Abstract
Em ressecado radicalmente câncer gástrico a possibilidade de prever o local de recaída poderia ser clinicamente relevante para a seleção de gestão pós-cirúrgica. Nós já mostrou que integrinas tumorais específicas genótipos estão independentemente associadas com metástases quer peritoneal ou hematog�icas (ITGA e ITGV). Recentemente VEGF e VEGF-R polimorfismos têm demonstrado afectar potencialmente a angiogénese de tumores e o processo metastático em cancro gástrico. Em seguida, investigou o papel de VEGF e VEGF-R genotipagem na determinação quer carcinose peritoneal ou metástases hematogênicas em pacientes com câncer gástrico ressecados radicalmente. genotipagem do tumor para integrinas (ITGA e ITGV) também foi realizada de acordo com os nossos resultados anteriores. A genotipagem para VEGF-A, VEGF-C, e o VEGFR-1,2,3 ITGA e ITGV foi levada a cabo sobre os tumores gástricos ressecados radicalmente pT4a recorrentes com qualquer peritoneal somente carcinose ou metástases hematog�icas. 101 pacientes preencheram os critérios de inclusão: 57 com apenas carcinomatose peritoneal e 44 com apenas disseminação hematogênica. Na análise multivariada, a histologia intestinal eo genótipo AC de rs699947 (VEGFA) mostrou correlacionar de forma independente com metástases hematogênicas (p = 0,0008 e 0,008, respectivamente), enquanto que a histologia difusa e o genótipo AA de rs2269772 (ITGA) independentemente correlacionada com peritoneal só de difusão (p = 0,0001 e 0,03, respectivamente). Nossos resultados parecem indicar que combinar informações de genotipagem de rs699947 (VEGFA, AC), rs2269772 (ITGA, AA) e histologia do tumor poderia permitir que os médicos a individualizar câncer gástrico em alto risco de recorrência ou com metástases peritoneais ou hematog�icas. A ferramenta de seleção, decorrente desta análise pode permitir uma utilização óptima das estratégias de tratamento disponíveis nesses pacientes
Citation:. Scartozzi M, Loretelli C, Galizia E, Mandolesi A, Pistelli M, Bittoni A, et al. (2012) Papel do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e VEGF-R genotipagem na condução do processo metastático em pT4a ressecado gástricas pacientes com câncer. PLoS ONE 7 (7): e38192. doi: 10.1371 /journal.pone.0038192
editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 24 Janeiro, 2012; Aceito: 01 de maio de 2012; Publicação: 09 de julho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Scartozzi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O resultado global para pacientes com câncer gástrico ressecados radicalmente permaneceu substancialmente inalterada ao longo dos anos nos países ocidentais, com uma taxa de sobrevida em 5 anos variando entre 15% e 35% de todos os casos [1], [2]. Apesar de vários esforços, a maioria dos ensaios clínicos que investigam o papel dos tratamentos pós-operatórios mostraram resultados controversos.
Nos países ocidentais apenas uma sobrevida benefício modesto, tem sido observado para a quimioterapia adjuvante principalmente em análise de dados agregados e o efeito benéfico da quimioradioterapia parecia limitado a pacientes que recebem uma limpeza inadequada da linfáticos [3], [4].
carcinose peritoneal pode ser o primeiro local de reincidência em aproximadamente 40 a 50% dos pacientes submetidos a cirurgia radical [5], [ ,,,0],6], [7]. Com base nestes dados de um papel potencial para a quimioterapia intraperitoneal na prevenção da carcinomatose peritoneal tem sido implicado [6], [7]. No entanto, a contenção da doença com um tratamento loco-regional pode ser inadequada em pacientes com alto risco de metástases hematogênicas e deve ser melhor reservados apenas para aqueles susceptíveis de se repetirem no peritônio, sem difusão hematogênica. fatores Infelizmente preditivos para o sítio de recorrência e potencialmente capaz de sugerir uma estratégia pós-operatório personalizado são muito insuficientes. Embora muitas variáveis clínicas foram analisados no passado, apenas alguns deles mostrou ser eficaz relevante para predizer o local de reincidência. fatores clínicos e patológicos, tais como o envolvimento serosa tumor, histologia do tumor (difusa vs. intestinal), a extensão da linfadenectomia e a presença de células tumorais no lavado peritoneal durante a laparotomia têm sido apontados como preditivo para o sítio de recorrência no câncer gástrico [4] [8], [9].
