Abstract
regime de combinação à base de quimioterapia cisplatina é uma alternativa razoável à cistectomia em avançado /metastático cancro da bexiga, mas a aquisição de cisplatina resistência é comum em pacientes com câncer de bexiga. Estudos anteriores mostraram que a perda de proteína-quinase que interage homeodom�io-2 (HIPK2) contribui para a proliferação celular e a tumorigénese. No entanto, o papel de HIPK2 na regulação quimiorresistência de células de cancro não é completamente compreendido. No presente estudo, descobrimos que HIPK2 mRNA e os níveis de proteína são significativamente diminuída em células resistentes à cisplatina cancro da bexiga
in vivo
e
in vitro
. Regulação negativa do HIPK2 aumenta a viabilidade das células em uma dose e modo dependente do tempo durante o tratamento com cisplatina, ao passo que a sobre-expressão de HIPK2 reduz a viabilidade das células. HIPK2 superexpressão supera parcialmente resistência cisplatina em células RT4-CISR. Além disso, mostramos que Wip1 (fosfatase induzida por p53 1 do tipo selvagem) expressão é regulada positivamente em células RT4-CISR comparação com células RT4 e HIPK2 regula negativamente a expressão Wip1 em células de câncer de bexiga. HIPK2 e expressão Wip1 também está correlacionada negativamente após a quimioterapia combinada à base de cisplatina
in vivo
. Finalmente, demonstramos que a superexpressão de HIPK2 sensibiliza células de câncer de bexiga resistente à quimioterapia cisplatina pela regulação da expressão Wip1.
Conclusões
Estes dados sugerem que a sinalização HIPK2 /Wip1 representa uma nova via de regulação chemoresistance, oferecendo assim um novo alvo para a quimioterapia de câncer de bexiga
Citation:. Lin J, Zhang Q, Lu Y, W Xue, Xu Y, Zhu Y, et al. (2014) regulação negativa do HIPK2 aumenta a resistência das células do cancro de bexiga à cisplatina, regulando Wip1. PLoS ONE 9 (5): e98418. doi: 10.1371 /journal.pone.0098418
editor: Thomas G. Hofmann, German Cancer Research Center, Alemanha |
Recebido: 24 Janeiro, 2014; Aceito: 02 de maio de 2014; Publicado em: 20 de maio de 2014
Direitos de autor: © 2014 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Human câncer de bexiga é o décimo malignidade mais comum em. mulheres, e a quarta mais comum em homens [1], [2]. Estudos patológicos indicam que o câncer de bexiga é composto por dois grandes grupos. O câncer de bexiga mais comum é o carcinoma urotelial (UC) que normalmente se repete, mas raramente progridem [3], [4]. Além disso, o câncer de bexiga invasivo é mais agressivo, e metade dos pacientes com câncer de bexiga invasivo desenvolver metástases à distância [5], [6]. Chemoradiation é uma alternativa razoável à cistectomia em avançado /metastático cancro da bexiga, mas a resistência à quimioterapia do cancro é um fenômeno comum, especialmente no cancro da bexiga metastático [7]. No entanto, os avanços na quimioterapia para o propósito do tratamento do cancro da bexiga tem sido limitada porque os mecanismos subjacentes que causam quimiorresistência não são conhecidos. Revelando o mecanismo molecular de quimioresistência é indispensável para o desenvolvimento de agentes quimioterapêuticos eficazes.
