Abstract

Fundo

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs regulatórios que estão implicados na patogênese do câncer e que demonstraram recentemente promessa como biomarcadores à base de sangue para detecção do câncer. câncer epitelial de ovário é uma doença mortal para os quais melhoraram os resultados poderiam ser alcançados pela detecção precoce de sucesso e uma melhor compreensão da patogênese molecular que leva a terapias melhoradas. Um passo crítico em direção a essas metas é estabelecer uma visão abrangente dos miRNAs expressos em tecidos câncer epitelial de ovário, assim como em células epiteliais da superfície do ovário normais.

Metodologia

Nós usamos pyrosequencing massivamente paralelo (ou seja, , “454 sequenciação”) para descobrir e caracterizar novos e conhecidos miARNs expressos em culturas primárias de epitélio normal do ovário humano superfície (mangueira) e em tecido de três das histotipos mais comuns de cancro do ovário. sequenciamento profundo de bibliotecas de cDNA RNA pequenos derivados de MANGUEIRA normal e amostras de cancro do ovário rendeu um total de 738.710 sequência de alta qualidade lê, gerando perfis digitais abrangentes de expressão miRNA. perfis de expressão para 498 miRNAs anteriormente anotados foram delineados e descobrimos seis novos miRNAs e 39 miRNAs candidatos. Um conjunto de 124 miRNAs foi diferencialmente expressos em normal versus amostras de câncer e 38 miRNAs foram diferencialmente expressos através subtipos histológicos de câncer de ovário. Taqman qRT-PCR realizada em um subconjunto de miRNAs confirmou os resultados do estudo com base em seqüenciamento.

Conclusões

Este relatório expande o corpo de miRNAs conhecidos devem ser expressos em câncer epitelial de ovário e fornece uma recurso útil para futuros estudos sobre o papel dos miRNAs na patogênese e detecção precoce de câncer de ovário

Citation:. Wyman SK, Parkin RK, Mitchell PS, Fritz BR, O’Briant K, Godwin AK, et al . (2009) repertório de microRNAs em epitelial do cancro do ovário como determinado pela Next Generation Sequencing de pequeno RNA cDNA Bibliotecas. PLoS ONE 4 (4): e5311. doi: 10.1371 /journal.pone.0005311

editor: Sudhansu Kumar Dey, Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de novembro de 2008; Aceito: 07 de fevereiro de 2009; Publicação: 23 de abril de 2009

Direitos de autor: © 2009 Wyman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O custo de sequenciamento foi parcialmente custeado pela Roche. O estudo foi apoiado em parte pelo Cancer SPORE ovário em Fox Chase Cancer Center (P50 CA083638), o Pacific ovário Consortium Ovarian Cancer Research SPORE (P50 CA83636 para NU e MT), Cromossoma Metabolismo Training Grant 5 T32 CA09657-16 (a SKW ), uma bolsa da Merck Research Laboratories (SKW) e pelo Fred Hutchinson Cancer Research Center e Canary Foundation (fundos novo desenvolvimento para MT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. M. Tewari é um membro pago do Conselho Consultivo Científico do CombiMatrix, Inc.

Introdução

cancro do ovário

epitelial é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer ginecológico nos Estados Unidos [1], com diagnóstico de estágio avançado ter um 30% de taxa de sobrevivência de cinco anos [2]. As taxas de sobrevivência pode ser melhorada através de uma melhor compreensão da patogénese molecular, o que pode levar ao desenvolvimento de terapias específicas superiores, bem como pela detecção precoce da doença, numa fase curável cirurgicamente. Quando detectado numa fase em que a doença está confinada ao ovário, por exemplo, os cinco anos de aumentos da taxa de sobrevivência para 80%. Clinicamente biomarcadores eficazes para detecção precoce de câncer de ovário podem melhorar substancialmente as taxas de sobrevivência e descoberta de biomarcadores de câncer de ovário é uma importante área de investigação em curso [3].

