Abstract

miRNAs estão previstas para controlar a atividade de aproximadamente 60% de todos os genes codificadores de proteínas que participam na regulação de vários processos e doenças celulares, incluindo câncer. Recentemente, demonstramos que miR-187 é significativamente regulada negativamente no cancro da próstata (PCA) e aqui propomos uma abordagem proteômica para identificar seus alvos potenciais. Para este fim, as células PC-3 foram transfectadas transientemente com o miR-187 e precursor de miARN controlo negativo mímica. As proteínas foram analisadas por electroforese em gel de uma diferença de duas dimensões (2D-DIGE) e definido como diferencialmente regulado se a mudança observada foi de dobra ± 1,06. Então, a análise de MALDI-TOF MS foi realizada após a digestão de proteínas e proteínas de baixa abundância foram identificados por LC-MS /MS. Os péptidos foram identificados através de busca contra a base de dados SWISS PROT Expasy, e validação de alvos foi realizada tanto in vitro por transferência de Western e qRT-PCR em amostras clínicas e por qRT-PCR, imuno-histoquímica e ELISA. análise DIGE mostrou 9 pontos diferencialmente expressos (P 0,05) e 7 apresentaram uma expressão regulado por baixo em cima de miR-187 re-introdução. Entre estes alvos foram identificados aldeído desidrogenase 1A3 (ALDH1A3). expressão ALDH1A3 foi significativamente reprimidos no PC3, LNCaP e DU-145 células após miR-187 re-introdução. O apoio a esses dados, a expressão de ALDH1A3 foi encontrado de forma significativa (p 0,0001)-regulada em amostras APC e inversamente correlacionados (p 0,0001) com o miR-187 expressão, sua expressão estar diretamente associado com pontuação de Gleason (p = 0,05). A expressão de ALDH1A3 foi medida em amostras de urina para avaliar a capacidade de previsão do presente biomarcador para a presença de APC e, a um nível de significância de 10%, PSA e também ALDH1A3 foram significativamente associados com uma biópsia positiva de CaP. Em conclusão, nossos dados mostram, pela primeira vez o papel de ALDH1A3 como um alvo miR-187 em APC e fornecer insights na utilidade de usar esta proteína como um novo biomarcador para CaP

Citation:. Casanova-Salas I, Masiá E, Armiñán A, Calatrava A, Mancarella C, Rubio-Briones J, et al. (2015) miR-187 Metas do gene andrógeno-regulamentado

ALDH1A3

no câncer de próstata. PLoS ONE 10 (5): e0125576. doi: 10.1371 /journal.pone.0125576

Editor do Academic: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 20 de outubro de 2014; Aceito: 25 de março de 2015; Publicado: 13 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Casanova-Salas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: dados de microarray análise são acessível em Gene Expression Omnibus NCBI número de acesso de banco de dados GSE45604

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por doações do Instituto de Salud Carlos III PI10 /01206, FPI11 /00505, Madrid, FPI (CTQ2007-60601; CTQ2011-18195) do Ministério da Ciência e Educação, espanhol e do Ministério Italiano de Pesquisa e Instrução (número do projeto FIRB: RBAP11884 M_005), a Associação italiana de Investigação do Cancro (Katia Scotlandi-AIRC projeto N.14049). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comum ea segunda causa de morte por câncer em homens [1]. Cerca de um em cada três homens com idade superior a 50 anos mostra evidência histológica de CaP. No entanto, apenas 10% destes serão corretamente diagnosticados com CaP clinicamente significativa [2]. Os níveis de PSA combinados com exame de toque retal (DRE) são os principais critérios para o diagnóstico CaP, mas muitas vezes levar a um excesso de diagnóstico e tratamento excessivo [3]. Consequentemente, a identificação de novos marcadores, capaz de melhorar o diagnóstico e detecção de CaP potencialmente agressivos, são necessários para melhores decisões clínicas de suporte.

miARNs são uma classe de pequenas moléculas de RNA não codificantes que consistem de 19-22 nucleotídeos; eles estão envolvidos numa variedade de processos biológicos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, a apoptose e a proliferação celular. miARNs regular a expressão do gene através de translação repressão e ARNm de clivagem de mais de 60% dos genes codificadores de proteínas [4, 5]. Vários estudos sugerem que um miARN indivíduo pode regular centenas de alvos [6] e pode funcionar como um supressor de tumores ou oncogenes, dependendo dos genes-alvo [7], bem como contribuir para a iniciação e o desenvolvimento de diversos tipos de cancro, incluindo CaP [5].

