Abstract

O

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

modelo de câncer de próstata do rato exibe fases de hiperplasia e câncer claramente definidas. Aqui, as fases iniciais de desenvolvimento da hiperplasia são estudados. coloração imuno-histoquímica mostrou que

+ células hiperplásicas PAKT acumulados sobre-expressar luminal CK8 marcador de células epiteliais e marcadores de células epiteliais marcadores de células progenitoras CK19 e Sca-1, mas não basais. Por perfil de expressão foram identificados novos marcadores de células hiperplásicas, incluindo Tacstd2 e Clu. Além disso, mostramos que a jovens próstatas etárias de alvo

PTEN

camundongos knockout contido na camada de células epiteliais luminal única pAkt

+ células, que overexpressed CK8, Sca-1, Tacstd2 e Clu; células epiteliais basais eram sempre pAkt

-. Importante, na camada de células epiteliais luminal de próstatas normais detectamos rara Clu

+ Tacstd2

+ Sca-1

+ células progenitoras. Estas células novas são tumor candidato células em

PTEN

camundongos knockout iniciar. Notavelmente, todas as células epiteliais luminais na região proximal de próstatas normais foram Clu

+ Tacstd2

+ Sca-1

+. No entanto, em

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos, a próstata proximal não contém focos hiperplásica. focos hiperplásico pequeno em próstatas de

PSA-Cre; Pten-loxP /+

ratos encontrados na velhice, mostrou completa

Pten

inactivação e um perfil progenitor marcador. Por fim, apresentamos um novo modelo de desenvolvimento da próstata e renovação, incluindo as células progenitoras epiteliais luminais de linhagem específica. Propõe-se que

deficiência Pten

induz uma mudança no equilíbrio de diferenciação para a proliferação dessas células

Citation:. Korsten H, Ziel-van der Feito A, Ma X, van der Kwast T, Trapman J (2009) Acumulando células progenitoras na célula luminal epitelial são Tumor Candidato Iniciando células em uma

Pten

Knockout Modelo rato do cancro da próstata. PLoS ONE 4 (5): e5662. doi: 10.1371 /journal.pone.0005662

Autor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Alemanha |

Recebido: 04 de fevereiro de 2009; Aceite: 28 de abril de 2009; Publicado em: 22 de maio de 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Korsten et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma concessão do holandês Cancer Society KWF (número Grant: EMCR 2.006-3.592, www.kwfkankerbestrijding.nl). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o tumor mais comum em homens em países com um estilo de vida ocidental, e uma das principais causas de mortalidade [1] relacionada ao câncer. Completa

PTEN

inactivação é encontrado em ~ 20% dos tumores da próstata primários e em até 60% de metástases de cancro da próstata [2]. Inactivação de um

PTEN

alelo é ainda mais comum. Alta freqüência de

PTEN

inativação é encontrada também no câncer de endométrio e no glioblastoma [3]. mutações da linha germinal de

PTEN

são a causa da doença de Cowden e síndrome Bannayan-Zonana, que são caracterizadas por hamartomas e predisposição para a mama e tireóide tumores [2], [3].

PTEN neutraliza-fosfoinositida 3-quinase (PI3K), equilibrando sinalização fosfatidilinositol (4,5) -fosfato (PIP2) e fosfatidilinositol (3,4,5) -fosfato (PIP3) níveis na célula [2] – [4]. acumulação PIP3 leva a fosforilação de alvos a jusante, incluindo AKT. Como consequência, as actividades de outros efectores a jusante são modulados e funções biológicas celulares, incluindo a proliferação, a apoptose, o tamanho das células, a polaridade, o metabolismo, a adesão, migração e a angiogénese são alteradas [3] – [6]. PTEN nuclear pode desempenhar um papel na manutenção da estabilidade genómica [7]. Além disso, foi recentemente descrito que PTEN pode controlar de células-tronco auto-renovação [6], [8], [9].

Completo

Pten

inativação em ratos é embrionário letal.

