câncer

Abstract

próstata continua a ser a neoplasia maligna mais comum entre os homens nos Estados Unidos, e não há remédio atualmente disponível para o estágio avançado hormônio-refratário cancro. Isto é em parte devido à compreensão incompleta das proteínas reguladas-andrógenos e suas funções codificadas. proteomas de células inteiras de e células LNCaP tratados com andrógenos foram analisados ​​por semi-quantitativa mudpit ESI- ion trap MS /MS e quantitativa iTRAQ MALDI- TOF plataformas MS /MS, com a identificação de mais de 1300 proteínas de alta confiança sedentos de andrógeno. Um mapeamento via baseada no enriquecimento dos conjuntos de dados regulada proteomic-andrógenos revelou uma desregulação significativa de aminoacil tRNA sintetases, indicando um aumento na proteína biosynthesis- uma marca durante a progressão do cancro da próstata. Esta observação é apoiada por immunoblot e transcrição de dados de células LNCaP e tecido de câncer de próstata. Assim, os dados derivados de múltiplas plataformas proteômica e dados de transcrição juntamente com a análise informática fornece uma visão mais profunda sobre as consequências funcionais da ação dos androgênios no cancro da próstata

Citation:. Vellaichamy A, Sreekumar A, Strahler JR, Rajendiran T, Yu J, Varambally S, et al. (2009) proteômica Interrogatório de andrógeno acção em células cancerosas da próstata revela Roles de aminoacil tRNA Sintetases. PLoS ONE 4 (9): e7075. doi: 10.1371 /journal.pone.0007075

editor: Lennart Randau, Universidade de Yale, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de julho de 2009; Aceito: 29 de julho de 2009; Publicação: 18 de setembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Vellaichamy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pela Michigan Tecnologia Tri-Corredor, Desenvolvimento Económico Michigan Corporação concessão 687 para o Michigan Proteomics Alliance for Cancer Research (GSO, AMC, aS, AV), os Institutos Nacionais de Saúde concede U54DA021519 para o Centro Nacional de Integrative Biomedical Informática (GSO, AMC), R01CA126239 (AN), RO1CA133458 (aS, AMC) U01 CA111275 (AMC), 1K99CA129565-01A1 (JY), e CA69568 P50 (AMC, aS), Departamento de Defesa PC080665 (JY), ea Fundo para Descoberta da Universidade de Michigan Comprehensive Cancer Center (aS). AMC é apoiado por uma concessão Science Translational Clínica pela Burroughs Bem-vindo Foundation e é um investigador do Howard Hughes Medical Institute. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro da próstata (PCA) é o câncer mais comumente diagnosticado entre os homens nos Estados Unidos, com uma estimativa de 200.000 novos casos e 29.000 mortes em 2008 [1]. Muitos relatórios sugerem que os andrógenos que são necessários para o desenvolvimento normal da próstata também suportar o crescimento e a progressão de CaP. Os androgénios exercem os seus efeitos celulares através da ligação ao receptor de androgénio (AR), um membro do receptor de hormona nuclear (NR) super família. AR, por sua vez, liga-se a elementos de resposta de androgénio (Ares) nas regiões promotoras e potenciadoras de genes alvo, agindo como um regulador da transcrição de transdução do sinal da hormona cognata no núcleo [2], [3]. terapia do cancro da próstata por meio de ablação androgênica inicialmente atinge a regressão de tumores; No entanto, uma forma mais agressiva, refractário a hormonas do tumor (RH-PCA) pode evoluir, com mortalidade subsequente. Embora vários grupos tenham interrogado mudanças regulada por andrógenos nos níveis transcriptoma e proteoma usando matrizes de expressão gênica e espectrometria de massa, respectivamente [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10 ], ainda existe uma considerável falta de compreensão sobre a consequência funcional da acção da hormona durante o desenvolvimento do cancro da próstata. Em parte essa deficiência é um reflexo da escassez nos dados de proteômica; devido às limitações de proteomic tecnologias, o número total de proteínas identificadas e quantificadas por um único estudo é modesta. Além disso, existem desafios técnicos de tais sub-representação das proteínas e na avaliação da significância estatística das diferenças na expressão de proteínas.