Homeodomínio-interagindo proteína cinase-2 (HIPK2) é uma serina /treonina quinase que, como foi mostrado para ser envolvido no supressor de tumor [8], [9], [10]. HIPK2 é activada em resposta a vários tipos de agentes que danificam o ADN, tais como cisplatina, ultravioleta e fármacos quimioterapêuticos roscovitina [9]. HIPK2 fosforila p53 para a activação específica de genes alvo pró-apoptóticos, incluindo p53AIP1, PIG3, Bax e Noxa e contribui para a regulação da apoptose induzida por p53 [11], [12], [13]. Puca
et ai demonstraram que HIPK2 é um importante regulador da actividade de p53 em resposta a um fármaco quimioterapêutico [14]. HIPK2 é expressa de maneira diferente em células sensíveis em relação quimiorresistentes em resposta a diferentes fármacos quimioterapêuticos (isto é, a cisplatina e a adriamicina). inibição HIPK2 suprime a apoptose induzida por adriamicina em células cancerosas quimiorresistentes, ao passo que a sobre-expressão de HIPK2 desencadeia a apoptose em células quimiorresistentes, associada com a indução de AIP1 p53Ser46 gene-alvo [14], [15], [16]. Lazzari
et ai mostraram que HIPK2 knockdown induz resistência a diversos fármacos anti-cancerígenos, mesmo por targetingΔNp63α em células sem p53 [17].
de tipo selvagem fosfatase induzida por p53 1 (Wip1) é um fosfatase de serina /treonina-p53 induzível que desliga respostas danos no DNA checkpoint pela desfosforilação de certas proteínas, tais como p38 quinase activada por mitogénio proteína, p53, cinase de ponto de verificação 1 e cinase de ponto de verificação 2 [18], [19]. Wip1 é alvo de HIPK2 para a degradação [20]. Dados recentes também indicam que Wip1 é sobre-expressa em vários tumores humanos, e está associada com quimiorresistência [19]. Wang
et al
mostrou que Wip1 knockdown aumenta a sinalização de danos ao DNA e re-sensibiliza células orais carcinoma de células escamosas (SCC) à cisplatina [21]. Utilizando modelos de tumor de xenoenxerto, que demonstrou que a sobre-expressão de Wip1 promove tumorigénese e sua inibição melhora a resposta do tumor à cisplatina [21]. Ao contrário, Goloudina
et al
mostrou que Wip1 superexpressão sensibiliza células cancerígenas do cólon HCT116 (p53
– /-) à cisplatina na indução da transcrição dependente de Runx2 da proteína Bax pró-apoptótica [22]. No entanto, o papel de Wip1 na regulação da sensibilidade cisplatina de células de câncer de bexiga não é totalmente compreendido.
Com base nestes resultados, nós investigamos se HIPK2 regula quimio-sensibilidade, visando Wip1 em células de câncer de bexiga. Aqui descobrimos que a regulação positiva de HIPK2 inibe a expressão Wip1, que sensibiliza células de câncer de bexiga resistente à quimioterapia cisplatina.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e amostras de tecido
Os protocolos utilizados o estudo foram aprovados pela protecção dos seres humanos Comitê do Hospital. As amostras de sangue foram adquiridas com o consentimento informado por escrito do Beijing Friendship Hospital Filiado à Universidade Capital de Ciências Médicas. Um total de 31 pacientes irressecáveis /metastáticos de câncer de bexiga foram incluídos no estudo, e todos os pacientes receberam baseada em cisplatina quimioterapia de combinação entre 12/2011 e 08/2013 (idade média 62,3, intervalo 51-80).
linhas celulares de cancro da bexiga humana com tipo selvagem de p53 (RT4 e 253J) foram obtidos e mantidos como recomendado pela American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). A cisplatina-resistente sublinha RT4-resistência (RT4-CISR) foi criado pela exposição contínua a concentrações crescentes de cisplatina durante um período de 12 meses, conforme relatado anteriormente [23].
PCR em tempo real
o ARN total foi extraído a partir de células ou tecidos utilizando Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA), e a transcrição reversa (RT) as reacções foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. PCR em tempo real foi realizado utilizando um protocolo padrão do kit de SYBR Green PCR (Toyobo, Osaka, Japão). p-actina foram usadas como referência para a mRNAs. ΔCt valores foram normalizados para níveis de p-actina. A
-ΔΔCt método 2 foi utilizado para determinar a quantificação relativa dos níveis de expressão do gene. Cada amostra foi analisada em triplicado.
análise Western blot
análise de Western blot para avaliar HIPK2, Wip1 e expressão β-actina foi realizada como previamente descrito [24]. HIPK2 (ab28507) e Wip1 (ab72000) anticorpos primários foram comprados na Abcam (Cambridge, MA, EUA). Os anticorpos primários de p-actina foram adquiridos a Sigma (MO, EUA).