Numa análise anterior, descobrimos que Genotipagem de rs2269772 (
ITGA
) e rs11902171 (
ITGV
) pode representar um ativo crítico na definição de doentes com cancro gástrico alto risco para carcinose peritoneal [10].
os Factores de Crescimento endotelial Vascular (VEGF) foi identificado superfamília criticamente influência angiogénese em tumores sólidos. Os dados publicados sugerem que, em presença de factores relacionados com a angiogénese tumoral metástases distantes são mais prováveis de ocorrer [11], [12].
Curiosamente, tem sido também demonstrado que o fenótipo angiogénico pode ser diferente entre intestinal e do tipo difusa do tipo de câncer gástrico. Em diferentes análises tumores do tipo intestinal parecem de fato biologicamente mais dependente de angiogénese de tumores do tipo difuso [13], [14], [15].
Single-nucleotídeo polimorfismos (SNPs) no crescimento endotelial vascular factores (VEGF) e os receptores de VEGF (VEGF-R), os genes foram correlacionados com a neoangiogénese do tumor através de diferentes mecanismos biológicos. Em pacientes com cancro colo-rectal SNPs específicos no VEGF-R2 têm sido mostrados para influenciar significativamente a densidade de microvasos [16]. SNPs específica no gene VEGFA resultou capaz de determinar a resposta à quimioterapia, através da modulação da estrutura e função de [17] vasos sanguíneos do tumor.
Tumor linfangiogénese é estritamente dependente da actividade biológica do VEGFC e o VEGF-R3 [ ,,,0],18], [19]. Curiosamente difusão linfática junto com a colonização direta de células cancerosas, também representam crucial, mas biologicamente distinta, os passos para a disseminação peritoneal. Com base nestes pressupostos que pode, em seguida, a hipótese de que a expressão alterada da via VEGFC /VEGFR-3 pode influenciar difusão peritoneal de células cancerosas através dos vasos linfáticos [20]. Por outro lado, a via de VEGFC /VEGF-R3 tem sido também demonstrado relevantes para a difusão do cancro hemática assim [21].
Prevendo o local de recorrência entre indivíduos de alto risco podem permitir abordagens adjuvantes adequados. Estudámos, portanto, o papel do VEGF tumorais e VEGF-R polimorfismos na determinação quer carcinose peritoneal ou metástases hematogênicas em pacientes com câncer gástrico ressecados radicalmente. Os dados clínicos e SNPs de VEGF de tumores, o VEGF-R e integrinas foram analisadas com o objectivo sugerir um perfil biologicamente impulsionado para ser empregue como uma ferramenta de selecção para o tratamento adequado no paciente adequado.
Métodos
Os pacientes Seleção
A população do estudo pacientes foi selecionada a partir de uma base de dados central, incluindo pacientes afetados por câncer gástrico, operados em quatro instituições diferentes da nossa Região. Classificação do T, N e factores-M foi feita de acordo com o sistema numérico introduzido pelo 7
th TNM.
Somente os pacientes que apresentaram recidiva dentro de 2 anos, com qualquer peritoneal somente carcinose ou hematogênica metástases após gastrectomia curativa para um adenocarcinoma gástrico pT4a, que não receberam quimioterapia adjuvante e cujo tumor espécime estava disponível foram selecionados para a genotipagem do tumor. Os pacientes com metástases distantes tanto no momento do diagnóstico ou presença de células tumorais esfoliadas em lavagem peritoneal obtido durante a laparotomia foram excluídos da análise. Decidimos restringir nossa análise aos pacientes com tumores pT4a como este grupo de pacientes é em maior risco de difusão peritoneal e é considerado frequentemente para o tratamento loco-regional como a quimioterapia intraperitoneal. No entanto, uma proporção não desprezível desses pacientes não se repita localmente e, portanto, uma ferramenta de seleção neste cenário seria um ativo particularmente valiosa para os médicos que tratam. Como a maioria das recorrências são registrados dentro de 2 anos do diagnóstico optou-se por excluir pacientes recorrentes após este período de tempo a fim de obter uma população homogénea.
