v). Após 1 hora, as placas foram imersas em PBS contendo 1 mM MgCl
2 para remover células não aderentes. Em seguida, o número de células aderentes foi medida com o ensaio de MTT e lida a 490 nm. Os valores de densidade óptica reflectida a proporção de células que aderiram à placa de 96 poços FN-revestido. A taxa de aderência foi calculada pela equação seguinte: o valor da DO do experimento /o valor da DO do controlo x 100%
imagiologia microscopia confocal
Para coloração por imunofluorescência. , 1 × 10
4 células foram semeadas em lamelas de vidro (13 mm de diâmetro). Depois as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS, as membranas celulares foram permeabilizadas com 0,2% (v /v) de Triton X-100 em PBS, e locais de ligação não específicos foram bloqueados com BSA a 5% (w /v) em PBS. O primeiro anticorpo foi aplicado para as lâminas a 4 ° C durante a noite (α-tubulina: 1:50, MTA1: 1:20, e E-caderina: 1:100). Após a incubação com o primeiro anticorpo, as células foram lavadas três vezes com PBS frio e incubado com FITC ou IgG-Cy3 conjugado a uma diluição de 1:50 em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. Os núcleos foram coradas durante 5 min à temperatura ambiente com DAPI. As células foram lavadas com PBS e observados usando um microscópio confocal (Olympus, Japão).
Co-imunoprecipitação (Co-PI)
células 1E8 cresceu em placas de 10 cm, em seguida, foram colhidas em não -denaturing tampão de lise (Tris 20 mM ,, pH 8, NaCl 135 mM, 10% de glicerol, 1% de Nonidet P-40 (NP-40), 2 mM de EDTA, Roche de inibidores de protease de mini completos. Todos os procedimentos seguintes foram realizada sobre o gelo. lisados de tampão de lise-solúveis, recolhidas a seguir à extracção durante 4 horas e centrifugação a 12.000 rpm, 20 minutos a 4 ° C. em um lisado celular tubo 1mg foi adicionado com o anticorpo MTA1 40 ul e incubadas durante a noite a 4 ° C . no dia seguinte, o lisado celular contendo anticorpo foram aplicadas a contas de Sepharose de proteína G-acopladas (Abcam) durante 4 horas a 4 ° C. as contas foram lavadas 3 vezes em tampão de lise. Finalmente, o sobrenadante foram adicionados a 25 ul de 2 x tampão de carga . Western blot foi realizada após a separação de proteínas e com grânulos de ebulição.
a análise estatística
Os dados foram analisados por uma análise de variância. A estatística análise foi realizada utilizando software SPSS versão 13.0.
Resultados
A expressão de MTA1 na próstata carcinoma
Para confirmar a expressão de MTA1 no câncer de próstata humano, uma imuno-histoquímica a análise de coloração para MTA1 foi realizada em próstata normal, localizada do cancro da próstata e as amostras de tecido de cancro da próstata metastático (os recursos e os critérios para a designação de tecido são descritos na secção de materiais e métodos). Os resultados revelaram que em amostras da próstata normais, expressão MTA1 era dificilmente detectável (Figura 1A). No entanto, nas amostras de cancro da próstata localizado, coloração positiva para MTA1 foi observada nos núcleos de seis dos 15 tecidos examinados (Figura 1B). Além disso, em 27 dos 30 tecidos de tumor metastáticas de cancro da próstata, foi observado um nível elevado de coloração MTA1 tanto no citoplasma e núcleo das células cancerosas (Figura 1C). Uma análise quantitativa para a coloração positiva de MTA1 na Figura 1A-C foi mostrado na Figura S1. Um RT-PCR e análise de mancha de Western foram realizadas para medir a expressão de níveis de ARN MTA1 e proteína, respectivamente, no PC-3M-1E8 (1E8) e células PC-3M-2B4 (2B4) [29], [30]. Os resultados destas análises são mostrados na Figura 1D e E, o que demonstra que os níveis de RNA e proteína MTA1 estavam presentes em ambas as linhas celulares, mas em diferentes níveis de expressão. Os níveis de MTA1 expressão de ARNm foram 0,38 ± 0,01 e 0,83 ± 0,02 para as células 2B4 e 1E8, respectivamente, e os níveis de expressão da proteína no 2B4 e células 1E8 foram 0,58 ± 0,04 e 0,83 ± 0,02, respectivamente (p 0,05, n = 3 para cada um). Descobrimos que as células 1E8 expressa aproximadamente duas vezes maiores níveis de RNA MTA1 e 1,5 vezes os níveis de proteína-MTA1 mais elevados em comparação com as células 2B4. Portanto, a linha celular 1E8 foi escolhido para investigar as propriedades biológicas de MTA1 no carcinoma da próstata in vitro.