A viabilidade celular ensaio
As células foram plaqueadas e cultivadas em placas de 96 poços em 0,1 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo 10 % (v /v) de soro fetal de vitelo a 37 ° C durante 24 h. A partir daí, o meio foi mudado e adicionou-se 0,1 ml de meio fresco contendo droga indicadas e as células foram incubadas durante mais 48 h. O número de células viáveis foi determinado usando o ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) como descrito [25].
ARNi e a sobre-expressão
ARNi foi realizada como descrito anteriormente [26], [27]. Os siRNAs utilizados neste estudo eram misturas de três siRNAs e foram adquiridos a partir de Genepharm (Xangai, China). pcDNA-HIPK2 e pcDNA-Wip1 foram construídos de modo a sobre-expressar ou HIPK2 Wip1 através da introdução de um fragmento contendo o precursor ou HIPK2 Wip1 no plasmídeo pcDNA.
A análise estatística
Todos os dados são expressos como média ± padrão desvio (DP) de pelo menos três experiências separadas. As diferenças entre os grupos foram analisadas utilizando
t
teste de Student. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a
p
. 0,05
Resultados
expressão HIPK2 é diminuído em quimio-resistentes células de câncer de bexiga
A cisplatina é atualmente o agente antitumoral mais eficaz contra o câncer de bexiga avançado. No entanto, a resistência à quimioterapia combinada à base de cisplatina é um fenômeno comum, especialmente no cancro da bexiga metastático. Para esclarecer os mecanismos moleculares subjacentes resistência a cisplatina no cancro da bexiga, um total de 31 pacientes com câncer de bexiga metastático foram incluídos, e nível de expressão HIPK2 foi ensaiada após a quimioterapia combinada à base de cisplatina. Figura 1A mostraram que a expressão HIPK2 em pacientes que são resistentes à quimioterapia-se significativamente diminuída em comparação com pacientes sensíveis à quimioterapia. Em seguida, foi estabelecido um sub-linha resistente a cisplatina a partir da linha celular de cancro da bexiga humano RT4 (RT4-CISR), e ensaiou-se o nível de expressão HIPK2. Como mostrado na Figura 1B, os níveis de ARNm HIPK2 foram mais baixos em células RT4-CISR em comparação com células RT4. Do mesmo modo, os níveis de proteína HIPK2 foram regulados negativamente em células RT4-CISR (Figura 1C). Estes dados indicam que a regulação negativa da HIPK2 pode ser relacionada com a resistência a cisplatina de células cancerosas da bexiga.
(a) a análise do nível de expressão HIPK2 foi realizada em amostras de sangue em pacientes sensíveis a cisplatina (n = 19) e pacientes resistentes à cisplatina (n = 12). O ARN total foi extraído e submetido a em tempo real de RT-PCR para analisar o nível relativo de HIPK2 em cada amostra. A expressão relativa foi calculada e normalizada em relação a p-actina ARNm. Todos os dados foram expressos como alteração vezes em relação a um tecido (controlo, expressão = 1). Os resultados foram expressos como Log10 (2
-ΔΔCt). *
p Art 0,05. (B) A sub-linha resistente a cisplatina RT4-CISR foi estabelecida por exposição contínua a concentrações crescentes de cisplatina ao longo de um período de tempo de 12 meses, e os níveis de HIPK2 foram analisadas por PCR em tempo real. HIPK2 níveis relativos foram calculados com respeito ao controlo. *
p Art 0,05. (C) Análise de Western blot do nível de proteína HIPK2 em células RT4 RT4-CISR e (até). Também mostraram a quantificação relativa do nível de proteína HIPK2 (parte inferior, n = 3). *
p Art 0,05
HIPK2 knockdown aumenta a viabilidade celular durante o tratamento com cisplatina em células de câncer de bexiga