Siga-up de ambos os grupos (peritoneal ou somente hematog�icas metástases) ocorreram em três meses intervalos. Follow-up constou de exame físico, hemograma completo, radiografia de tórax e US da digitalização abdómen ou CT como clinicamente indicado. O local ea data da primeira recaída e a data da morte foram registrados
Ética Declaração
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética AOU Ospedali Riuniti -. Umberto I de nossa instituição. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito.
tumor VEGF e VEGF-R Genotipagem
VEGF e VEGF-R genotipagem foi realizada on-fixados em formalina bloco de tecido embebido em parafina (cerca de 30 mg) de primário amostras de cancro gástrico.
a cera de parafina foi removida com xileno e as amostras foram lavadas duas vezes com etanol a 100%. O ADN foi isolado a partir do tecido deparaffinised utilizando o Kit ™ RECOVERALL Ácido Nucleico total Isolamento de tecidos FFPE (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. DNA de cada amostra foi então eluida em 120 ul de solução de eluição.
polimorfismos nucleotídicos singulares (SNPs) dentro de cada um dos genes foram seleccionados utilizando o software Pupasuite (https://pupasuite.bioinfo.cipf.es/index. jsf – versão 2.0.0, bioinfo 2008), o banco de dados CIPF Single Nucleotide Polymorphism (dbSNP) gerado pelo National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) e pela revisão da literatura médica, utilizando os seguintes critérios:
o polimorfismo teve algum grau de probabilidade de alterar a estrutura ou a expressão do gene de um modo relevante biologicamente (ou seja, que afecta sequências ese, 3 ‘UTR ou a região do promotor);
a freqüência do alelo menor foi acima de 10% (com a única excepção do rs2305948, rs6877011 e rs307822);.
o polimorfismo genético foi estabelecida e bem documentado
Outras considerações dirigiu a seleção de SNPs para o nosso estudo. Uma correlação entre a presença de um alelo específico num sítio polimórfico e a expressão da respectiva proteína foi anteriormente documentada para o VEGF [22], [23]. SNPs em sequências reguladoras, tais como intrões e 5 ‘e 3’ UTRs, têm sido mostrados para alterar a estabilidade do ARNm [24], [25] a eficiência de processamento [26], expressão da isoforma [27], [28] e localização [29] . Além disso, as sequências de motivo reguladoras dentro da UTR 3 ‘de mRNAs foram mostrados para afectar a estabilidade do mensageiro e /ou a sua eficiência de tradução [28]. Assim, pode-se argumentar que SNPs nessas sequências podem influenciar VEGF e expressão do gene VEGF-R. Também sobre estas bases, foram selecionados os SNPs conhecidos por afetar VEGF e de expressão VEGF-R e os localizados nas sequências regulatórias, para o qual um suposto papel na regulação de proteínas podem ser assumidos.
Globalmente assumimos que selecionou SNPs tinha . impacto sobre a expressão da proteína e, por conseguinte, em função biológica
SNPs seleccionados foram como se segue: seis polimorfismos no gene VEGFA (rs10434, G a; rs2010963, L C; rs25648, C T; rs3025039, C T; rs699947, a C; rs833061, C T), dois em VEGFC (rs4604006, T C; rs7664413, C T), dois em VEGF-R1 (FLT1) (rs664393, G a; rs7993418, a G), quatro em VEGF-R2 (KDR) (rs1870377, a T; rs2071559, a G; rs2305948, G a; rs7667298, a G) e três em VEGF-R3 (FLT4) (rs307805, A G; rs6877011, C G; rs307822, G A). localizações cromossômicas, posições e efeitos biológicos dos investigados VEGF e VEGFR SNPs foram resumidos na tabela 1.