Usando a análise microarray miRNA (NCBI Gene Expression Omnibus número de acesso de banco de dados GSE45604), nosso grupo identificou miR-187 como um supressor de tumor miRNA em CaP [8]. Embora a sua utilidade foi demonstrada na definição de diagnóstico, até à data não confirmada experimentalmente metas para miR-187 foram identificados no CaP. A maior parte dos algoritmos computacionais prever alvos de miARN principalmente com base na complementaridade de sequência entre a extremidade 5 ‘da miARN madura e a região 3′ não traduzida (3’-UTR) de ARNm alvo; no entanto, esses algoritmos produzir taxas relativamente altas de ambos os falsos positivos e falsos [6] negativos. Além disso, sabe-se que mais de 25% dos alvos validada experimentalmente não pode ser prevista por qualquer dos programas de previsão de miARN alvo mais comum [9]. Portanto, as abordagens de expressão gênica e de triagem proteômica são urgentemente necessários para identificar experimentalmente alvos de miRNA.

Este estudo utilizou uma abordagem proteômica baseada em bidimensional eletroforese em gel (2D DIGE) seguido por laser assistida por matriz dessorção de ionização espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) análise tempo-de-voo e, pela primeira vez, identificou

ALDH1A3

como um alvo miR-187 em CaP. Além disso, foi avaliada a utilidade potencial de ALDH1A3 como um biomarcador tumor.

Material e Métodos

2.1. espécimes de próstata clínicos

formalina-fixo e (FFPE) blocos embebidos em parafina correspondentes a 195 pacientes CaP foram recuperadas dos arquivos do Biobank do

Fundación Instituto Valenciano de Oncologia

realizar o seguinte inclusão critérios: amostras obtidas de prostatectomies radical retropúbica entre 1996 e 2002 e sem história de tratamento prévio para a PCA (incluindo terapia de privação de andrógeno ou quimioterapia antes da cirurgia). Todos os pacientes assinaram termo de consentimento para a doação de tecidos para fins de investigação antes da coleta do tecido, eo estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Fundação Instituto Valenciano de Oncologia (ref. Número. 2010-19). Os critérios de exclusão incluíram qualquer tratamento anterior ou presença de outros tumores, juntamente com a não aceitação do consentimento de doação. Os dados clínicos foram revisados ​​a partir dos registros clínicos e armazenadas em um banco de dados específico-PCA. As características dos pacientes e dados demográficos estão apresentados na Tabela 1. escore de Gleason foi uniformemente avaliada pelo mesmo patologista (AC). Para fins de comparação e de calibração, 8 amostras de tecido da próstata normal, proveniente de pacientes submetidos cistectomias radicais sem evidência patológica da doença da próstata também foram analisados.

Dez amostras de tecido fresco de confirmação histológica CaP foram recuperados dos arquivos do biobanco do Hospital Clínico Universitário de Valencia (INCLIVA) para fins de validação. total de amostras de urina foram obtidas após DRE e imediatamente antes da biópsia de diagnóstico a partir de uma coorte independente de 123 homens com suspeita de CaP, de quem 63 levam a uma biópsia positiva.

2.2. As linhas de células e transfecção de miARN

PC-3, LNCaP, DU-145, e 22RV1 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, CA, EUA), enquanto as células VCaP PCA-derivados foram cultivadas em DMEM (ATCC, Middlesex, Reino Unido) forma, com 10% de soro fetal bovino, 100 U /ml e Penincillin 0.1ug /ml Estreptomicina em condições de cultura celular padrão (37 ° C em 5% de CO

2 numa incubadora humidificada). miR-187, que foi anteriormente encontrada para ser regulada negativamente em [8] APC, foi analisada nestas linhas celulares por qRT-PCR, como descrito abaixo.