Para investigar o papel do HIPK2 na resistência a cisplatina, em separado. superexpressão e ablação experiências foram feitas usando pcDNA-HIPK2 ou HIPK2 ARNsi durante cisplatina tratamento e a viabilidade celular foi ensaiada. Figura 2A mostrou que os níveis de expressão foram HIPK2 diminuiu em células RT4 tratados com HIPK2 siRNA. Em seguida, células RT4 foram incubadas com diferentes concentrações de cisplatina (0, 1, 2, 3, 4, 5 e 6 uM) durante 48 h. Tal como mostrado na Figura 2B, a inibição HIPK2 aumenta marcadamente a viabilidade das células RT4 em comparação com o controlo negativo (N.C). Como era de esperar, de knockdown HIPK2 aumenta a viabilidade das células RT4 seguindo o tratamento com cisplatina no modo dependente do tempo (Figura 2C). Em células RT4-CISR, o tratamento com cisplatina resultou numa inibição modesta da viabilidade celular, enquanto que a sobre-expressão de células RT4-CISR HIPK2 re-sensibilizados a cisplatina (Figura 2D e E). Do mesmo modo, a expressão HIPK2 foi inibida em células 253J após o tratamento HIPK2-siARN (Figura S1), e a inibição aumenta a viabilidade celular HIPK2 253J no modo dependente do tempo (Figura 2F). Estes dados sugerem que a cisplatina HIPK2 aumenta a sensibilidade de células cancerosas da bexiga. Células RT4
(A) foram transfectadas com o nível de expressão HIPK2 HIPK2-siRNAs e foi analisada por PCR em tempo real. N.C = controle negativo (mexidos) siRNA. (B) As células foram tratadas com RT4 HIPK2-siRNAs, e a viabilidade celular foi ensaiada utilizando MTT após o tratamento com cisplatina (1 a 6 uM). Os resultados mostram dados de seis experiências independentes, expresso como a média ± DP. *
p Art 0,05. (C) As células foram tratadas com RT4 HIPK2-siRNAs, e nos pontos de tempo indicados, a viabilidade celular foi ensaiada utilizando MTT após o tratamento com cisplatina (6 uM). Os resultados mostram dados de seis experiências independentes, expresso como a média ± DP. *
p Art 0,05. (D) As células RT4-CISR foram transfectadas com pcDNA-HIPK2 e nível de expressão HIPK2 foi analisada por PCR em tempo real. (E) HIPK2 foi sobre-expresso em células RT4-CISR, e a viabilidade celular foi ensaiada utilizando MTT após o tratamento com cisplatina (1 a 6 uM). Os resultados mostram dados de seis experiências independentes, expresso como a média ± DP. *
p Art 0,05. células (F) 253J foram tratados com HIPK2-siRNAs, e a viabilidade celular foi ensaiada utilizando MTT após o tratamento com cisplatina (6 uM). *
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. 0,05
HIPK2 regula negativamente a expressão Wip1
Estudos anteriores mostraram que HIPK2 regula a progressão do tumor e resistência aos medicamentos através de vários genes alvo em potencial, tais como Bax, p53AIP1, Noxas, etc [14]. HIPK2 também desempenha um papel crucial na iniciação da sinalização de reparação de quebras de cadeia dupla por controlar os níveis de Wip1 em resposta à radiação [20] ionizante. Estudos recentes indicam que Wip1 é sobre-expressa em vários tumores humanos, e está associada com quimiorresistência [19]. No entanto, pouco se sabe sobre se HIPK2 regula a resistência a cisplatina, visando Wip1. Nós primeira ensaiada do nível de expressão de Wip1 em células RT4 e RT4-CISR. Figura 3A e B mostraram que mRNA Wip1 e os níveis de proteína foram significativamente upregulated na RT4-CISR comparação com células RT4. Em seguida, ensaiadas HIPK2 se regula negativamente a expressão Wip1. HIPK2 knockdown aumento dos níveis de expressão Wip1 em linhas celulares de cancro da bexiga (Figura 4A), ao passo que a sobre-expressão HIPK2 significativamente inibida nível de ARNm Wip1 em linhas celulares de cancro da bexiga (Figura 4B). A análise Western blot mostrou que HIPK2 knockdown aumenta o nível de proteína Wip1 (Figura 4C).