Pten +/-

ratos são viáveis, mas desenvolver várias lesões hiperplásicas e displásicas em órgãos diferentes [10], [11]. Condicional

PTEN

modelos de ratos knockout confirmou que

Pten

inativação desempenha um papel importante no desenvolvimento do câncer e progressão tumoral. Ratos com prostático específico

Pten

inativação desenvolvem hiperplasia, mPIN e câncer de próstata, em última instância [12] – [15].

Como identificado pela primeira vez para as células hematopoiéticas, é agora geralmente aceite que todos os tecidos conter raras células estaminais de tecidos específicos que são capazes de auto-renovação e de diferenciação através da divisão celular assimétrica [16], [17]. Estas células são essenciais não só para a organogénese durante o desenvolvimento, mas também para a renovação dos tecidos nas espécies adultas. Como se mostra claramente em diferentes tipos de leucemia, tumores podem desenvolver por modificação de células estaminais hematopoiéticas ou, alternativamente, a partir de multipotentes ou específica da linhagem de células progenitoras que tenham adquirido haste características semelhantes a células [18]. Apesar de ser menos claro, o mesmo mecanismo tenha sido proposta para o desenvolvimento de tumores sólidos, incluindo o cancro da próstata. De acordo com o modelo de células-tronco, cada tumor contém um pequeno número de células com propriedades relacionadas com células estaminais normais, que são essenciais para a manutenção do tumor [16], [19] – [21]. Complementar com a teoria de células-tronco tumorais, o modelo de evolução clonal propõe que os tumores podem desenvolver pela expansão de clones dominantes [22] – [24].

Estudo do desenvolvimento do tumor em modelos de câncer de próstata do rato pode ser fundamental para a compreensão cancro da próstata humano. Na próstata humana e de murganho normal, células progenitoras multipotentes e células, ou células-tronco amplificação de trânsito, são propostos para estar presente na camada de células epiteliais basais [21], [25] – [27]. Além disso, em ratinhos, a região proximal da próstata tem sido indicado como um nicho de células estaminais /progenitoras putativa [28] – [30]. Até agora, o nosso conhecimento das etapas iniciais no desenvolvimento do tumor em modelos de ratos com câncer de próstata é limitado. Na

probasina (PB) -Cre

induzido

Pten

modelo knockout,

Pten

inativação em um p63

+ tronco /população de células progenitoras na célula epitelial basal camada tem sido postulado [31]. Em um específico da próstata

Trp53 /Rb

knockout modelo, as células luminal /neuroendócrino progenitoras na próstata proximal têm sido apontados como células tumorais iniciar potenciais [32].

No presente estudo, investigamos primeiros passos no desenvolvimento do tumor de próstata em uma pessoa diferente alvo

Pten

modelo de inactivação, com base em

expressão PSA-Cre

. Anteriormente, foi descrito que, neste modelo estágios claramente definidos da hiperplasia da próstata e o cancro podem ser discriminados [13]. Aqui nós mostramos que as células hiperplásicas em

PTEN

camundongos knockout têm um fenótipo de células progenitoras epiteliais luminais, incluindo superexpressão de CK8, CK19 e Sca-1. Por expressão foram identificados novos marcadores de perfis de células hiperplásicas. O primeiro pAkt hiperplásico

+ células em próstatas de jovem

PTEN

camundongos knockout foram encontrados na camada de células epiteliais luminal. É importante, também identificado em novos frequência de células progenitoras específicas de linhagem baixos na camada celular epitelial luminal de próstatas normais. Estas células podem representar células anteriores postuladas luminais intermediários /-amplificação de trânsito [33], [34]. Os nossos resultados indicam que

Pten

inactivação neste modelo de ratinho leva à acumulação das novas células progenitoras epiteliais luminais identificados por uma alteração drástica do equilíbrio diferenciação /proliferação destas células. Embora todas as células na camada celular epitelial luminal na próstata proximal mostrou expressão dos novos marcadores de linhagem específica, focos hiperplásicas não desenvolveram a partir desta região da próstata.