Para superar estes desafios, e para obter uma visão mais profunda alterações proteômicas regulada por andrógenos em cancro da próstata, aplicamos uma estratégia em duas vertentes. Primeiro, temos melhorado a respiração do proteoma regulada por androgénio perfilado neste estudo, empregando dois (MS) plataformas complementares espectrometria de massa: uma que envolve a marcação isotópica de peptídeos com um reagente iTRAQ seguido por cromatografia líquida de 2D (LC) MALDI- TOF a análise MS /MS em um ABI 4800 MALDI conjunto de tempo de voo (/TOF TOF) instrumento [11] eo outro uma abordagem livre de etiqueta com base em contagem espectral [12], [13], [14], [15] utilizando proteína multi-dimensional tecnologia de identificação (mudpit) [16] com Ionização por Electrospray (ESI) – ion trap MS /MS num instrumento de armadilha de iões linear (LTQ). Em segundo lugar, elucidaram os alterações proteômicas no contexto das vias funcionais usando Molecular Conceitos Mapping (MCM, também chamado Oncomine Conceitos Mapping (OCM)) [17], para obter uma visão mais profunda sobre a biologia da ação dos androgênios no câncer de próstata. Notavelmente, tais análises combinatórias revelou um aumento marcante no nível de aminoacil tRNA (RAA), que podem estar subjacentes ao aumento na biossíntese de proteínas previsto no cancro da próstata por vários estudos de expressão gênica.

Resultados

Nós empregamos uma estratégia integrativa (Figura 1) para compreender a ação andrógeno no cancro da próstata. Em resumo, foi realizada em massa baseada em espectrometria de profiling proteoma de células privados de androgênio e LNCaP estimuladas por andrógenos. proteínas digeridas com tripsina foram identificados e quantificados usando duas plataformas de espectrometria de massa: iTRAQ MALDI-TOF MS /MS e mudpit ESI de ião armadilha de MS /MS. Os dados a partir de cada uma destas plataformas foram normalizados independentemente e combinadas para gerar uma lista de proteínas reguladas de androgénio. O proteoma regulada andrógeno foi interrogado por associações biológicos utilizando Molecular Conceitos Mapping (MCM). Dos muitos conceitos moleculares, incluindo os conceitos regulados por andrógenos e câncer de próstata que foram enriquecidos por nossa andrógeno-regulada conjunto de dados, o conceito que descreve elevada aminoacil tRNA sintetases (aaRSs) foi selecionada para uma análise mais aprofundada. Um subconjunto destas proteínas foi validado por análise de imunotransferência. Usando perfis do transcriptoma e imunoprecipitação da cromatina, mostrámos que androgénio conduz a expressão de aaRSs ao nível da transcrição. Por fim, mostramos a existência do nicho RAA elevada durante a progressão do câncer de próstata usando amostras clínicas.

células LNCaP andrógeno-estimuladas foram perfilado usando tanto quantitativa iTRAQ MALDI- TOF /TOF e semi-quantitativa mudpit ESI- LTQ proteômica plataformas. Os dados de cada uma destas plataformas foram normalizados independentemente e combinadas para gerar uma lista de proteínas reguladas-andrógenos. Esta lista foi interrogado por associações biológicos utilizando Molecular Conceitos Mapping (MCM). O conceito descrevendo sintetases aminoacil tRNA foi selecionado para uma análise mais aprofundada; proteínas selecionados foram validados utilizando immunoblot e imunofluorescência. perfilamento do transcriptoma e cromatina imunoprecipitação mostraram que a expressão de androgénio conduz sintases aminoacil-ARNt no nível de transcrição. Este foi ainda confirmada usando dados de expressão gênica tecido canceroso e análise de immunoblot em amostras de tecido da próstata, o que demonstrou a existência do elevado sintase nicho aminoacil-tRNA durante a progressão do câncer de próstata.

Identificação e quantificação relativa de LNCaP proteínas por iTRAQ MALDI-TOF MS /MS

Usando plataforma iTRAQ MALDI-TOF MS /MS, foram identificadas 904 proteínas com pontuações confiança em alta, conforme determinado com SEQUEST [18], PeptideProphet [19] e ProteinProphet [20] ferramentas computacionais. Destes, 879 foram quantificadas normalização pós-dados (Figura 2A), com a identificação da proteína total FDR de menos de 1% (ver Materiais e Métodos para detalhes).