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos (± 22 nt) moléculas de ARN não codificantes que actuam pós-transcricionalmente para regular a expressão do gene [4]. MicroRNAs se originam a partir de precursores de ARN em gancho de cabelo que são processados ​​para gerar tanto o funcional maduro miARN e um miARN “forma de estrela” de comprimento semelhante derivada da cadeia oposta do gancho de cabelo. modulação mediada por MicroRNA de sistemas biológicos foi encontrado para ser perturbado em várias doenças [5], incluindo o cancro [6] – [8]. padrões de expressão de miRNAs se correlacionam com tecido de origem [8], [9], o prognóstico [10], [11] e com comportamentos clínicos cancro [12], tornando miRNAs valiosos biomarcadores à base de tecido. Além disso, nós e outros mostraram recentemente que miARNs derivadas de tumor entrar na corrente sanguínea em níveis mensuráveis, o que indica que miARNs libertadas pelo tecido do tumor representam um novo e potente classe de, biomarcadores minimamente invasivos à base de sangue para a detecção do cancro [13] – [16] . Como tal, há um forte impulso para uma análise abrangente do repertório miRNA expressa em câncer epitelial de ovário.

Vários relatórios recentes começaram a caracterizar expressão miRNA em microarrays de câncer de ovário usando manchadas com sondas para um número variável de miARNs conhecidos [17] – [20]. Embora estes são estudos pioneiros, eles também têm limitações. O mais importante delas é que todas as matrizes notificados até à data têm cobertura incompleta dos miRNAs conhecidos. Dos 959 miRNAs e formas estrela presentes no miRBase (versão 12.0) [21], [22], a maioria das plataformas de microarrays aplicada ao ensaio de data apenas algumas centenas de miRNAs, com a mais abrangente das matrizes ensaiar 470 miRNAs e formas da estrela. Além disso, microarray aproxima única medida miRNAs previamente identificados e não estão equipados para descobrir e criar perfis novos miRNAs. Esta é uma distinção importante a fazer, uma vez que vários relatórios sugerem que um número significativo de miRNAs, particularmente aqueles que podem ser células de tipo específico na expressão, continuam a ser descobertos [23], [24]. Finalmente, por causa do pequeno tamanho de miRNAs e os desafios de alcançar condições de hibridização uniformes em toda uma microarray miRNA, há potencial para hibridação cruzada de miRNAs que são altamente relacionados em sequência, tornando-se, por vezes, impossível distinguir definitivamente entre miRNAs difiram um ou dois nucleótidos.

para superar as limitações associadas aos estudos de microarranjos, usamos “próxima geração” tecnologia de sequenciamento (pyrosequencing especificamente massivamente paralela utilizando a plataforma de Ciências da Vida 454) de bibliotecas pequenas cDNA RNA para caracterizar de forma mais abrangente miRNA expressão em cancro de ovário epitelial, assim como em culturas primárias de células epiteliais da superfície dos ovários normais. Esta abordagem, que se baseia em 5 ‘e 3’ leituras obtidas ligador universal ligadura /RT-PCR e contagem de sequência para miARNs distintas, pode na captura teoria todos miARNs presentes nas amostras de ARN (incluindo as de nova sequência) e permite preciso identificação de miARN, mesmo quando uma variação de apenas um único nucleótido. Geramos um total de 738.710 sequência lê a partir de quatro bibliotecas de cDNA pequenos RNA representando epitélio normal primário humano do ovário de superfície (mangueira) culturas e três subtipos de câncer de ovário epiteliais comuns (serosa, celulares clara e endometrióides). Aqui nós descrevemos os resultados deste esforço, incluindo a identificação e definição de perfis de ambos

Métodos

Detalhes adicionais referentes cultura de células, isolamento do RNA, RNA pequeno previamente anotado e novos miRNAs expressos em câncer de ovário. cDNA construção da biblioteca, maciçamente sequenciamento paralelo, descrição do gasoduto computacional e miRNA TaqMan reação em cadeia da polimerase quantitativa transcrição reversa (qRT-PCR) são fornecidos em detalhe na suplementar Métodos S1 e em [23].