Resultados

células hiperplásicos em próstatas de PSA-Cre; ratos Pten-loxP /loxP têm um fenótipo de células epiteliais luminais e expressam marcadores de células progenitoras epiteliais

Anteriormente, descrevemos o desenvolvimento do câncer de próstata em

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos [13]. Em próstatas de 4-5 meses (4-5m) de idade

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos células epiteliais hiperplásicas superexpressarem Phospho-Akt (pAkt) e os marcadores epiteliais luminais citoqueratinas 8/18 (CK8 /18). células hiperplásicas foram negativos para os marcadores epiteliais basais Citoqueratinas 5/14 (CK5 /14). O receptor de andrógeno (AR) foi expresso em níveis iguais em circunstâncias normais e próstatas hiperplásicos [13]

No presente estudo, caracterizado por qPCR e de imunohistoquímica hiperplásico células da próstata de

PSA-Cre;. Pten-loxP /loxP

ratos. Em primeiro lugar, a expressão da progenitora adicional, e marcadores de células basais epiteliais luminais foi analisada a 2m e a 4-5m. Nestas idades próstatas de

PSA-Cre; ratos Pten-loxP /loxP Quais são para ~ 70% e 90% hiperplásico, respectivamente (Figura S1A). Expressão de

probasina

e

NKX3.1

, marcadores de células luminais diferenciadas, foi muito menor em próstatas hiperplásicas, mas

CK8

foi expressa superior nestes tecidos. Baixa expressão dos marcadores de células epiteliais basais

CK5

e

p63

foi detectado. Interessantemente, a expressão do marcador de células progenitoras epiteliais

CK19

[35], [36] era alta em próstatas hiperplásicas.

NKX3.1

,

CK8

,

CK19

e

dados de expressão de p63

mRNA foram confirmados por imuno-histoquímica em próstatas normais e hiperplásicas (4-5m) (Figura S1B-S1I). NKX3.1 coloração nuclear foi observada nas células epiteliais luminais de próstatas normais, mas os núcleos de células hiperplásicas eram dificilmente positivo (Figura S1B-S1C). A coloração CK8 fraca foi observada no lado apical de células epiteliais luminais em próstatas normais, enquanto que em próstatas hiperplásicas de

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos CK8 foi superexpresso (Figura S1D-S1E). Importante, CK19 foi claramente mais elevado expresso em células hiperplásicas do que em células epiteliais prostáticas normais (Fig. S1F-S1G). células hiperplásicas foram negativos para o basal p63 marcador de células epiteliais, mas uma p63 aparentemente normal

+ camada de células epiteliais basal estava presente abaixo de uma multicamada de células hiperplásicas (Figura S1H-S1I). A partir destes dados podemos concluir que

Pten

inativação em próstatas de

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos resulta na acumulação de células hiperplásicas com características de células progenitoras luminal (NKX3.1

+/- CK8

+ CK19

+ p63

-)

Expression profiling identifica novos genes com expressão elevada no epitélio da próstata hiperplásica

perfil de expressão foi realizada. para identificar novos genes diferencialmente expressos em próstatas hiperplásicas de

PSA-Cre; loxP

ratinhos Pten-loxP /(4-5m). Análise de Componentes Principais (PCA) e de agrupamento hierárquico não supervisionado (Figura 1A e 1B) do cDNA dados de matriz mostrou um perfil diferencial de expressão gênica clara entre próstatas hiperplásicas e próstatas normais.

(A) Análise de Componentes Principais (PCA) da expressão do gene em próstatas normais (círculos azuis) e próstatas hiperplásicas de

PSA-Cre; Pten-loxP /ratos loxP

(círculos vermelhos) em 4-5m. (B) de agrupamento hierárquico não supervisionado dos perfis de cinco próstatas normais (NP) e cinco próstatas hiperplásicas (HP) de expressão de genes. O verde indica menor expressão do gene e vermelho indica maior expressão. (C) Os vinte genes com a maior expressão diferencial em HP, em comparação com a NP, conforme determinado pelo cálculo da diferença no nível de expressão média. Análise (D) A significação do Microarrays (SAM) das mesmas amostras como mostrado em C. Note-se que por análise de SAM essencialmente idênticos genes foram identificadas como por cálculo da diferença no nível de expressão média. análise (E) QPCR dos cinco genes com maior expressão na HP, em comparação com NP e da