A) de Venn diagrama que mostra o número do total e os sub-conjuntos de proteínas reguladas por andrógenos identificados a partir da análise iTRAQ MALDI TOF- MS /MS. Um limiar mínimo de 1,25 DP da média global em ambas as amostras tratadas de androgénios e não menos do que 1,5 SD em uma das amostras tratadas foi definida andrógenos. B) diagrama de Venn mostra os números de proteínas totais e LNCaP regulada de androgénios identificados em mudpit (ião armadilhagem /MS ESI MS). Proteínas mostrados entre parênteses não foram consideradas para análise diferencial por causa de suas contagens espectrais inferiores. diagrama C) Venn, mostrando o número total de proteínas identificadas a partir de duas plataformas por espectrometria de massa e sua sobreposição. D) diagrama de Venn, mostrando o número total de andrógeno-se regulamentados proteínas identificadas a partir de duas plataformas por espectrometria de massa e sua sobreposição. diagrama de Venn E. mostrando o número total de proteínas andrógeno regulada identificados a partir de duas plataformas por espectrometria de massa e sua sobreposição.

Em termos processuais, o proteoma andrógeno foi avaliada por iTRAQ usando duas réplicas biológicas independentes. Um experimento iTRAQ double duplex foi realizado no qual amostras tratadas com andrógenos em cada repetição foram marcadas com os 115 e 117 marcas isobáricos enquanto respectivas amostras de controlo correspondentes foram rotulados com os 114 e 116 marcas isobáricos. A fim de derivar um limiar para definir as mudanças da expressão da proteína, que normalizou a proporção relativa de proteína para cada uma das amostras tratadas de androgénio e um dos controlos (marcado com etiqueta isobárica 116) para a expressão da proteína na amostra de controlo marcado com o 114 tag isobaric. A distribuição de todas as proporções de proteína para a amostra tratada de androgénios (115 tag) versus o controlo (116 tag) é mostrado na Figura S1A suplementar. Mais de 80% das proteínas tinham razões dentro do intervalo de 0,8-1,2. A normalização centrado-mediana resultou num significativo próximo da unidade para todas as amostras, e o desvio padrão da repetição de controle (tag 116, SD = 0,16) foi usada como uma escala para ajustar a relação de limiar de proteínas diferencialmente expressas. Por conseguinte, as alterações com um limiar mínimo de 1,25 SD (proporção de 1,2 para up-regulada e 0,83 para down-regulamentado) foram considerados significativos (ver Materiais e Métodos para mais detalhes). As listas de todos os 70 andrógeno-regulada e 39 proteínas regulada identificados a partir desta análise são apresentados no Suplementar Tabela S1 e S2 Suplementar Tabela, respectivamente.

comparação semi-quantitativa de proteínas utilizando análise mudpit

Usando mudpit ESI- ion trap MS /MS abordagem profiling proteômica 857 proteínas foram identificadas com a pontuação mínima probabilidade de proteína de 0,9 (estimado FDR inferior a 1%); 67% (574) deles foram identificados em comum entre o controlo e as amostras tratadas de androgénios, enquanto 126 157 proteínas e as proteínas foram identificadas apenas em controlo e amostras tratadas com andrógenos, respectivamente (Figura 2B). Além de determinar a presença ou ausência de proteínas, foi realizada uma análise estatística para comparar as contagens espectral relativa de proteínas em cada tratamento. O número total de espectros a partir de qualquer dos dados tratados de androgénio ou de controlo foi normalizada de forma independente, e as contagens cumulativas espectrais normalizados de todos os péptidos para cada proteína foram usadas como uma medida da abundância de proteína. Com base na análise estatística de dados, as proteínas foram designadas como expresso diferencialmente, se eles só foram identificados tanto no controlo (regulados negativamente) ou androgénio amostra tratada (sobre-regulada) com quatro ou mais péptidos. Para as proteínas identificadas em ambas as amostras, os rácios de contagem espectral normalizado de dois desvios padrão acima ou abaixo da média de todas as proteínas em que grupo (o que corresponde a uma mudança de quatro vezes) foi usada como ponto de corte (ver Materiais e Métodos; ver suplementar Figura S1B para distribuição dos rácios de contagem espectrais normalizados para as proteínas identificadas no controle e amostras tratadas com andrógenos). Com base nestes critérios, 65 e 57 proteínas foram designados como andrógeno-regulada e regulada para baixo, respectivamente (Tabela Complementar S3, Tabela upplementary S4).