SNP genotipagem foi realizada por tecnologia TaqMan, utilizando produtos de genotipagem de SNP (Applied Biosystems). reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada e os genótipos foram analisados nos 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) usando um software Sistema de Detecção de Sequência ABI Prism 7300 (versão 1.3.1, Applied Biosystems). Cada reacção continha 0,2 ul de ADN genómico total. A genotipagem foi realizada por profissionais de laboratório cegos para o estado do paciente, e uma aleatória de 10% das amostras foram repetidos para validar procedimentos de genotipagem.
Todos os SNPs genotipados teve que apresentar uma chamada taxas globais de ≥90% para ser incluído no nossa análise.
tumor integrinas Genotipagem
a genotipagem para integrinas tumorais independentemente associados tanto com metástases peritoneais ou hematog�icas em nossa análise anterior (genótipos a e G do rs2269772,
ITGA Comprar e G e C genótipos de rs11902171,
ITGV
) foi realizado como descrito anteriormente [10].
análise estatística
a análise estatística foi realizada com o software MedCalc versão 10.4.8 para Windows. A associação entre variáveis categóricas foi estimada pelo teste do qui-quadrado. A análise de regressão logística foi utilizada para avaliar o papel independente de variáveis resultou significativa na análise univariada
variáveis testadas foram: sexo (masculino versus feminino), idade ( 65 anos vs. ≥ 65 anos)., ausência ou presença de metástases linfáticas (pN0 vs. pN +), tipo de linfadenectomia (D1 vs. D2), histologia do tumor de acordo com a classificação de Lauren (intestinal vs. difusa), /vasos sanguíneos linfáticos invasão (presença vs ausência), o Centro de clínica onde a cirurgia foi realizada, integrinas de genotipagem (genótipos A e G do rs2269772,
ITGA
e G e C genótipos de rs11902171,
ITGV
) e cada polimorfismo VEGF e VEGF-R.
o rácio entre as chances de o resultado (odds ratio) nos 2 grupos (carcinose peritoneal apenas e hematog�icas metástases) foi calculado com intervalo de confiança de 95%. Um nível significativo de 0,05 foi escolhido para avaliar a significância estatística.
Todos os polimorfismos foram examinados para o desvio de Hardy-Weinberg usando o v. 3.25 pacote Powermarker (www.statgen.ncsu.edu/powermarker).
análise
Desequilíbrio de Ligação (LD) também foi realizada utilizando o v. 3.25 pacote Powermarker (www.statgen.ncsu.edu/powermarker). LD foi estimada utilizando r2, com r2 = 1 indicando LD completa e r2 = 0 indicando LD ausente.
Resultados
Hardy-Weinberg e Desequilíbrio de Ligação
As frequências de os genótipos testados resultaram comparáveis àquelas relatadas em caucasianos, sem desvio significativo em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg.
o desequilíbrio de ligação não foi observado para os genótipos tumorais independentemente correlacionados tanto com metástases peritoneais ou hematog�icas.
pacientes Características
cento e um pacientes estavam disponíveis para nossa análise: 66 machos e 35 fêmeas, com idade média ao diagnóstico de 67 anos (variação 34-89). dados de acompanhamento estavam disponíveis para todos os pacientes incluídos. Follow-up constou de exame físico, hemograma completo, radiografia de tórax e US do abdome ou digitalização CT /MRI como clinicamente indicado. Somente os pacientes que desenvolveram exclusivamente quer carcinose peritoneal ou metástases hematogênicas durante todo o curso de sua doença foram consideradas.
Todos os pacientes foram submetidos a cirurgia radical (R0) para câncer gástrico pT4a, linfonodos regionais foram negativos para metástases (pN0) em 23 pacientes (23%). A maioria dos pacientes foram submetidos a uma linfadenectomia D2 (94 casos, 93%). relatório de patologia mostrou histologia intestinal em 51 casos (51%) e histologia difusa em 50 pacientes (49%) (tabela 1). Cinquenta e sete pacientes (56%) desenvolveram difusão do tumor somente carcinose peritoneal, enquanto que metástases hematogênicas foram diagnosticados em 44 pacientes restantes (44%). clínicopatológicos variáveis de ambos os grupos (carcinose-apenas e metástases hematog�icas) foram comparáveis com a excepção de a histologia do tumor. Todas as principais características clínicas e patológicas estão resumidos na tabela 2.