Sca-1 |. Cada subgrupo foi composta de cinco amostras de próstata. Os níveis de expressão em próstatas hiperplásicas de 2m e ratos velhos 4-5m e em próstatas de ninhada de controle são mostrados como nível de expressão média +/- SE em relação à expressão

Hprt

. (F-M) A análise imunohistoquímica de novos marcadores de células hiperplásicas em NP e HP de

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

camundongos (4-5m). (F) Tacstd2 NP, (L) Tacstd2 HP, (H) Clu NP, (I) Clu HP, (J) Ppp1r1b NP, (K) Ppp1r1b HP, (L), Sca-1 NP e (M), Sca-1 HP.

Para identificar genes expressos preferencialmente em células da próstata hiperplásica, as diferenças nos níveis de expressão médios foram calculados. O progenitor do mouse /haste marcador de células

Sca-1 | foi um dos vinte principais genes com maior expressão em próstatas hiperplásicas (Figura 1C);

CK19 era entre os primeiro cinquenta genes diferencialmente expressos (dados não mostrados). Genes que apresentaram alta expressão em próstatas hiperplásicos por cálculo das diferenças de nível de expressão média (Figura 1C), como

expi, Wfdc2, Tacstd2 (Trop2), Clu, Ppp1r1b

,

Sca-1 | e

CK19

, também foram encontrados overexpressed pela análise da significância de Microarray (SAM) (Figura 1D). nomes completos dos vinte principais genes sobre-expressos estão listadas na Tabela S1. Uma lista mais extensa de todos os genes significativamente upregulated ou reprimidos identificadas por análise de SAM é fornecida na Tabela S2. Note-se que

CK19

está no top vinte dos genes regulados positivamente.

Os perfis de expressão dos cinco genes com maior superexpressão em próstatas hiperplásicas de

camundongos knockout Pten

alvo,

expi, Wfdc2, Tacstd2, Clu

e

Ppp1r1b

(Figura 1C), e

Sca-1

, foram verificados por QPCR em próstatas de

Pten

knockout camundongos e em próstatas normais em 2m e pelo 4-5m (Figura 1E). QPCR mostrou que a expressão de

expi

e

Tacstd2

em

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos já era elevada em 2m;

Clu

e

Sca-1 | mostrou um nível de expressão aumentando gradualmente. No entanto, para

Wfdc2 Comprar e

Ppp1r1b

o aumento mais acentuado na expressão foi observada em próstatas completamente hiperplásicas (4-5m).

Em seguida, expressão de marcadores para que anticorpos apropriados estavam disponíveis, Tacstd2, Clu, Ppp1r1b e Sca-1, foi estudada por imuno-histoquímica em próstatas normais e hiperplásicas (Figura 1F-1M). Tacstd2 imuno-histoquímica mostrou coloração da membrana em tecidos hiperplásicos, de acordo com a sua localização conhecida como uma proteína transmembranar [37]. Clu estava principalmente presente no citoplasma das células hiperplásicas. Como previsto a partir dos dados de QPCR, o padrão de expressão de Ppp1r1b em células hiperplásicas foi mais heterogéneo. De acordo com a coloração CK19 (Figura S1), Sca-1 coloração indicaram que as células hiperplásicas têm um fenótipo de células progenitoras

Os genes com menor expressão em próstatas hiperplásicas de

PSA-Cre;. Pten-loxP /loxP

ratinhos foram também identificados pelo cálculo da diferença no nível de expressão significativo e pela SAM (Figura 1C e 1D). Os perfis de expressão de genes com o menor expressão em próstatas hiperplásicas,

Hs3st3b1, Ccdc16, Mcoln2, C1r Comprar e

Mt1

(Figura 1C), foram confirmados por QPCR (Figura S2). Expressão de todos os genes já foi baixa em próstatas hiperplásicas em 2m em

PSA-Cre;. Células hiperplásicas Pten-loxP /loxP

ratos

Initial pAkt

+ na camada de células epiteliais luminal em próstatas de PSA-Cre; Pten-loxP /ratinhos loxP expressar Clu, Tacstd2 e Sca-1 |