lista combinada de proteínas diferencialmente expressos identificados a partir das duas plataformas MS

com o entendimento de que a lista de péptidos por espectrometria de massa perfiladas é influenciada pela fonte de ionização e o analisador de massa [21] (neste caso MALDI- TOF armadilha contra-ião ESI), que a proteína combinada listas derivadas das duas plataformas MS para derivar uma lista composta. Isto foi facilitado pelo facto de que as duas plataformas identificado um número semelhante de proteínas confiança elevada (857 e 879 a partir de proteínas e mudpit iTRAQ, respectivamente, com FDR comparável de menos do que 1%). Como um primeiro passo no processo, as proteínas não redundantes foram abatidos a partir de cada experiência, convertendo os seus números de acesso IPI aos IDs de genes. Três proteínas (lectina, manose de ligação 2, LMAN2; CLPX, caseinolítica peptidase X homólogo, e 40S proteína ribossômica S9, RPS9), que mostrou as tendências discordantes em sua expressão entre as duas plataformas foram removidos. Estes procedimentos produziram um total de 844 e 875, respectivamente, as proteínas, para mudpit e conjuntos de dados iTRAQ (Figura 2B, 2A). Juntos 1306 proteínas foram observados no conjunto de dados combinado (Figura 1 e Figura 2C). Destes, 126 proteínas originais estavam elevados quando do tratamento de androgénio. Notavelmente, 9 dessas proteínas andrógeno-up regulados sobreposta entre as duas plataformas proteômica (Figura 2D): KLK3, ACSL3, FASN, FKBP5, AARS (alanil-tRNA sintetase), FDFT1 (farnesil-difosfato farnesiltransferase 1), UAP1 (UDP pirofosforilase uma N-acteylglucosamine), ENDOD1 (domínio endonuclease contendo 1), e NDRG1. A lista regulada combinada continha 95 proteínas, e um (HNRPL, heterogêneo ribonucleoprote�a nuclear L isoformas a) era comum entre iTRAQ e plataformas mudpit (Figura 2E).

A nossa lista de proteínas up-regulamentados incluídos cinco proteínas que tenham sido mostrado previamente para ser elevado por ação dos androgênios: ACSL3 (relação iTRAQ 2,76), FKBP51 (iTRAQ relação de 1,91; mudpit espectral conta 17:00), FASN (iTRAQ relação de 1,85; mudpit espectral conta 417:45), NDRG1 (iTRAQ rácio 1,76; mudpit espectral conta 05:00), e KLK3 (também conhecido como PSA, Prostate Specific Antigen [22], o rácio iTRAQ 1,44; mudpit proporção 11:00). A comparação quantitativa directa de proteínas identificadas em ambas as plataformas MS mostrou uma alta correlação positiva (R2 = 0,92) por três proteínas (ACSL3, FASN e AARS, ver a figura S1 Suplementar). Estas descobertas validados de forma independente o nosso procedimento de normalização e os limiares que foram utilizados para criar a lista combinada de proteínas reguladas por andrógenos. Além disso, a análise de imunotransf erência foi utilizado para confirmar o androgénio-regulação de um subconjunto de proteínas sobre-regulada (Figura 3A). Notavelmente, além de validar os nossos resultados de espectrometria de massa, a análise de imunotransferência revelou uma compressão significativa na mudança vezes da expressão da proteína delineada por iTRAQ experiência (Figura 3A). Uma verificação ortogonal semelhante realizada para o androgénio sobre-regulada sintase dos ácidos gordos de proteína por microscopia immunofluorescence- é mostrado na Figura 3B.

a) Variação dobra Expressão de proteínas reguladas de androgénios em quantificação por espectrometria de massa em comparação com a avaliação de imunotransferência . São mostradas as faixas de immunoblot e suas intensidades para andrógeno proteínas-regulada e seus rácios de intensidade calculados, bem como índices iTRAQ e mudpit contagens espectrais para as proteínas correspondentes. Beta-tubulina é usado como um controlo de carregamento de amostra. B) coloração por imunofluorescência de AR (vermelho) e FASN (verde) na sequência de veículo (etanol) e 1 nM R1881 tratamentos durante 48 h em células LNCaP. O tratamento foi dado após 48 h de privação de andrógeno.