cultura celular e clínica materiais

as células normais epiteliais do ovário humano primário superfície (mangueira) foram obtidos a partir dos ovários normais de mulheres pós-menopáusicas, utilizando uma modificação da técnica descrita anteriormente em [25]. Em todos os casos, as amostras foram tomadas a partir do epitélio do ovário superfície com aparência normal, o que foi confirmado seguinte análise histopatológica. espécimes MANGUEIRA foram obtidos no âmbito de um protocolo que foi aprovado pelo Conselho de Pesquisa Comitê de Revisão e Revisão Interna do Centro de Câncer Fox Chase de pacientes submetidos a cirurgia clinicamente indicado (ou redução do risco salpingooforectomia profiláctico ou histerectomia total abdominal com salpingo-oopherectomy bilateral) e que forneceram consentimento informado por escrito para o tecido não é necessário para o diagnóstico a ser usado para a pesquisa. células MANGUEIRA primários foram mídia usando cultivadas descritos em [26] a 37 ° C em 5% de CO

2.

O câncer de ovário espécimes snap-congelados correspondentes à Fase III /IV câncer de ovário epitelial (19 serosa, quatro células claras e 10 endometrioid) continha 70% da celularidade epitelial maligna, avaliada pela avaliação patologista de uma secção de tecido manchado adjacente. espécimes de câncer de ovário foram obtidos a partir da Cancer Research Consortium Repository Pacific ovário. Os espécimes foram coletados sob um protocolo aprovado pelo Centro de Pesquisa do Câncer Institutional Review Board Fred Hutchinson e foram obtidas de pacientes que forneceram consentimento informado por escrito para o tecido não é necessário para fins de gestão clínica para ser usado para a pesquisa.

extração de RNA e miARN biblioteca de preparação

normais culturas HOSE primária (passagem 4-7) foram lisadas em 600 ul miRvana lise /tampão de ligação (Ambion, Inc., Austin, TX). espécimes de tumor (-100 mg cada) foram homogeneizados num Qiagen Tissuelyser com 600 ul de tampão de lise miRvana /encadernação. O ARN total foi extraído a partir de ambos os tipos de amostras utilizando o kit de isolamento de miARN miRvana ™ (Ambion) por protocolo do fabricante. RNA a partir de snap-congelados tumores (19 serosa, quatro células claras e 10 endometrióides tumores, respectivamente) foi agrupada de acordo com o subtipo histológico. MicroRNA clonagem foi realizada como descrito anteriormente [27], (https://web.wi.mit.edu/bartel/pub/protocols/miRNACloningUpdate0705.pdf) com modificações nos passos de amplificação para preparar as amostras para a sequenciação paralela massivamente por 454 Ciências da vida.

Custom bioinformática análise de dados gasoduto

Processamento e anotação de sequências com base na identidade de RNAs transcritos conhecidos ou novos miRNAs foi realizada por meio de um gasoduto bioinformática personalizados descrito em detalhes no suplementar Métodos S1 .

a medição dos níveis de miARN em ARN a partir de amostras clínicas utilizando ensaios TaqMan ® qRT-PCR

o ARN total foi transcrito de forma inversa e preparado por qRT-PCR utilizando o Kit de Transcrição reversa TaqMan ® miARN e miARN espec�icos iniciadores de haste-laçada (Applied Biosystems, Inc.) como previamente descrito [23]. Os dados foram analisados ​​com SDS Quantificação Relativa Software versão 2.2.2 (Applied Biosystems, Inc.), com a configuração automática Ct para a atribuição de linha de base e limite para a determinação Ct.

Resultados

Visão de pequena cDNA RNA bibliotecas e 454 sequenciamento

bibliotecas de cDNA pequeno RNA foram construídos a partir de pools de amostras de RNA isoladas de culturas primárias de MANGUEIRA primária histologicamente normal (

n

= 4) e epiteliais amostras de câncer de ovário seroso de ( OSC,

n

= 19), de células claras (OCC,

n

= 4) e endometrioid (OEC,

n

= 10) histologia. espécimes de tumor foram seleccionado para conter pelo menos 70% de células epiteliais malignas. O ARN total foi fraccionado pelo tamanho através de electroforese em gel de poliacrilamida e pequenos RNAs correspondentes em peso molecular para a população miARN madura (18-24 fracção nt) foram de gel extraídos e processados ​​para a transcrição reversa e a amplificação por PCR para criar bibliotecas de cDNA (Figura 1A). Massively pyrosequencing paralela usando a plataforma os 454 Life Sciences ‘gerado 80.501 MANGUEIRA normal, lê, 273.739 OSC lê, 292.942 OCC lê, e 91.528 OEC lê (Figura 1B). Estas corresponderam a 10.544 MANGUEIRA, 26.849 OSC, 37.792 OCC e 13.134 OEC sequências não redundantes. O maior número de leituras correspondentes a amostras de células serosa e claras foi devido a maior profundidade de seqüenciamento (ou seja, uma parte maior da placa de seqüenciamento usado) em vez de quaisquer variações particulares durante a preparação da biblioteca.