Para coletar informações de tumor candidato células iniciar, examinámos em pormenor o desenvolvimento precoce de hiperplasia em próstatas de

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos, que começa em 4-5 semanas (4-5w). Próstatas de ratos do tipo selvagem em 4-5w eram metade do tamanho das de ratinhos adultos (2m e 4-5m) (Figura 2A). Em contraste com pesos da próstata de ratos mais velhos (2m e 4-5m), pesos da próstata de jovem

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos (4-5w) não eram diferentes dos littermates controle (Figura 2A ). No 4-5m os pesos da próstata de

PSA-Cre;. Pten-loxP /loxP

ratos foram ~ 3 vezes maior do que os dos controles, causado pelo aumento do número e tamanho das células hiperplásicas

(a) os pesos da próstata (média +/- SE) de ratinhos de tipo selvagem e

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratinhos a 4-5w, 2m e 4-5m. (B) coloração de pAkt de focos /células hiperplásicas na camada celular epitelial luminal de uma próstata de um 4-5w idade

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

rato. Aumentos de três regiões indicadas são mostrados em B1, B2 e B3. Seta cabeças em B1 e B2 indicam

+ células PAKT individuais. coloração de fosfo-Akt de próstatas de 2m (C) e 4-5m (D) de idade

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos mostra que, respectivamente, -70% e 100% das células epiteliais luminais eram pAkt

+. (E) slides consecutivos de uma próstata de um 4-5w idade

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

rato coradas para Clu, Tacstd2 e Sca-1 mostra co-expressão destes marcadores em um pequeno foco hiperplásica. Imunofluorescente colorações duplos confirmada co-localização de (F) e de pAkt Tacstd2, (G) e de pAkt Clu e (I) e de pAkt CK8. (H) pAkt

+ células não foram observados no p63

+ basal camada de células epiteliais.

expressão Phospho-Akt foi usado como marcador de

Pten

inativação para visualizar as primeiras células negativas PTEN. No 4-5w, espalhados ao longo de todos os lóbulos da próstata,

+ células hiperplásicas individuais PAKT e pequena PAKT

+ focos foram detectados (Figura 2B). Mais importante, todos pAkt

+ células foram exclusivamente presente na camada celular epitelial luminal e não na camada basal das células epiteliais. No 2m e pelo 4-5m ~ 70% e quase 100% das células epiteliais luminais mostrou coloração da membrana de pAkt, respectivamente (Figura 2C e 2D). células epiteliais basais de pAkt permaneceu negativo. Sca-1 e a nova célula hiperplásica marcadores Clu e Tacstd2 também foram expressas nos focos hiperplásico inicial (Figura 2E), mas a expressão Ppp1r1b ainda não podia ser detectada em células hiperplásicas no 4-5w (dados não mostrados).

Para permitir a caracterização precisa de

+, coloração dupla imunofluorescência foi realizada (Figura 2F-2I). É importante ressaltar que todos os PAKT

+ células mostraram expressão de Clu e Tacstd2. Além disso, todos pAkt

+ células overexpressed CK8 e foram negativas para o basal p63 marcador de célula epitelial. Este resultado sugere fortemente que o primeiro pAkt

+ células, que foram observados exclusivamente na camada epitelial luminal, são idênticas para a maior parte da acumulação de células hiperplásicas com um fenótipo de células progenitoras epiteliais em 4-5m.