PC-3, as células LNCaP e DU-145 foram transientemente transfectadas, utilizando siPORT NeoFX transfecção Agent (Applied Biosystems, Life Technologies, Califórnia, EUA), com precursores de 40nm de miR-187 (HSA-miR-187-3p miRNA imitar) e miRNA imitar controle negativo 1 #, de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems, Life Technologies, Califórnia, EUA). As células foram colhidas 72 h após a transfecção e a viabilidade das células foi medida para avaliar a sua toxicidade utilizando o CellTiter 96 Aqueous ensaio de proliferação celular não radioactivo (Promega, Wisconsin, EUA), em conformidade com as instruções do fabricante.

2,3. Identificação de genes-alvo para miR-187

Proteínas do miR-187 mímico contra miARN imitar controlo negativo 1 # transfectadas células PC-3 foram analisados ​​por electroforese em gel de diferença bidimensional (2D-DIGE). Resumidamente, as proteínas de os dois grupos em comparação foram precipitados utilizando o kit de limpeza da 2-D (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, EUA). As amostras foram em seguida ressuspensas em tampão de coloração DIGE DIGE (ureia a 7 M, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 20 mM Tris) e quantificada utilizando um ensaio de proteína de Bradford (BioRad, Hercules, CA, EUA). As amostras foram marcadas com 400 pmol /50 ug de proteína com o CyDye DIGE Fluor fluor�oros Cy3 e Cy5 (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, EUA) tal como recomendado pelo fabricante. Uma piscina que contém quantidades iguais de todas as amostras foi também preparado e marcado com Cy2 para ser usado como um padrão interno em todos os géis para auxiliar correspondente imagem e análise estatística multi-gel. Seis repetições biológicas de cada amostra foram realizados transfectadas e seis géis foram gerados no total. separação das proteínas foi realizada por electroforese bidimensional. Na primeira dimensão, as proteínas foram separadas de acordo com o seu ponto isoeléctrico na imobilizada 24 centímetros gradiente de pH linear de tiras (IPG) (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, EUA), re-hidratadas em tampão de reidratação (7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 0,5% de tampão de IPG, DTT 50 mM) durante a noite. Na segunda dimensão, as proteínas foram separadas de acordo com o peso molecular de 25 cm x 21 cm x 1 mm 12,5% géis de acrilamida. Os géis foram digitalizadas com um Typhoon 9400 Modo Variable Imager (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, EUA) e as imagens do gel subsequentes foram importados para o software de análise DeCyder Diferencial. As proteínas foram definidos como diferencialmente regulado se a mudança observada foi de dobra ± 1,06 (

P

0,05) entre miARN imitar controlo negativo 1 # transfectadas PC-3 e miARN-187 transfectadas mímico de PC-3. a digestão de proteínas foi realizada com tripsina de grau de sequenciação (Promega, Wisconsin, EUA) tal como descrito noutro local [10]. A análise MALDI-TOF MS foi então realizada utilizando 0,5 uL de mistura de digestão manchado na placa alvo de MALDI. Depois de as gotículas à temperatura ambiente, secagem ao ar, 0,5 ul de matriz [5 mg /mL de CHCA (Sigma, St. Louis, MO, EUA) em 0,1% de TFA-ACN /H2O (1: 1, v /v)] foi adicionado e deixado a secar ao ar à temperatura ambiente. Uma amostra conhecida foi processado de forma idêntica como controle de qualidade. As fracções resultantes foram analisadas em um 4700 Proteomics Analyzer (ABSciex, Framingham, MA, EUA) no modo de reflectrão positivo (2000 tiros cada posição). proteínas pouco abundantes foram identificados por LC-MS /MS utilizando uma coluna armadilha (Coluna NanoLC, 3μ C18-CL, 75 μ mx 15 centímetros, Eksigen, Dublin, CA, EUA) por meio de um fluxo isocrático de 0,1% de TFA em 2 μ l /min durante 10 min. Uma vez que os péptidos foram concentradas para o pré-coluna que foram eluídos na coluna analítica (coluna LC, 3 μ C18-CL, 75um x 25 cm, Eksigen, Dublin, CA, EUA) para separar. Os péptidos foram finalmente eluído utilizando um gradiente de 40% B 5a durante 30 min, para um espectrómetro de massa nanoESI qQTOF (5600 TripleTOF, ABSciex, Framingham, MA, EUA). A informação da MS e MS /MS foram analisadas com o algoritmo Paragon, Proteína Pilot Software (ABSciex, Framingham, MA, EUA). Os peptídeos foram identificados utilizando a informação no espectro de massa em tandem através de pesquisa no banco de dados Expasy SWISS PROT.