A

. RNAs pequenos foram isolados a partir de culturas normais MANGUEIRA primária e da serosa (OSC), de células claras (OCC) e endometrioid (OEC) tecidos de cancro do ovário. Após 5 ‘e 3’ de ligação ligante, RT-PCR foi realizada para gerar quatro bibliotecas de ADNc independentes de pequenos RNAs que foram então utilizados como matrizes para pyrosequencing maciçamente paralelo (454 sequenciação).

B

. Descrição das etapas do gasoduto de análise de dados. O passo inicial da análise dos dados foi a remoção de sequências correspondentes a 18 nt e 24 nt de ARN marcadores que tinha sido cravado no ARN total antes da electroforese em gel. Percentagem do total lê a partir MANGUEIRA, OSC, OCC e OEC conjuntos de dados classificados nas categorias designadas e filtrados em cada etapa estão listados na tabela à direita. Na parte inferior da tabela, o número de sequências únicas “” representa as sequências não redundantes derivadas após colapso várias leituras de sequência idêntica. Algumas sequências canónicas mapear para mais do que um locus do genoma. Na conclusão da análise, 199 seqüências, totalizando 215 leituras e mapeamento para 568 loci preencheram os critérios para sequências derivadas de gancho canônicas dos conjuntos de dados combinados.

Os dados Sequence foi processado usando nosso costume computacional pipeline (Figuras 1B, S1 e S1 Tabela). Os passos iniciais da sequência de gasoduto identificada corresponde a bases de dados de RNAs anteriormente anotados (por exemplo, miRNAs conhecidos, outros RNAs não codificadores, RNAs mensageiros), e elementos da sequência altamente repetitivas. sequências restantes foram processadas para identificar novos miARNs (Figura S1; detalhes da tubagem computacional são fornecidos em métodos suplementares S1). Nas próximas seções, vamos discutir em detalhes as sequências correspondentes a miRNAs conhecidos e identificação de novos miRNAs

perfil de microRNA:. MiRNAs anteriormente anotados

Jogos de miRNAs conhecidos na miRBase (versão 12.0. ) [21], [22] representado 68-73% das leituras, dependendo do conjunto de dados (Figura 1B e Tabela S1) e correspondeu a um total de 498 miARNs conhecidas (incluindo as formas de estrela). A frequência de clonagem miARNs individual, expressa como uma fracção do total leituras obtidas a partir de uma dada amostra, pode ser utilizado para comparar a expressão relativa de entre as amostras miARNs [28] – [30]. O resumo global dos nossos 454 conjuntos de dados de sequenciação são apresentados na Figura 2, que representa a expressão relativa da miARNs entre MANGUEIRA primária normal e de tecido de cancro conjuntos de dados (

Um

), bem como entre os três subtipos de ovário (

B

). Os miRNAs mais diferencialmente expressos (ou seja, ≥4 fold-change) são mostrados como pontos vermelhos. É notável, embora não inesperada, que o câncer de ovário histológico subtipo perfis de miRNA foram mais diferente do MANGUEIRA normal (

A

) do que eram uns dos outros (

B

). Tabulados 454 de dados de sequenciamento de miRNA abundância em todos os conjuntos de dados, bem como nomes de miRNA e rácios de abundância para todos comparações de pares entre tipos de amostras, são fornecidos em sua totalidade na Tabela S2.