PSA-Cre; Pten-loxP /+ ratinhos desenvolvem focos hiperplásica com o mesmo perfil de marcadores como focos hiperplásico em próstatas de PSA-Cre; ratos Pten-loxP /loxP

Anteriormente, relatou que heterozigotos

PSA -Cre; Pten-loxP /+

ratos não desenvolveram tumores de próstata, mas que eles podem desenvolver focos hiperplásico na idade avançada [13]. A disponibilidade de novos marcadores de células hiperplásicas permitiu um estudo mais preciso do desenvolvimento de hiperplasia nestes ratinhos. Clu coloração de próstatas de

PSA-Cre; Pten-loxP /+

ratos mostraram que já em 4-5m alguns pequenos focos hiperplasia pode ser detectado (Figura S3). No 7-8m o número de focos hiperplásico ainda foi muito baixa, mas um claro aumento de focos hiperplásico foi detectado em ratos idosos ( 11 m). Clu

+ focos hiperplásicas não foram observados em próstatas de ninhada de controle (dados não mostrados)

Curiosamente, como em próstatas de jovens

PSA-Cre;. Camundongos Pten-loxP /loxP

hiperplásico Clu

+ focos de

PSA-Cre; Pten-loxP /+

ratos (Figura 3A) mostrou superexpressão pAkt (Figura 3B). Em linha com esta observação Pten coloração foi negativa nestes focos (dados não mostrados), indicando que a segunda

Pten

alelo foi inativado no pAkt

+ células hiperplásicas. células hiperplásicas em

PSA-Cre; Pten-loxP /+

ratos também foram Tacstd2 e Sca-1 positiva (Figura 3C e 3D). Assim, as células hiperplásicas em próstatas de

PSA-Cre; Pten-loxP /+

ratos tinham um perfil de expressão idêntica como focos hiperplásico em jovens

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos.

secções consecutivas de um foco hiperplásico na próstata de um

PSA-Cre; Pten-loxP /+

rato foram coradas para (B) de pAkt e os marcadores de células hiperplásicas (a) Clu, (C) Tacstd2 e (D) Sca-1 por imuno-histoquímica.

Single Clu

+ Tacstd2

+ Sca-1

+ células progenitoras epiteliais estão presentes no epitélio luminal camada de células de próstatas normais

em seguida, investigamos se marcadores de células hiperplásicas foram expressos em próstatas normais em diferentes idades. Curiosamente, a única 4-5w Clu

+ Tacstd2

+ Sca-1

+ células foram detectados na camada celular epitelial luminal de próstatas normais (Figura 4A-4C). Algumas células epiteliais basais coradas positivas para Tacstd2 e Sca-1, no entanto, Clu

+ células não foram observadas na camada epitelial basal. A presença de Clu

+ Tacstd2

+ Sca-1

+ células na camada celular epitelial luminal de próstatas de rato normal sugere que estas células são previamente ainda não identificadas células progenitoras específicas da linhagem das células epiteliais luminais . É tentador especular que no

PTEN

ratos knockout células prostáticas hiperplásicas com características semelhantes aos das outras células progenitoras se originam a partir destas células. Esta hipótese é a de acordo com a observação de que pAkt

+ células hiperplásicas foram encontradas exclusivamente na camada celular epitelial luminal (Figura 2B, 2H, 2I e).

(A) Clu coloração de uma próstata normal de de um rato velho 4-5w. Espalhadas por todo o lóbulo da próstata, foram observadas individuais Clu

+ células na camada de células epiteliais luminais. Uma visão geral de um lobo da próstata todo e ampliações de três regiões indicadas são mostrados. As setas indicam células positivas. (B) Tacstd2

+ e (C) Sca-1

+ células na camada de células epiteliais luminais da próstata em desenvolvimento (4-5w). (D) Clu coloração de uma próstata normal de adulto (4-5m) mostrou células raras Clu

+ na camada celular epitelial luminal. (D1) Maior ampliação da região indicada em (D). (E-J) por imunofluorescência de dupla marcação de Clu

+ e Tacstd2

+ células na camada de células epiteliais luminais da próstata normais. Em próstatas normais Clu

+ e Tacstd2

+ células foram negativas para pAkt (E, F), CK8 overexpressed (G, H) e não expressam p63 (I, J).