2.4. Western Blotting de ALDH1A3

Para in vitro fins de validação, transfectadas, LNCaP e as células PC-3 DU-145 com miR-187 mímico ou miRNA mimetizador de controle negativo (72 h) foram colhidas, lavadas com PBS e depois lisadas com tampão de lise gelado (Tris-HCl 50 mM, pH = 8, NaCl 150 mM, 0,02% NaN

3, 0,1%, sulfato de sódio dodecilo (SDS), 1% de Nonidet P-40 (NP40), 0,5% de ácido desoxicólico (DOC), comprimidos de cocktail inibidor de protease (1 ×). os lisados ​​celulares foram centrifugados a 10000 rpm durante 10 min a 4 ° C, o sobrenadante foi, então, misturado com 5 × tampão de amostra de SDS, fervidos durante 5 minutos e separadas através de 12% de SDS . géis -Página Após a electroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose por transferência electroforética as membranas foram bloqueadas em 5% de leite desnatado durante 1 h, lavadas e incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários:. ALDH1A3 (Novus Biologicals, Littleton , CO, EUA; diluição de 1: 500) e β-actina (Millipore, Billerica, MA, EUA; 1:. diluição 200000) anticorpo em excesso foi então removido por lavagem da membrana em PBS /0,1% de Tween 20, e as membranas foram incubou-se durante 1 h com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano: anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho ou de burro anti-IgG de coelho (1: 10000) (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, EUA). Após lavagens em PBS /0,1% de Tween 20, de detecção imunológico foi realizado utilizando a quimioluminescência amplificada (ECL) sistema de detecção de mancha de Western (Euroclone, Milão, Itália), de acordo com as instruções do fabricante.

2,5. miRNA repórter alvo ensaio

PC-3 miR-187 células de controlo imitam ou negativo foram transfectadas com 3’UTR Go Clone Reporter (50 ng) (Painéis Genomics, La Hulpe, Bélgica) contendo a sequência 3’UTR de ALDH1A3 clonado a jusante do repórter de luciferase RenSP ou o vector vazio contendo apenas o repórter da luciferase utilizando Dharmafect reagente 2 (Dharmacon, GE Healthcare, Piscatawey, NJ, EUA). As células foram lisadas e a actividade repórter foi medida 24 h após a transfecção usando o Reagente de Ensaio da Luciferase Lightswitch (Painéis Genomics).

2,6. isolamento do RNA e qRT-PCR

Isolamento de RNA de ambas as linhagens celulares e amostras clínicas foi realizada utilizando Mirvana miRNA kit de isolamento (Tecnologias Ambion, vida, CA, EUA). O ARN total foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit TaqMan miARN transcrição reversa e iniciadores de haste-laçada miARN específicas-(Applied Biosystems, Life Technologies, CA, EUA) e de alta capacidade de ADNc de Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, EUA) de acordo com as indicações do fabricante. Em seguida, 2 ul de este ADNc, correspondente a 96 amostras de tumor APC, foi amplificado por PCR em tempo real em um volume final de 10 ul por reacção em um termociclador ABI 7500-rápida utilizando ensaios de ARNm (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, EUA). Para avaliação miARN, 1,33 ul de miRcDNA foi amplificado num volume final de 20 ul. ensaios de miRNA para RU44 (001.094), RU48 (001.006) e miR-187 (001.193), e ensaio de mRNA para

ALDH1A3

(Hs00167476_m1) foram utilizados (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, EUA). Todas as reacções foram realizadas em triplicado. A expressão relativa de ARNm ou miARN foi determinada utilizando o valor médio das amostras de controlo como o calibrador e seguindo o

-ΔΔCt Método 2 [11]. Para avaliações de linha de células, expressão de miR-187 foi analisada por qRT-PCR utilizando um conjunto de ARN humano universal (Cat # 740000 Stratagene, La Jolla, CA) como controlo de normalização.