tumor VEGF e VEGF-R Genotipagem
Todos os SNPs genotipados apresentou uma chamada taxas globais de ≥90%.
amostras repetidas para validação genotipagem confirmados os resultados obtidos por análise prévia em todos os casos.
tumores gástricos mostrando o genótipo AA de rs10434 (
VEGFA
), o genótipo AC de rs699947 (VEGFA) e o genótipo GG de rs7993418 (FLT1) resultou mais propensas a metástases hematog�icas (carcinose peritoneal contra metástases hemática: 8% vs. 27%, p = 0,02; 30% vs 59%, p = 0,006 e 2% vs. 16 %, P = 0,02, respectivamente) (tabela 3). Nenhuma correlação poderia ser encontrado entre esses genótipos tumorais e peritoneal só de difusão.
A análise dos restantes polimorfismos VEGF e VEGF-R não demonstrou qualquer correlação com qualquer carcinose peritoneal ou metástases hematogênicas (tabela 4) .
tumor integrinas genotipagem
resulta Globalmente por integrinas tumorais genotipagem confirmou nossas descobertas anteriores.
pacientes tumores com o genótipo GG do rs2269772 (
ITGA
) resultou menos propenso a carcinose peritoneal (peritoneal carcinose vs. metástases hematogênicas: 39% e 77% dos pacientes, respectivamente, p = 0,002), enquanto que o genótipo AA de rs2269772 (
ITGA
) foi mais frequentemente associada de carcinose peritoneal (carcinose peritoneal contra metástases hematog�icas: 25% e 5% dos doentes, respectivamente, p = 0,014). O genótipo CC de rs11902171 (
ITGV
) foi mais frequentemente associada a carcinose peritoneal (peritoneal carcinose vs. metástases hematogênicas: 21% e 5% dos pacientes, respectivamente, p = 0,016). Pelo contrário, os pacientes com o genótipo GG de rs11902171 no
ITGV
gene carcinose peritoneal desenvolvido com menos frequência que metástases hematogênicas (peritoneal carcinose contra metástases hematogênicas: 42% e 66% dos doentes, respectivamente, p = 0,02) .
outros fatores clínicos /patológica
Entre as outras variáveis testadas, tipo histológico difuso mostrou uma correlação com carcinose peritoneal (peritoneal carcinose contra metástases hematogênicas: 81% e 9% dos doentes, respectivamente, p 0,001), enquanto tumor histologia intestinal estava ligada a metástases hematogênicas (peritoneal carcinose vs. metástases hematogênicas:. 19% e 91% dos pacientes, respectivamente, p 0,001) (tabela 2)
Análise multivariada
na análise multivariada, a histologia intestinal eo genótipo AC de rs699947 (VEGFA) mostrou correlacionar de forma independente com metástases hematogênicas, enquanto histologia difusa e o genótipo AA de rs2269772 (ITGA3) independentemente correlacionada com peritoneal só de difusão (p = 0,001 ). resultados odds ratio para estes últimos fatores confirmou seu papel em guiar células tumorais através do processo metastático para o peritônio ou locais hematog�icas (Tabela 5).
Discussão
A introdução de múltiplos terapêutica opções para a gestão pós-cirúrgica de pacientes com câncer gástrico ressecados radicalmente abriu a questão da selecção pacientes ideal. Infelizmente um factor limitante fundamental para o potencial tratamento destas opções é representado pela falta de factores clínicos e biológicos capazes de prever a recorrência local de. A contenção da doença com um tratamento loco-regional como a quimioterapia intraperitoneal pode ser de fato inadequada em pacientes com alto risco de metástases hematogênicas e deve ser melhor reservado para os pacientes com maior probabilidade de se repetir com peritoneal só de difusão. Por outro lado, em pacientes mais propensos a recorrer com metástases hematogênicas quimioterapia adjuvante pode representar uma estratégia mais eficaz.