Para estimar a frequência de Clu

+ Tacstd2

+ Sca-1

+ células progenitoras epiteliais em diferentes idades, próstatas de desenvolvimento (4-5w) e de adultos (4-5m) ratos foram coradas para a expressão Clu. No 4-5w 1/250, e pelo 4-5m 1 /25.000 células epiteliais luminais foram Clu

+, respectivamente (Figura 4A e 4D), indicando que no desenvolvimento de próstatas o número de células progenitoras específicas de linhagem é muito maior do que em próstatas totalmente maduros. A presença de Clu

+ Tacstd2

+ Sca-1

+ células progenitoras luminais em próstatas adulto normal faz com que essas células candidatos a partir do qual focos hiperplásicas desenvolvem em

PSA-Cre; Pten-loxP /+

camundongos devido à inactivação do segundo

Pten

alelo.

Clu

+ Tacstd2

+ células progenitoras epiteliais luminais em jovens próstatas normais (4-5w) foram ainda mais caracterizado por estudos de co-localização. pAkt sobreexpressão em Clu

+ Tacstd2 células

+ na camada celular epitelial luminal de próstatas normais não foi observado (Figura 4E-4F). No entanto, como as células hiperplásicas em

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos, Clu

+ Tacstd2

+ células na camada de células epiteliais luminal de próstatas normais CK8 overexpressed (Figura 4G-4H ). Clu

+ células foram encontradas exclusivamente na camada celular epitelial luminal, enquanto Tacstd2

+ células estavam presentes em ambos luminal e a camada de células epiteliais basais (Figura 4G-4J, e Figura S4). Recentemente, a expressão elevada de Tacstd2 tem sido identificada em células epiteliais basais da próstata proximal, mas não em células epiteliais basais na próstata mais distal [38].

focos hiperplásicos não se desenvolvem a partir de células epiteliais no proximal

próstata

a região proximal da próstata do rato tem sido proposto como um nicho de células estaminais /progenitoras [28] – [30]. Uma vista esquemática das partes proximais e distais de um lóbulo da próstata do rato é mostrada na Figura 5A. Estudaram-se as propriedades das células epiteliais da próstata no proximal em mais detalhe em

PSA-Cre;. Pten ratinhos loxP-/loxP

e em companheiros de ninhada normais

(A) Desenho esquemático de um lóbulo da próstata do rato, indicando a uretra, as extremidades proximal e a região distai da próstata. eosina (B) Heamatoxylin de um lobo do mouse próstata longitudinal posicionado. As ampliações de distal (B1) e proximal (B2) da próstata, como indicado em B, mostrou uma diferença na morfologia das células epiteliais luminais na extremidade proximal e distai da próstata. Análise (C-E) imuno-histoquímica de células epiteliais luminais da região proximal de uma próstata normal de ratinho. (C) p63; (D) CK8 e (E) Sca-1 coloração. As linhas tracejadas indicam a transição abrupta do epitélio da proximal à próstata distal.

Como visualizado em cortes longitudinais de lóbulos da próstata normais, células epiteliais luminais na próstata proximal são mais compactos com menos citoplasma do que luminal células em partes distais da próstata (Figura 5B). Como na próstata distal, na próstata proximal a p63

+ camada de células epiteliais basal estava presente abaixo das células epiteliais luminais (Figura 5C). Curiosamente, todas as células epiteliais luminais da CK8 próstata proximal sobre-expresso (Figura 5D), como observado em células progenitoras luminal de linhagem específica raras na próstata distal e em células hiperplásicas em

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

camundongos. Sca-1 também foi expresso em células de alta proximais (Figura 5E), confirmando que as células epiteliais luminais da próstata proximal tem um fenótipo de células progenitoras luminal. Como indicado pela linha interrompida (Figura 5C-5E), há uma transição abrupta de células epiteliais com características proximais para células com as propriedades de células epiteliais luminais mais distais.