Análise de andrógeno-regulada processos biológicos e caminhos por análise MCM

Para obter insights sobre a consequência funcional do andrógeno-action, a análise de associação em larga escala foi realizada a comparação de nosso andrógeno-regulada conjunto de dados de proteína de 126 proteínas com cada um dos 13364 conceitos no MCM [23]. O procedimento envolvido na selecção de conceitos moleculares significativos é descrita na secção ‘Materiais e Métodos’. A rede de enriquecimento resultou na análise MCM com o conjunto combinado de androgénio proteínas sobre-regulada é apresentado na Figura 4. É importante notar, a análise mostrou enriquecimento de conceitos específico do cancro da próstata conhecido e regulada de androgénios, proporcionando assim uma validação dos dados proteomic gerado neste trabalho (Figura 4, as arestas de cor vermelha). Aninhada dentro desses conceitos específicos da próstata previamente conhecidos foi um que descreveu um conjunto de genes co-enriquecido regulada para baixo em pacientes com câncer de próstata após a terapia pós-neoadjuvante (anti-andrógeno) [17]. conceitos adicionais de significado incluídos os de aminoacil-tRNA biossíntese e ER para Golgi de transportes (GO processo biológico), de transferência de aminoacil RNA sintetase Classe II (InterPro) e RSRFC4 (MEF2A) e NKX3A (ambos TRANSFAC). Ficamos intrigados por aqueles conceitos que se refere o aminoacil tRNA sintetases (KEGG via: https://www.genome.jp/kegg/[24], [23]), pois eles potencialmente refletir uma elevação na utilização de aminoácidos e, portanto, uma aumento na biossíntese de proteínas a jusante sobre o tratamento do andrógeno (Figura 4, bordas coloridas azul). Esta observação está de acordo com o nosso gene de predição baseada em expressão do aumento da síntese proteica como uma das características mais cedo durante o desenvolvimento do cancro da próstata [17]. atividade RAA elevada também estava entre os conceitos significativos enriquecida por dados de transcriptoma combinados para células LNCaP andrógeno tratados (dados não mostrados). Assim, essas observações levaram-nos a selecionar o tRNA conceito aminoacil para análises posteriores.

Vista Rede de conceitos moleculares ou conjuntos de genes biologicamente relacionados enriquecidas em andrógeno-regulada conjunto de proteínas obtidas através Mapping Concepts Molecular (MCM) análise. Cada nó representa um conceito biológico; o tamanho do nó é proporcional ao número de genes em cada conceito. Cada ponta representa um enriquecimento significativo estatisticamente. P-valor de cada conceito e o número MCM do conceito são dadas em parêntesis. O conceito mais enriquecido é indicado por uma borda grossa. bordas coloridas vermelhas indicam o enriquecimento de conceitos específicos do câncer de próstata e regulada por andrógenos conhecidos. conceitos sintetase Interligado aminoacil tRNA são indicados em bordas azuis no fundo da rede.