Os conjuntos de dados são comparados aos pares, traçando o log da fracção do total para uma dada lê miARN num determinado conjunto de dados contra o seu valor correspondente, no segundo conjunto de dados. Para cada parcela, apenas miRNAs que foram sequenciados em ambas as bases de dados são plotados; miARNs que foram sequenciados apenas em um dos dois conjuntos de dados não são mostrados. A linha superior (

A

), compara os conjuntos de dados de câncer de ovário (OSC, OCC e OEC) para culturas normais MANGUEIRA primário; a linha inferior (

B

), compara subtipos histológicos de tumores ovarianos uns aos outros. Pontos vermelhos miARNs significar que tiveram uma mudança dobra ≥4.

A sobreposição de miARNs diferencialmente expressos entre os subtipos é visualizado nos diagramas de Venn na Figura 3, que também incorporam miARNs excluídos a partir da Figura 2 porque zero lê em qualquer MANGUEIRA normal ou amostras de cancro do ovário. A partir da intersecção dos três grupos nos diagramas de Venn, é evidente que, em muitos casos miARNs expresso diferencialmente no cancro do ovário em relação à mangueira normais apresentam o mesmo padrão de expressão diferencial, independentemente do subtipo histológico. Tabela S3 fornece uma lista completa de nomes de miRNAs individuais e relação de expressão e

P

-Valores para as comparações resumidos na Figura 3.

Venn diagramas retratam número de miRNAs diferencialmente expressos em histológico de cancro do ovário subtipos em relação ao epitélio do ovário humano primário superfície (mangueira) culturas normais. Critérios para um miRNA como diferencialmente expressos foi definida por uma dobra de mudança de ≥4 com o teste exato de Fisher

P

-valor 5,0 × 10

-6 para miRNAs que tiveram expressão detectável em ambos mangueira e ovário amostras de câncer, ou pelo teste exato de Fisher

P

-valor 5,0 × 10

-6 somente nos casos em que um valor dobra-mudança era indefinível, devido a zero lê para um determinado miRNA tanto no MANGUEIRA ou amostra de comparação do cancro do ovário. Foi identificado um total de 74 miRNAs sobre-expressos (

Painel A

) e 49 miRNAs sub-expressos (

Painel B

) em câncer de ovário em relação a MANGUEIRA normal. Os microRNAs que foram encontrados para ser consistentemente sobre-expressos ou consistentemente sub-expressos em todos os três subtipos histológicos de cancro do ovário são listados por nome.

Nós expressão miRNA diretamente comparados entre os subtipos histológicos de cancro do ovário derivando rácios de expressão para cada miRNA com base em valores de abundância fracionários. A significância foi avaliada usando o teste exato de Fisher. Os dez melhores miARNs expressos diferencialmente em cada uma das comparações de pares de subtipos histológicos de cancro do ovário são listados na Tabela S4 (resultados para todos os miARNs são fornecidos na sua totalidade na Tabela S2). Entre os miARNs específicos do subtipo mais histológicas são miR-449a (-específica serosa), miR-499-5p /miR-375 /miR196a /miR-196b /miR-182 (específico para o endometrióide) e miR-486-5p /miR -144 /miR-30a /miR-199-5p (limpar específico da célula).

Validação de 454 resultados de expressão sequenciamento miRNA por qRT-PCR.

Foi utilizado comercialmente disponível miRNA TaqMan qRT ensaios-PCR como uma confirmação independente da expressão diferencial miRNA identificado por 454 sequenciamento. ensaios MicroRNA TaqMan qRT-PCR foram realizadas para uma amostra de 38 miRNAs conhecidos que foram selecionados com base em excesso ou falta de expressão em relação a MANGUEIRA normais primária, ou com base na expressão diferencial entre os diferentes subtipos de câncer de ovário (calculado com base em 454 seqüenciamento dados). ensaios Taqman foram realizadas em aliquotas das mesmas piscinas de ARN utilizadas para a sequenciação. Trinta e seis dos 38 miRNAs diferencialmente expressos examinados por TaqMan qRT-PCR demonstrou resultados consistentes com os obtidos por 454 sequenciamento (Figuras 4 e 5, A, B, C). Dos oito miARNs identificadas por 454 sequenciação de ser sobre-expresso em cancro do ovário em relação ao grupo MANGUEIRA normal (Figura 4A), todos os oito demonstrada a sobre-expressão em subtipos de cancro de células serosas e claras, quando medido utilizando TaqMan qRT-PCR, enquanto seis dos oito apresentaram resultados consistentes no subtipo de câncer endometrioid (miRs-126 *, – 142-3p, 195, 200a, 200b, 200c, 338-3p, 378 *). Nove miARNs foram sub-expresso em cancro do ovário em relação à mangueira normais (Figura 4B), com todos os subtipos que mostram resultados consistentes, quando medido por qRT-PCR TaqMan. Havia seis miARNs que eram indetectáveis ​​(zero lê) em culturas HOSE normais (Figura 4C), mas teve expressão detectável em OEC, OSC e /ou OCC nos dados de sequenciação 454, e eles também mostraram um aumento da expressão em amostras de subtipos histológicos ovarianos contra MANGUEIRA primária normal quando examinada por TaqMan qRT-PCR (Figura 4C).