Em seguida, a caracterização das regiões proximal e distal expressão de próstatas normais de adultos foi realizado (Figura 6A). Surpreendentemente,

Ppp1r1b

,

Clu

,

Wfdc2

e

Tacstd2

estavam entre os genes com maior expressão na próstata proximal. dados de matriz de expressão foram confirmadas por qPCR (Figura 6B). Como descrito acima, estes marcadores também foram sobre-expressos em células da próstata hiperplásica acumulados de

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratinhos (Figura 1) e em células progenitoras luminais raras na próstata distal (Figura 4). A imuno-histoquímica mostrou alta expressão Clu, Tacstd2 Ppp1r1b e nas células epiteliais luminais da próstata proximal (Figura 6C-6E). Os dados de matriz de cDNA confirmada uma expressão elevada do luminal progenitoras marcadores celulares CK8 e Sca-1 na próstata proximal (dados não mostrados). Em conclusão, uma correlação foi detectada entre o perfil do marcador em próstatas hiperplásicas de

PSA-Cre;. Pten-loxP /loxP

camundongos, células progenitoras de linhagem específica raros na próstata distal e as células epiteliais luminais proximais

(a) Expressão perfis da região proximal e distal da próstata de uma próstata do rato normal (4-5m) mostra que genes alta expressos em próstatas hiperplásicas de

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratinhos estão entre os dez genes com a expressão mais elevada em dois próstatas proximais em relação a dois distais próstatas. (B) análise de marcadores QPCR hiperplasia com elevada expressão na próstata proximal. (C-E) Análise imunohistoquímica confirma alta expressão de marcadores de células hiperplásicas na camada celular epitelial luminal da região proximal da próstata normais. (C) Clu coloração de um lóbulo da próstata normal, (C1) ampliação da transição da proximal para a região distai, tal como indicado em C. A coloração para (D) Ppp1r1b e (E) Tacstd2. desenvolvimento de hiperplasia não ocorreu na próstata proximal do

PSA-Cre; loxP

ratos Pten-loxP /(4-5m). células epiteliais luminais proximais das próstatas hiperplásicas foram negativos para pAkt (F, ampliação de transição proximal /próstata distal em F1), embora estas células sobre-expresso (G, G1) Clu, (H) e Ppp1r1b (I) Tacstd2.

Nós investigado em

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos (4-5m) se focos hiperplásico desenvolvido a partir de células epiteliais luminais na próstata proximal. Secções longitudinais de próstatas mostrou que, embora a próstata foi completamente distai hiperplásica, do epitélio na próstata proximal não foi afectada (Figura 6F-6I). A imuno-histoquímica mostrou que, em contraste com a próstata distal, de pAkt não foi sobre-expresso na próstata proximal (Figura 6F), indicando que

Pten

não é inactivado na região da próstata.

Além disso , foi determinado o perfil de marcadores de células epiteliais no epitélio uretral adjacentes à próstata proximal. Na camada superficial diferenciada do urotélio, as células guarda-chuva, foi observada elevada expressão CK8. A mais alta expressão da p63, Clu, Tacstd2 e Sca-1 foi encontrado nas camadas de células epiteliais intermédios /basal (Figura S5). Os dados uretra estender os dados de expressão de próstata, indicando que Clu, Tacstd2 e Sca-1 mostram alta expressão no epitélio menos diferenciada.

Discussão

Neste estudo, definiu os primeiros estágios de desenvolvimento hiperplasia em

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

modelo de cancro do mouse próstata. aspectos importantes do desenvolvimento hiperplasia cedo e desenvolvimento normal da próstata foram sequencialmente tratada. Nós mostramos que: (i) Acumulando

células hiperplásicas PAKT + em próstatas de

PSA-Cre; Pten-loxP /loxP

ratos têm um fenótipo celular epitelial luminal com expressão de marcadores conhecidos e novos identificados de epitelial células progenitoras. (Ii) O mais antigo única pAkt

+ (Pten

-) células hiperplásicas nas próstatas de jovens alvo

PTEN

camundongos knockout estão exclusivamente presentes na camada de células epiteliais luminal. (Iii) a uma frequência baixa, na próstata normal, as células semelhantes, mas sem a sobreexpressão de pAkt, puderam ser identificados. (Iv) Os nossos dados indicam ainda que

Pten

inactivação inibe a diferenciação de células progenitoras epiteliais luminais de células maduras. (V) Observou-se que a camada de células epiteliais luminais da próstata proximal é composta por células que expressam os mesmos marcadores como células progenitoras raras em regiões mais distais da próstata. No entanto, focos hiperplásico não se desenvolveu a partir da próstata proximal.