regulação androgênica de aminoacil tRNA sintetases

Foram 7 proteínas na categoria AARS que excedeu o conjunto limite na lista combinada de proteínas definido usando ambas as plataformas MS: AARS para alanina (AARS), fenilalanina (FARSLA), glicina (GARS), histidina (HARS), asparagina (NARS), treonina (TARS) e triptofano (guerras). Destes apenas AARS e HARS foram nomeados pela plataforma mudpit (Tabela S3), enquanto AARS eo resto foram nomeados pelo estudo iTRAQ (Tabela S1). Embora, os números totais de RAA identificados em iTRAQ e experiências mudpit eram 14 e 13, respectivamente, várias destas proteínas foram identificadas com menos de quatro péptidos em ensaios mudpit tornando-o menos fiáveis ​​para a quantificação baseado contagem espectral. Isto também indica que a natureza abundante baixo desta classe de proteínas crítica. Portanto, nós nos concentramos para analisar ainda mais o aaRSs iTRAQ identificou e examinou se houver compressão na relação de expressão, apesar de sua expressão elevada. Dos 14 aaRSs identificados no estudo iTRAQ, seis tinham rácios iTRAQ 1.2 e acima, e três deles tinham taxas de 1.1 e acima, tanto tratados com andrógeno (115 e 117) replicam amostras. A sobre-expressão da maioria destes (nove de 14) está representado na aaRSs um mapa de calor (Figura 5A). Um subconjunto destes iTRAQ identificado aaRSs (GARS, KARS, guerras) e foram validados utilizando células LNCaP tratadas de androgénio por análise de imunotransferência (Figura 5C). Além disso, foram examinados os níveis de transcrição, utilizando dados de expressão de genes correspondentes para as células LNCaP tratadas de androgénios (ver secção Materiais e Métodos). Nove dos catorze proteínas identificadas pelo nosso perfis proteína foram elevados no nível transcrito entre experiências de expressão de genes independentes (Figura 5B). Esta regulação revelou potencial destas proteínas por activação da transcrição por androgénio. Estes dados também suportam a observação de compressão na mudança vezes da expressão da proteína em proporções iTRAQ.

Um mapa) de calor que mostra a expressão elevada de aminoacil-ARNt sintetases identificados a partir de experimento iTRAQ. Somente proteínas em negrito são designados como andrógeno-regulada nos dados iTRAQ com base no limiar de corte utilizado. B) mapa de calor que mostra a concordantes sobre-expressão de transcritos medidos utilizando microarrays oligonucleótido (Affymetrix U133 mais 2,0) para aminoacil-ARNt sintetases mostrados em A. C) Análise de imunotransferência da aminoacil-ARN t sintetases GARS, KARS, e guerras em resposta a tratamento de androgénio em células LNCaP. Beta-tubulina é utilizado como controlo de carga. D) A análise de imunotransferência de KARS GARS e em cancro da próstata localizado (APC), e cancro da próstata metastático (MET) em comparação com (benignos) tecidos normais da próstata. Beta-actina é utilizado como controlo de carga. E) Promotor de ocupação de AR em tARN aminoacilo genes. análise da cromatina imunoprecipitação (CHIP)-PCR mostra o enriquecimento andrógeno-dependentes de AR-vinculativo para os promotores alvo de

GARS

e

KARS

. taxas de enriquecimento foi calculado com base na quantidade de amplificação do alvo em relação ao ADN de entrada, com iniciadores para

GAPDH

promotor utilizado como controlo. As sequências iniciadoras que abrangem os promotores de genes são dadas na Tabela S5. F) Meta-análise dos genes aminoacil t-RNA (de proteínas mostrados em A) em toda a expressão do gene do câncer de próstata três perfis estudos. Ver Oncomine mapa de calor que mostra a sobre-expressão de um subconjunto de genes de aminoacil-ARNt sintetase no cancro da próstata localizado em comparação com os respectivos controlos benignos. símbolos de genes de proteínas que passam pelo valor de corte e foram atribuídos como andrógeno-regulada nos dados iTRAQ são indicadas em negrito. P-valor representa o significado de expressão em dois dos três estudos. Vermelho, branco, e azul (não presente na figura) indica relativa sobre, inalterada, e sob expressão, respectivamente.

Os andrógenos mediar o seu efeito positivo sobre a transcrição através da ligação ao receptor de andrógeno, que por sua vez liga-se a elementos de resposta dos androgênios na promotores de genes-alvo [25]. Assim, procedeu-se a examinar andrógeno ligação aos promotores de aminoacil tRNA sintetases usando imunoprecipitação da cromatina (ChIP, ver Materiais e Métodos). Figura 5E mostra exemplo representativo do aumento da ocupação de AR sobre o promotor de

GARS

e

KARS

confirmando regulação andrógeno de sua expressão ao nível da transcrição.