2,7. A imuno-histoquímica de ALDH1A3

Os mesmos blocos FFPE CaP utilizados para análise de RNA foram incorporados em 11 microarrays de tecido (TMA). Foram seleccionados dois ou três áreas representativas (1 mm de diâmetro) de cada tumor para a produção de TMA por examinar as hematoxilina slides tumor prostatectomia manchado de eosina e, em seguida, a amostragem do tecido dos blocos de parafina correspondentes. Um instrumento de tissue microarray (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI) foi utilizado para a montagem do TMA. A partir dos blocos de TMA, as secções de 3 mm de espessura foram submetidos a coloração imuno-histoquímica usando coelho anti-humano policlonal ALDH1A3-Ab (Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA; 1:50). tecido da próstata humana foi utilizado como controlo positivo, tal como recomendado pelo fabricante. A percentagem de células ALDH1A3-positivas e a intensidade da coloração citoplasmática foram marcados semiquantitativamente, formando quatro grupos (de 0 a 3). Os casos foram classificados como expressores baixos quando a intensidade da coloração foi entre 0 e 1, e expressores elevados quando a intensidade foi de 2 e acima.

2,8. ALDH1A3 ELISA

As amostras de urina de 123 pacientes com suspeita de CaP foram centrifugadas a 1000 x g para remover os detritos. O sobrenadante de urina foi usada para estimar o nível de proteína ALDH1A3 usando um quantitativo sanduíche humano ELISA kit (Blue Gene Biotech Co Ltd, Shanghai, China). O padrão de referência foi entre 0 e 50 ng /ml, com intra e inter-ensaio de menos de 10 CV%. A densidade óptica (O.D) foi determinada a 450 nm utilizando um leitor Victor Multilabel Placa (PerkinElmer Life Sciences, Massachusetts, EUA).

2,9. A análise estatística

Para estudar o valor prognóstico do

ALDH1A3

gene usamos variáveis ​​binárias que refletem o estado positivo das medidas. A associação entre o

ALDH1A3

expressão e os parâmetros clínico (categóricas) foi avaliada através de Spearman com significância considerado de 5%. O impacto de fatores biológicos sobre BPFs e PFS clínica foi determinada pelo teste de log rank risco proporcional de Kaplan-Meier [12]. progressão bioquímica foi definida como PSA sérico maior que 0,4 ng /ml durante o acompanhamento e evolução clínica foi definida como (fossa prostática) local, (linfonodos) regionais ou distantes (metástases) progressão. BPFs e PFS clínicos foram consideradas individualmente a partir da data da cirurgia para a data do evento. A análise estatística foi feita com SPSS, versão 20.0. aplying do teste t de Student FDR, p-valor, PCA e agrupamento hierárquico foram aplicadas nas amostras do estudo proteômica. Todos os resultados são apresentados como média ± SEM (GraphPad Prism Software 4.0, Graph Pad Software, Inc.)

Resultados

3.1. miARN expressão em linhas celulares de CaP

A análise dos níveis de miARN por qRT-PCR confirmou a diminuição da expressão de miR-187 em linhas de células de PCA: PC-3, LNCaP, DU-145 e 22RV1 (Fig 1A). Em PC-3, o nível de expressão de miR-187 foi equivalente à observada anteriormente em pacientes com CaP [8], e por este motivo esta linha de células foi escolhido para análise posterior.

A) Expressão de miR-187 foi analisado por qRT-PCR utilizando um conjunto de ARN humano universal como calibrador para normalizar a expressão relativa das miARNs analisados ​​seguindo o

-ΔΔCt método 2. Como pode ser apreciado, todas as linhas celulares, mas VCaP mostrou a sub-regulação de miR-187. B) miR-187 miRNA imitar e miRNA imitar controle negativo foram transfectados em, LNCaP e DU-145 células para 72h PC-3. A re-introdução de miR-187 em PC-3, LNCaP e DU-145 foi confirmada por PCR em tempo real. O histograma mostra o aumento no nível de ARNm de miR-187 em células transfectadas imitam o miR-187 de miARN quando comparado com células transfectadas com o miARN imitar controle negativo e células não transfectadas.