Os gráficos mostram resultados miRNA Taqman qRT-PCR para uma amostragem de miRNAs identificados por 454 sequenciamento de ser sobre-expresso (

Painel a

) ou sub-expressos (

Painel B

) no câncer de ovário em relação ao MANGUEIRA normal. Os valores de expressão relativa derivados de 454 sequenciação são apresentados no segmento esquerdo de cada gráfico para comparação. valores relativos de expressão de miRNAs em endometrioid (OEC, barras pretas), serosa (OSC, barras brancas) e células claras (OCC, barras cinza) cancros são retratados. MicroRNAs que não foram detectados em MANGUEIRA normal, 454 seqüenciamento, mas foram detectados no câncer de ovário são apresentadas em

Painel C

, onde miRNAs são ordenados por descendente expressão (que corresponde ao limiar de ciclo ascendente, Ct) em MANGUEIRA normal. 454 dados de sequenciamento é dada em termos de percentagem do total lê dentro de cada amostra. UD, indetectável por miRNA TaqMan qRT-PCR.

Os gráficos mostram resultados Taqman qRT-PCR para miRNAs diferencialmente expressos entre os subtipos de câncer de ovário, com 454 dados derivados de sequenciamento apresentadas para comparação no segmento esquerdo do cada gráfico. Os valores de expressão relativa de miRNAs especificamente sobre-expressos em endometrioid (

Painel A

, OEC, barras pretas), serosa (

Painel B

, OSC, barras brancas) e de células claras (

painel C

, OCC, barras cinza) cancros são retratados. UD, indetectável por miARN TaqMan qRT-PCR.

Quinze miARNs identificado por sequenciação 454 para ser expressos diferencialmente entre os subtipos de cancro do ovário (Figura 5A, B, C) mostraram padrões de expressão semelhantes ao quantificada por qRT- PCR. Oito miRNAs foram sobre-expresso especificamente no câncer de ovário endometrioid (Figura 5A), quatro em câncer seroso (Figura 5B), e três no câncer de células claras (Figura 5C) em relação aos outros subtipos.

Análise de sequenciamento dados para identificar novos pequenos RNAs derivados de gancho.

Depois de validar 454 resultados de sequenciação correspondentes à expressão diferencial de miARNs previamente anotadas, que ao lado voltado para a identificação de sequências de miARN novos. Depois de filtrar corresponde às características anteriormente anotados, incluindo RNAs mensageiros, tRNAs e outros RNAs não codificadores conhecidos, as restantes sequências foram alinhadas com a sequência de referência do genoma humano (NCBI Construir 36,1) [31]. As sequências foram necessários para combinar com a sequência do genoma humano perfeitamente ser realizado ainda mais para análise computacional adicional, com a única excepção a este ser sequências que demonstraram adição de 1-3 nucleótidos não templated no terminal 3 ‘. Nestes casos, nós aparadas bases não-modeladas a partir da sequência original e foi então levada adiante para análise [32], [33].