A seguir estendemos o nosso observação linha de células de amostras de tecido de cancro da próstata. Em primeiro lugar, foi utilizado o banco de dados Oncomine (www.oncomine.org) para realizar uma meta-análise para a aminoacil tRNA sintetase transcrições em vários estudos de câncer de próstata [26]. Um subconjunto de aaRSs verificou-se ser regulada para cima em amostras de cancro da próstata localizados em mais do que um estudo (Figura 5F). Esta observação foi confirmada utilizando análise de imunotransf erência de amostras derivadas da próstata que incluem, o cancro da próstata benigna localizada adjacente, e doença metastática. Importante, quatro dos cinco CaP localizada e quatro dos cinco CaP metastático apresentaram expressão elevada de KARS e GARS quando comparado com três dos quatro amostras benignas testados (Figura 5D). Estes dar credibilidade a um possível papel do aminoacil regulada andrógeno-tRNA sintetases ação durante a progressão do câncer de próstata.

Discussão

Para delinear os processos e caminhos biológicos que estão desregulados por andrógeno no cancro da próstata, nós adoptada uma estratégia de perfilamento proteomic baseada em MS mundial acoplado ao mapeamento via à base de enriquecimento na linha celular de cancro da próstata LNCaP responsivos aos andrógenos. Nós perfilado do proteoma de células LNCaP, com e sem tratamento de androgénio usando duas plataformas proteomic: quantitativo iTRAQ MALDI-TOF MS e mudpit semi-quantitativo MS ion trap. Cada uma das plataformas independentemente identificadas em excesso de 850 proteínas confiança em alta, produzindo um total de 1306. O ganho em contagens cumulativas de proteína é consistente com relatórios anteriores que descrevem a vantagem de interrogar proteomas globais usando espectrometria de massa plataformas complementares [21], [27] . Fomos capazes de identificar 126 proteínas que foram up-regulados mediante o tratamento do andrógeno. Incluído foram alvos conhecidos de ação dos androgênios: KLK3, FKBP5, FASN, AGR2 (anterior gradiente homólogo 2), sord (sorbitol desidrogenase), NDRG1, ACSL3 e FOLH1 (folato hidrolase 1). Além disso, aninhado nos compêndios de proteínas diferencialmente reguladas, eram novos alvos de ação dos androgênios que incluíam PCID1 (domínio PCI contendo 1), RAB10 (de ligação GTP proteína ras relacionadas RAB10) e PEA15 (fosfoproteína enriquecida em astrócitos 15).

Uma vantagem adicional de utilizar a estratégia de perfis baseados íon armadilhagem em conjunto com TOF-TOF base de perfis quantitativa era que os dados da antiga ajudou a compensar a perda de resolução resultante da iTRAQ taxa de compressão visto no último. Isto permitiu o uso de nível limite inferior de quantificação baseado em iTRAQ para análise de perturbação. A taxa de compressão foi amplamente divulgado por outros, por exemplo, [28], e é bem ilustrado pela comparação directa das razões para iTRAQ proteínas reguladas de androgénio com a expressão correspondente tal como avaliado por análise de imunotransferência (Figura 3). Como um exemplo, FASN proteína foi identificada com 17 péptidos; entre os quais o péptido mais diferencialmente expressos apresentavam uma proporção de 2,79 iTRAQ. Notavelmente, uma média de todas as proporções iTRAQ para 17 péptidos resultou numa proteína rácio iTRAQ mais comprimido de 1,85, enquanto que a análise à base de densitometria da sua expressão por imunotransferência revelou alteração dobra de oito e a análise de imunofluorescência também mostrou uma expressão bastante elevada. Esta conclusão é suportada pela contagem espectral dos dados, em que mudpit FASN foi representada por 417 espectros na amostra tratada de androgénios em comparação com apenas 45 espectros na amostra de controlo. Essa taxa de compressão, embora observado em outros estudos, foi mais proeminente em nossos dados /TOF iTRAQ MALDI- TOF em comparação com outras plataformas quantitativos MS tais como ICAT [9]. Essa diferença pode ser explicada por uma maior janela de tolerância de massa para a seleção de íons peptídicos para MS /MS fragmentação no analisador de massa TOF /TOF ABI 4800 usado aqui [29]. Acreditamos que esta compressão em relação poderia explicar em parte a baixa sobreposição entre os conjuntos de proteínas reguladas por andrógenos nomeados de cada uma das duas plataformas de MS. Além disso, fatores como diferenças no processamento de péptidos (marcado contra sem rótulo), fracionamento peptídeo (on-line e off-line), aquisição de dados MS (ion trap contra o analisador de massa TOF /TOF), a normalização de dados (índices de contagem espectrais contra proporções de iTRAQ rótulo intensidades de pico), e as propriedades de péptidos seleccionados por MS /MS de sequenciação poderão desempenhar um papel central na falta de concordância global. Estes factores, para além das variações biológicas, tais como as várias formas de splicing para um único adesão podem também ter contribuído para estas três proteínas que revelaram uma tendência discordantes entre as duas plataformas observados.