3,2. Identificação de ALDH1A3 como putativo miR-187-alvo

A fim de identificar potenciais alvos do miR-187 uma série de experimentos de análise e validação de proteômica foi realizada. miR-187 miRNA mimic foi reintroduzida em PC-3, LNCaP e DU-145 e demonstraram que a expressão de miR-187 foi recuperado no PC-3, LNCaP e DU-145 células (Fig 1B). Uma abordagem global de proteómica usando DIGE e LC-MS /MS foi realizada com amostras de células PC-3 transfectadas com um controlo negativo e PC-3 transfectadas com o miR-187 miARN mímica. As células foram colhidas 72 h após a transfecção, lisadas e separados por electroforese bidimensional. Depois de separar os extratos de proteínas e de fluorescência a digitalização, 9 pontos diferencialmente expressos foram detectados (Fig 2A). Estes pontos 9 de proteína (P 0,05) exibido pelo menos 1,06 vezes regulação ao longo de seis experiências independentes. Sete destes 9 pontos mostrou uma expressão regulada para baixo em cima do miR-187 re-introdução, que foi consistente com o esperado efeito inibidor de miARN na maioria dos seus alvos (S1 tabela). Entre essas metas aldeído desidrogenase 1A3 (ALDH1A3) foi identificado (Fig 2B).

células PC-3 foram transfectadas quer com miRNA mimetizador de controle negativo ou miR-187 miRNA imitar, colhidas após 72h, e lisados ​​de proteínas foram marcadas com Cy3 ou Cy5 (miR-187 e controlo) e Cy2 para o padrão interno. A) imagem do gel 2D DIGE obtido em pH 3-10 e 12,5% SDS-poliacrilamida. Os números referem-se à identificação dada aos pontos expressos diferencialmente. Mancha 655 foi ainda identificado por LC-MS /MS como ALDH1A3. B) Comparação da expressão de um dos pontos (655 ou ALDH1A3), nas seis géis analisados, entre as células transfectadas com o miR-187 ou com o controlo negativo. A variação média da dobra entre as duas condições foi de -1,06 com um valor de p de 0,003. ALDH1A3, aldeído desidrogenase a família 1 membro A3

3.3. Validação de

ALDH1A3

como putativo miR-187-alvo

Para demonstrar que

ALDH1A3

é alvo de miR-187, screening alvo bioinformática; usando o software de previsão alvo mais comum miRNA (TargetScan, PicTar e Miranda) foi realizada. No entanto, nenhum desses programas combinados região 3′-UTR de

ALDH1A3

com a sequência de miR-187. No entanto, aplicando a ferramenta RNA22, que não dependem de conservação de espécies cruzadas, é resistente ao ruído e permite G: U emparelhamento de mRNA alvo a sequência de sementes miRNA [13], confirmou um jogo entre o

ALDH1A3 Comprar e o miR-187 sequência de sementes (Fig 3A).

a) RNA22 previu heteroduplexes mRNA-miRNA. software v1.0 RNA22 previu três locais de ligação de miR-187 numa sequência de ARNm diferentes ALDH1A3. sítios de ligação putativos de miR-187 foram encontrados na região 5’UTR ALDH1A3 (I), região codificadora (CDS) (II e III) e 3’UTR (IV). Todos eles cumprir os critérios de um valor mínimo de pares de bases de 14 e um máximo de energia para cruzar -25. B) Análise de Western Blot mostra uma redução na expressão da proteína ALDH1A3 mediante a re-introdução de miR-187 (miR-187 miARN células transfectadas simulação), confirmando o efeito inibidor de miARN alvo através da sua putativa. As células foram transfectadas com o miR-187 miARN controlo negativo ou mímica e colhido após 72 horas. Os extractos celulares totais foram preparados e sujeitos a electroforese através de SDS-PAGE, seguida de imunotransf erência com anticorpos anti-ALDH1A3. Para garantir um carregamento de proteína igual a membrana foi imunotransferidas com anticorpo anti-actina β. C) Ensaio de repórter de luciferase realizada com luciferase do pirilampo sob o controlo do ALDH1A3 UTR 3 ‘confirmar a inibição da expressão de ARNm ALDH1A3 (20% de decréscimo de sinal da luciferase) sobre o miR-187 re-introdução. Os dados são apresentados em relação ao controle de vetores atribuído um valor de 100. A média ± S.E.M. de três experiências independentes é mostrado. D) A sobre-expressão de ARNm ALDH1A3 foi confirmada em uma coorte de tumores da próstata humanos (n = 96). Houve uma correlação inversa (estatisticamente não significativa) entre a infra-regulação de miR-187 encontrados nestas amostras eo aumento da regulação do ALDH1A3.