As etapas de processamento de dados descritas até agora rendeu 841 MANGUEIRA normal, 2.840 OSC , 11224 OCC, e 1.764 sequências únicas OEC correspondentes a novos pequenos RNAs. Estas sequências únicas correspondeu a 1.766 MANGUEIRA normal, 5.795 OSC, 19.464 OCC e 3.301 OEC loci genômica que poderiam gerar esses pequenos RNAs (Figura 1B, Tabela S1). O oleoduto análise de dados seguinte rastreados estes loci genómico (além de 100 nucleótidos de cima e a jusante sequência flanqueadora) para a presença de uma estrutura secundária em gancho previsto por cálculo de energia livre, forma de probabilidade (como determinado pelo programa RNAshapes [34 ]) eo Randfold-computados [35]

P

-valor de estruturas secundárias previstas. Uma descrição detalhada dos critérios de dobragem em gancho de cabelo é fornecido em suplementar Métodos S1 e em [23]. Isto resultou em 224 MANGUEIRA normal, 511 OSC, 500 OCC, e 247 OEC romance pequenos RNAs foram encontrados a ser potencialmente derivado de uma estrutura precursor hairpin.

As sequências que passam os critérios de filtragem acima dos quatro conjuntos de dados foram então combinados e classificadas no que respeita à cromossómico coordenadas em grupos que partilham extremidades 5 ‘. De cada um desses grupos que escolhemos uma sequência “canonical” representando que o locus genômica. As sequências canónicas foram escolhidos com base em um terminal 5 ‘, abundância, e comprimento de sequência comum tal como descrito anteriormente [23] (detalhes adicionais são fornecidos na Suplementar Métodos S1). Este processo refinado ainda mais os dados em uma lista combinada de 199 sequências únicas (potencialmente derivado de 568 loci genómico) que designamos como “novos derivados do hairpin pequenos RNAs” a partir do qual foram identificados novos e candidatos miRNAs.

Identificar novos e candidatos miRNAs.

a fim de determinar quais as sequências de designar como novos miRNAs, nós analisamos o conjunto de novos pequenos RNAs derivados de gancho utilizando critérios semelhantes aos utilizados em outros estudos de descoberta miRNA recentes [23], [33], [36]:

i

. características de emparelhamento do hairpin,

ii

. A presença de múltiplas leituras compartilhando o mesmo terminal 5 ‘,

iii

. ausência de anotação indicando não-miRNA biogênese,

iv

. região semente compartilhada com um animal conhecido miRNA e

v

. presença de forma de estrela miRNA correspondente lido (s). Foram consideradas, incluindo conservação da sequência filogenética como critério; no entanto, isso não aumentar significativamente a nossa análise que nenhum dos novos miRNAs derivado de gancho foram conservados para além de primatas. Isso não é inesperado, dado que a maioria evolutivamente microRNAs conservados provavelmente já foram descobertos através de abordagens computacionais seguido por experimentos de validação dirigidas.

Usando os critérios acima, foram identificados seis novos miRNAs. Todos os seis critérios conheci

i Network –

iii

e três dos seis critério TEM

iv

e três critério TEM

v

(Figura 6; mais detalhes são fornecidos na Tabela S5). Além disso, o mapeamento das novas sequências de miARN para a sequência do genoma humano de referência revelou que três dos seis novos miARNs estão presentes em intrões de outros genes (e codificado na mesma cadeia como os respectivos genes do hospedeiro) (Figura 6), bem como muitos miRNAs anteriormente anotados [37], [38]. Dois dos nossos novos miRNAs estão localizados nas repetições anotados, mas temos provas suficientes de apoio forte que eles foram designados como romance. O contexto da estrutura precursor previsto e a sequência das formas de estrela de miARN correspondentes a novos miARNs é dada na Figura 6.

estruturas secundárias putativo para os seis novos miARNs descoberto neste estudo são mostrados. sequências Novel miRNA são mostrados em formas vermelhas e estrela de novos miRNAs são mostrados em azul (se identificados em nossos dados de sequenciação). As sequências são novos no que diz respeito a libertar miRBase 12,0 [21], [22]. Identificadores entre parênteses referem-se às formas estrela miRNA onde estes foram identificados nos dados de sequenciamento 454. Correspondentes detalhes dos novos miARNs são dadas na tabela abaixo as estruturas em gancho de cabelo.