De facto, tem sido estabelecido que diferentes plataformas proteomic mostram diferenças substanciais nas propriedades físico-químicas dos péptidos identificados [30]. Assim, a estratégia de usar dois espectrômetros de massa diferentes, que diferem tanto em sua fonte de ionização e princípio da detecção de peptídeo, nos permitiu construir uma lista de aditivos de proteínas e ganhar uma compreensão mais profunda do proteoma regulada por androgénio. Com análises maior enriquecimento nível, o nosso estudo mostrou que os subconjuntos de proteínas, designadas por cada uma das duas plataformas, mapa de conceitos semelhantes, incluindo aqueles que são andrógeno-derivado e câncer de próstata derivado. Com uma configuração de limite rigorosos para o semi-quantificação baseado em contagem espectral, o experimento mudpit havia nomeado apenas dois candidatos aaRSs como andrógeno regulado. No entanto, devido à nomeação de maior número de aaRSs de experiência iTRAQ, rede conceito molecular com conjunto de dados combinado mostrou um conjunto de AARS conceitos interligados com pontuações significativas (Figura 4). Ainda mais intrigante, no entanto, era que cada uma das duas listas independentes de proteínas, quando analisado em separado utilizando análise MCM, enriquecida para os conceitos que foram conhecidos por estarem associados com a progressão do cancro da próstata, mas não foram identificados na análise do conjunto de dados combinado (figura 4, suplementar Figura S2). Um exemplo disso foi o enriquecimento de conceitos sobre-expressão ETS (ETV1 e ERG) pelas proteínas reguladas por andrógenos nomeados pela análise mudpit. Isto foi interessante no contexto de relatórios anteriores que descrevem a existência de fusões de genes recorrentes envolvendo factores de transcrição ETS ser pathonomonic para o desenvolvimento do cancro da próstata [31], [32]. Estas fusões de genes foram mostrados para trazer factores de transcrição ETS sob controlo de androgénio, e ETV1 (cromossoma 7p21) é conhecido por ser sobre-expresso por androgénio através do seu rearranjo para 14q13.3-14q21.1 região do cromossoma 14 na linha celular LNCaP estudada aqui [31]. À medida que o número de proteínas ETS regulada identificados em mudpit foi suficiente para mapear os ETS sobre-expressão de conceito, a falta de proporção semelhante desta classe de proteínas na plataforma iTRAQ possivelmente resultou no desaparecimento do mesmo conceito na análise combinada. Assim, a utilização de múltiplas plataformas de espectrometria de massa ajuda a elucidar vários papéis de ação dos androgênios.

Além de processos biológicos regulados por andrógenos previamente conhecidos associados com a progressão do câncer de próstata, como NDRG1 [33], que ajudou a validar o nosso estudo de proteômica, a nossa lista de proteínas reguladas por andrógenos foi enriquecido para sintetases aminoacil tRNA. Vários aaRSs que são conhecidos por desempenhar um papel fundamental na biossíntese de proteínas, foram incluídos neste conceito. Este achado foi interessante no contexto de gene anterior previsões com base em expressão do nosso laboratório: um aumento na síntese de proteínas durante a progressão do cancro da próstata impulsionado por acções de factores de transcrição ETS [17]. Estas observações levam-nos a validação deste achado em vários níveis;