Para validar esses achados, que confirmaram a forte baixo Regulamentação do ALDH1A3 sobre miR-187 re-introdução por western blot em PC-3, LNCaP e DU-145 células (Fig 3B).

Para confirmar ainda mais o papel da

ALDH1A3

como um alvo de miR-187 de um plasmídeo repórter da luciferase contendo a sequência 3 ‘UTR de

ALDH1A3

foi clonado em células PC-3 transfectadas com o miR-187 mímico. A expressão intensificada de miR-187 actividade repórter (PC-3 de miR-187 mímico) significativamente reduzido de 3’UTR

ALDH1A3

constrói a cerca de 20% em comparação com o controlo (PC-3 NC imitador) (Fig 3C) .

os dados de qRT-PCR mostrou uma expressão mais elevada de

ALDH1A3

(1,2 vezes) quando comparado com as amostras re-expressam o miR-187 (dados não apresentados). Para além disso, comparou-se a expressão de

ALDH1A3

expressão do mRNA com a sub-regulação de miR-187 em duas coortes independentes de tumores primários de CaP FFPE (n = 96) (Figura 3D) e tecido fresco (n = 10) (Fig S1). No entanto, não há correlação entre

ALDH1A3

e os parâmetros clínico foi encontrado, e em seguida, como esperado,

ALDH1A3

não constituía um indicador prognóstico para ambos os BPFs (p = 0,773) ou PFS (p = 0,430 ) nesta série.

expressão da proteína ALDH1A3 foi ainda avaliada por imuno-histoquímica (IHQ) para os 195 casos incluídos no TMA (Fig 4). Descobrimos que ALDH1A3 foi significativamente (p 0,0001)-regulada em amostras de PCA (intensidade média = 1,42) quando comparado com o tecido da próstata normal (intensidade média = 0,12). Além disso, a fim de investigar o papel de

ALDH1A3

como um alvo de miR-187, estudou-se a correlação com a expressão de miR-187. Curiosamente, verificou-se que a expressão de miR-187 foi significativamente correlacionado inversamente (p 0,0001) com a expressão da proteína ALDH1A3. Estudamos ainda mais a correlação de

ALDH1A3

com os parâmetros clínico e prognóstico. Embora a expressão ALDH1A3 não constituía um indicador de prognóstico, encontramos uma correlação direta estatisticamente significativa com a pontuação de Gleason (p = 0,05). Assim, 37% dos casos, com uma escala de Gleason 7 mostrou alta intensidade ALDH1A3 da coloração em comparação com 56% dos APC com Gleason≥7

coloração imuno-histoquímica para ALDH1A3 é significativamente maior (p 0,0001). No tumor amostras (direita) do que nos controles normais (esquerda). A coloração entre diferentes tipos de tumor (Gleason inferior a 7, igual ou superior a 7) foi comparada encontrar uma correlação directa entre a classificação de Gleason e expressão ALDH1A3 (p = 0,05). coloração imuno-histoquímica é mostrado para ALDH1A3 (coluna da direita) em cada amostra, em conjunto com a hematoxilina -Eosina de tecido (coluna da esquerda).

Para explorar ainda mais o papel da

ALDH1A3

na definição de diagnóstico foi realizado um ensaio ELISA para medir expressão ALDH1A3 na urina (n = 123 ). Um modelo de regressão logística univariada foi realizada para avaliar a capacidade de previsão do presente biomarcador, em conjunto com o PSA, para a presença de CaP em biópsias de diagnóstico. A um nível de significância de 10%, PSA e ALDH1A3 ambos foram significativamente associados a uma biópsia positiva de PCA (Fig 5). Curvas

ROC de PSA e ALDH1A3 para a previsão de CaP em amostras de urina. As áreas sob a curva são 0.610 (95% CI 0,509-0,710; p = 0,036 e 0,591 (IC 95% 0,490-0,692;. P = 0,083), respectivamente, ao nível de significância de 10%, tanto PSA e ALDH1A3 foram significativamente associados com uma biópsia positiva de CaP.