As restantes sequências composto 181 pequenos RNAs derivados de gancho (correspondendo a 550 loci genómico). Buscou-se selecionar a partir desta lista as sequências mais promissores para designar como “miRNAs candidatos” que podem ser confirmados no futuro, como

bona fide

miRNAs como prova adicional acumula. miRNAs candidatos eram obrigados a cumprir os critérios

i-iii

e ter alguma forma adicional de provas (isto é, a região de sementes compartilhada com um miRNA conhecido). Isto permitiu-nos para refinar a lista final de 39 miRNAs candidatos (potencialmente provenientes de 50 loci genómico) (Tabela S5).

Discussão

O trabalho aqui relatado foi motivada pela hipótese de que a inteira repertório de miRNAs expressos em câncer de ovário, incluindo miRNAs potencialmente Tecido e específicos do cancro, ainda não havia sido elucidado. A abordagem sequenciamento paralelo em massa nos permitiu estar completa (isto é, a identificação não só conhecido, mas também romance miRNAs), ea natureza “digital” dos dados permitiu uma estimativa semi-quantitativa do nível de expressão relativa de muitos miRNAs. Usando essa abordagem, descobrimos seis novos e 39 candidatos miRNAs e delineado o padrão de 498 miRNAs anteriormente anotados expressão em culturas MANGUEIRA primários e tecidos normais câncer epitelial de ovário. É notável que um dos quatro publicados estudos microarray miRNA de câncer de ovário [17] – [20], mesmo a mais abrangente das plataformas de matriz foi limitada a 470 miRNAs humanos e formas estrela [17], enquanto que a versão atual do miRBase ( A versão 12.0) [21], [22] contém 969 miRNAs humanos e formas de estrela. Além disso, 223 dos miRNAs conhecidos foram identificados e caracterizados em nossos conjuntos de dados de sequenciamento não estavam representados no mesmo a microarray mais abrangente. Portanto, os resultados aqui apresentados estendem-se substancialmente a amplitude do conhecimento de miRNAs expressos em câncer de ovário.

A identificação de novos miRNAs em nossos dados é particularmente notável. Dado que estes novos miARNs não foram detectados em vários estudos miARN de sequenciação em grande escala de outros tecidos, especula-se que elas são expressas de uma forma específica do cancro do ovário e pode ser de especial interesse como biomarcadores de cancro. Serão necessários estudos futuros para testar esta hipótese, bem como para investigar os papéis biológicos destas novas miARNs na patogénese do cancro do ovário.

Tomados em conjunto, os miARNs conhecidos e novos identificados neste estudo fornecem um conjunto de candidato marcadores de miRNA para análise futura como marcadores à base de sangue para a detecção de câncer de ovário. A expressão diferencial entre os estados normais e malignas pode fornecer um método de priorização de candidatos a avançar. Nós também prevêem que os miRNAs que encontramos a ser diferencialmente expressos entre os subtipos de câncer histológicos poderia servir a um propósito duplo, como marcadores à base de sangue, tanto para a detecção do câncer e classificação histológica.

Uma das características únicas do nosso estudo é a utilização de culturas primárias do epitélio do ovário humano normal de superfície como o grupo de comparação normais. Embora o epitélio de superfície do ovário (juntamente com epitélio trompa de Falópio distal nas proximidades) é considerado a origem do câncer epitelial de ovário [39] a maioria dos outros estudos de perfis de miRNA têm tipicamente usado ovário inteiro como a comparação normal. Isto é problemático para a identificação de miARNs que são diferencialmente expressos em cancro do ovário em relação ao normal, porque a camada epitelial da superfície celular de espessura única compreende menos de 1% do teor celular de todo o ovário. Realizar comparações de tecido de cancro do ovário a um controlo normal adequada é um problema desafiador na pesquisa do câncer de ovário. A nossa abordagem, embora ele evita os problemas associados com o uso de ovário inteiro como uma amostra normal, tem a limitação de que não sabemos se e que as alterações na expressão microARN pode ser atribuída a condições de cultura utilizados para a cultura de células MANGUEIRA primária. Estudos futuros incorporem análises paralelas de culturas de células primárias derivadas de tecidos de câncer de ovário pode abordar esta questão.

Embora o uso de diferentes tipos de amostras de ovário “normais” torna a comparação dos nossos dados com outros estudos difíceis na maioria dos casos,