A influência de silenciamento MTA1 no fenótipo maligno de células 1E8
Foi utilizado siRNA para baixo -regulate a expressão de MTA1 nas células 1E8. Três pares de ARNsi contra MTA1 foram concebidos. Verificou-se a eficácia do siRNA por Western blotting (Figura S2). Pelo menos um knockdown 60% do nível de proteína MTA 1 foi obtido utilizando o siRNA-3 #, portanto, escolheu este par para o nosso estudo posterior (Figura 2A). Nós também sobre-expressa MTA1 no fundo de MTA1 siARN, que confirmou o efeito apresentado por siRNA-3 # em células (Figura S3). As células transfectadas com ARNsi foram também analisadas para a expressão da proteína E-caderina. Uma análise Western blot mostrou que o nível de expressão de E-caderina foi mais elevada nas células tratadas com siRNA mta1 (48 horas após a transfecção), o que indicava que MTA1 pode desempenhar um papel na regulação negativa da E-caderina. Em seguida, analisou-se a capacidade de adesão das células 1E8 tratadas com siRNA mta1 utilizando um ensaio de fase sólida combinados com o ensaio MTT (ver a secção de materiais e métodos). Para a mesma concentração revestidos na superfície de FN, a capacidade de adesão das células tratadas com siRNA MTA1 foi significativamente mais elevada do que as células de controlo. A imagem representativa é mostrado. As taxas adesivas para as células não tratadas, o controlo negativo tratado com siRNA e mta1 tratadas com siRNA foram 40,07 ± 6,23, 50,22 ± 4,99 e 99,62 ± 9,62, respectivamente (p 0,05, n = 3, a Figura 2B). Nós também estudaram os efeitos de MTA1 sobre a capacidade de invasão das células 1E8 utilizando um Matrigel
revestidos por TM modelo Transwell. As quantidades de células na parte inferior da membrana, o qual reflectiu a capacidade de invasão das células eram 597 ± 6,24, 590 ± 5,77 e 201 ± 2,40 para as células não tratadas, negativos de controlo tratados com siRNA e mta1 tratadas com siRNA, respectivamente (p 0,05, n = 3 A Figura 2C-E). Alterações da organização do citoesqueleto celular e polaridade também estão envolvidos em metástase de células tumorais [31] Assim, examinamos as estruturas do citoesqueleto das células tratadas com siRNA mta1 por microscopia confocal e descobriu que os “pés” das células tratadas com siRNA mta1 eram encurtado e que a polaridade celular foi enfraquecido em comparação com as células de controlo (Figura 2F-H mta1: red; núcleos: azul). Estes resultados sugerem ainda que MTA1 podem estar envolvidos nos fenótipos malignas de células cancerosas, incluindo a adesão, invasão, a estrutura do citoesqueleto e polaridade celular.
MTA1 regula a expressão de E-caderina
Para confirmar o papel de MTA1 na regulação da expressão de e-caderina, que tratado com células 1E8 MTA1 siRNA e um plasmídeo de comprimento total MTA1 para várias vezes a partir de 24 a 48 horas (nível de translação).