Discussão

miRNAs estão previstas para controlar a atividade de aproximadamente 60% de todos os genes codificadores de proteínas, e foram mostrados para participar na regulação da vários processos celulares. ao emparelhar base para mRNAs, microRNAs mediar a repressão translacional ou degradação mRNA [4]. Tendo demonstrado anteriormente o papel de miR-187 na progressão e diagnóstico CaP [8], decidimos investigar mais potenciais alvos deste miRNA que pode ser também de interesse como biomarcadores. para este efeito, reintroduzido miR-187 precursor em células PC-3 e realizada uma abordagem proteómica.

As sequências reconhecidas por sementes de miARN são encontradas em muitos genes, o que torna difícil identificar relações miRNA-alvo fisiologicamente relevantes de análise da sequência sozinho [14]. Além disso, os resultados anteriores obtidos por Yang et ai. [6] e Schramedei et al. [15] confirmou que menos de 10% de proteínas identificadas por uma abordagem proteómica foram previstos pelos algoritmos normalmente utilizadas, tais como PicTar, TargetScan e Miranda. Em linha com estas conclusões, nenhuma das proteínas identificadas pela triagem proteômica no presente estudo foram previstos

in silico

pelos algoritmos acima mencionados. No entanto, usando a ferramenta RNA22 foi possível encontrar uma correspondência entre o miR-187 e nossa meta potencial no

ALDH1A3

região codificadora (CDS). Este algoritmo é diferente dos métodos previamente relatados na medida em que não utiliza um filtro de conservação de sequências inter-espécies, permitindo assim a descoberta de locais de ligação de microRNA que podem não estar presentes em espécies estreitamente relacionadas [13]. Além disso, RNA22 leva em conta a hipótese de que, para além de 3’UTRs, numerosos locais de ligação são susceptíveis de existir em 5’UTRs CDS e permitindo a identificação de heteroduplexes anteriormente não identificados miARN /ARNm.

Neste estudo , 9 alvos putativos de miR-187 foram identificados por 2D-DIGE MS e análise (Tabela S1). Destes foram selecionados aldeído desidrogenase 1A3 (

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) para uma avaliação mais aprofundada, pois tem sido descrita a ser regulada por andrógenos [16]. análise de Western blot, qRT-PCR e IHC confirmaram a regulação direta de

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por miR-187. Em primeiro lugar, a correlação inversa entre ALDH1A3 e miR-187 foi confirmada pela recuperação de miR-187 expressão em PC-3, LNCaP e as células DU-145, o que levou a uma diminuição da regulação dos níveis de proteína ALDH1A3. Em segundo lugar, o efeito inibidor de miR-187 em ALDH1A3 expressão foi ainda confirmada por um ensaio de repórter de luciferase que mostrou uma diminuição na expressão ALDH1A3 (redução de -20% no sinal da luciferase) sobre o miR-187 transfecção mímica. Em terceiro lugar, a inibição de

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foi observado quando a análise de um grupo de amostras de pacientes humanos APC, ambos os tecidos frescos e FFPE. Nestes grupos, o forte sub-regulação de miR-187 foi acompanhada por um aumento

ALDH1A3

expressão de ARNm. Adiante, o papel de

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como alvo o miR-187 foi confirmada por análise de IHC. Assim, ALDH1A3 verificou-se ser regulada para cima em tumores da próstata e a expressão desta proteína está inversamente correlacionada com a expressão de miARN. Além disso, o papel potencial dos

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como foi avaliada candidato biomarcador de prognóstico para APC, embora na coorte de amostras analisadas não forneceu qualquer informação adicional. No entanto, a associação de

expressão ALDH1A3

com pontuação de Gleason fornece evidência de um aumento no

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expressão com o estadiamento do tumor. Foi anteriormente postulado que a perda de miR-187 durante a progressão CaP pode indicar um papel como supressor de tumor [8]. Além disso, ALDH1A3 foi encontrado para cooperar com a PSA na previsão de o resultado da biópsia. Para além da sua associação com a presença do tumor no IHC de lâminas FFPE, fomos capazes de medir ALDH1A3 em amostras de urina, encontrar uma associação positiva com a aparição de tumores.