Em nossa experiência a rs699947 (VEGFA, AC) polimorfismo é independentemente relacionada a um maior risco de metástase hematogênica com um OR 8,08 (IC de 95% 1,7-37,5, p = 0,008). SNPs na região promotora do gene de VEGF foram já demonstrado que afecta os pacientes em resultado colo-rectal, da mama e cancro gástrico [17], [30], [31]. A interferência biológica em função do gene de VEGF causada por variantes polimórficas na região promotora é, de facto susceptível de determinar uma expressão alterada do gene. Isto pode tanto aumentar o potencial pro-angiogénese relacionado com o tumor e, finalmente, guiar o processo metastático através da formação de novos vasos sanguíneos [16], [17], [30], [31]. No entanto não existem dados disponíveis sobre o papel do VEGF e VEGF-R genotipagem para determinar o processo metastático em câncer gástrico ressecado radicalmente. A maioria dos estudos investigaram a poucos SNPs potencialmente envolvidos na angiogénese tumoral, ao passo que no presente estudo vários SNPs nos genes VEGFs e receptores foram globalmente analisado juntamente com outros determinantes conhecidos.
Como anteriormente descrito o rs2269772 (ITGA, AA ) genótipo das integrinas tumorais confirmados para ser independente relevante para determinar a difusão peritoneal de células cancerosas gástricas [10). Este achado que deriva a partir de uma análise multivariada incluindo tumor angiogénese factores relacionados sugere fortemente que este polimorfismo específico da integrina tumor deve ser considerado em estudos futuros. Pelo contrário nossa análise não pode confirmar o papel das integrinas tumorais na determinação de difusão hemática. Sabemos, a partir publicado anteriormente analisa que a regulação alta de integrinas sub-classes poderia aumentar as células neoplásicas a motilidade e expressão VEGF [32],. Integrinas pode, consequentemente, perder a sua função na determinação de difusão tumor hematogénea quando os fatores relacionados com a angiogénese já estão ativados.
tumor de histologia resultaram mais um factor de forma independente capaz de identificar o potencial de câncer gástrico para determinar metástases quer peritoneal ou hematog�icas. No entanto histologia do tumor por si só não parece suficiente para prever com precisão os locais metastáticos. Em nossa experiência, de forma semelhante a relatórios anteriores, uma proporção considerável dos doentes desenvolveram peritoneal carcinose ou hematog�icas metástases independentemente da histologia do tumor. Considerações semelhantes podem ser aplicados para a presença de envolvimento da serosa do tumor e /ou células cancerígenas esfoliadas em lavagem peritoneal. Nem todos os tumores gástricos com infiltração serosa acabará por desenvolver carcinose e uma lavagem peritoneal negativo, infelizmente, não exclui uma futura difusão peritoneal [8], [9]. Nós demonstramos que a genotipagem de rs699947 (VEGFA, CA) e rs2269772 (ITGA, AA) tem um papel independente na determinação do local metastático de células de cancro gástrico, mesmo quando a histologia do tumor é incluída na análise. Nossos resultados parecem, em seguida, para indicar que combinar informações de genotipagem de rs699947, rs2269772 e histologia do tumor poderia permitir que os médicos a individualizar câncer gástrico em alto risco de recorrência ou com peritoneal ou com metástases hematogênicas entre os pacientes submetidos a cirurgia radical aparente para o câncer pT4a sem células cancerosas esfoliada no lavado peritoneal. No nosso estudo genotipagem de DNA foi realizada apenas no ADN do tumor e isso pode representar uma limitação para a interpretação dos dados.
Globalmente acreditamos que a genotipagem para VEGFA e genes específicos de integrina podem constituir um trunfo importante na definição da difusão metastática para pacientes com câncer gástrico ressecados radicalmente. Radicalmente ressecados pacientes com câncer gástrico com alto risco de recorrência peritoneal podem ser candidatos ideais para terapia intraperitoneal, enquanto que se o risco de metástases hematogênicas é a quimioterapia sistêmica predominante pode representar uma opção melhor. A ferramenta de seleção, decorrente desta análise pode então permitir uma utilização óptima das estratégias de tratamento disponíveis e deve representar um possível fator de estratificação em estudos futuros nesses pacientes.