In vivo
, uma correlação negativa significativa também é observada entre os níveis HIPK2 e os níveis Wip1 em pacientes com cancro da bexiga após a quimioterapia combinada à base de cisplatina (
r
2 = 0,1507,
p
= 0,0063, Figura 4D). Estes dados mostraram que a regulação negativa dos resultados HIPK2 em um aumento da expressão Wip1.
(A e B) Wip1 ARNm e os níveis de expressão de proteína foram analisadas em células RT4 e RT4-CISR, respectivamente. *
p
. 0,05
níveis (A) de mRNA Wip1 foram avaliadas por PCR em tempo real após a inibição HIPK2 em células RT4 e células 253J. *
p Art 0,05. (B) Nível de mRNA Wip1 Relativa após HIPK2 superexpressão em células RT4 e células 253J. *
p Art 0,05. (C) Análise de Western blot de nível Wip1 após a inibição HIPK2 em células RT4 e 253J. (D) correlação negativa entre os níveis HIPK2 e os níveis Wip1 em 18 pacientes com câncer de bexiga após a quimioterapia combinada à base de cisplatina (
r
2 = 0,1507,
p
= 0,0063) . Relativa expressão Wip1 ou HIPK2 foi calculado e normalizado em relação ao ARNm de p-actina. Todos os dados foram expressos como alteração vezes em relação a um tecido (controle, expressão = 1).
HIPK2 superexpressão sensibiliza células de câncer de bexiga resistente à quimioterapia cisplatina pela regulação da expressão Wip1
A seguir, investigou o papel de Wip1 na regulação da viabilidade celular durante o tratamento com cisplatina. Figura 5A demonstrou que a sobre-expressão Wip1 aumento da viabilidade celular em células RT4 durante o tratamento com cisplatina. HIPK2 inibe a expressão Wip1 e diminui a resistência à cisplatina, e uma correlação negativa significativa é observada entre o HIPK2 eo Wip1. Nós portanto especulado que o papel de HIPK2 na regulação da resistência mediada pela cisplatina é Wip1. Figura 5B mostrou que a inibição HIPK2 aumenta marcadamente a viabilidade das células RT4 em comparação com N.C, enquanto que a inibição Wip1 em células-downregulating HIPK2 reduz parcialmente a viabilidade celular. Da mesma forma, a inibição Wip1 em células-downregulating HIPK2 reduz a viabilidade das células, em parte, 253J (Figura 5C). Mais importante, a viabilidade das células é reduzida por HIPK2 sobre-expressão, enquanto que a sobre-expressão Wip1 aumento da viabilidade de células que sobre-expressam HIPK2 (Figura 5D). Estes dados confirmam que a sobre-expressão HIPK2 sensibiliza células de cancro da bexiga resistente à quimioterapia, a cisplatina por regulação da expressão Wip1.
(A) Wip1 foi sobre-expresso em células RT4, e a viabilidade celular foi ensaiada utilizando MTT após o tratamento com cisplatina (6 uM). Os resultados mostram dados de seis experiências independentes, expresso como a média ± DP. *
p Art 0,05. (B e C) e as células RT4 253J foram tratados com HIPK2 siRNA ou HIPK2 siRNA mais Wip1 siRNA, e nos pontos de tempo indicados, a viabilidade celular foi ensaiada utilizando MTT após o tratamento com cisplatina (6 uM). (D) HIPK2 HIPK2 ou mais Wip1 foi sobre-expresso em células RT4-CISR, e a viabilidade celular foi ensaiada utilizando MTT após o tratamento com cisplatina (6 uM). *
p
. 0,05
Discussão
Human cancro da bexiga é um dos cancros mais mortais em todo o mundo, e sua incidência está a aumentar em muitos países. Além de tratamentos cirúrgicos, quimioterapia sistemática, desempenham um papel importante no tratamento do cancro da bexiga, especialmente para pacientes com câncer avançado e metastático bexiga [28], [29]. No entanto, apesar de um rápido encolhimento do tumor em massa seguindo ciclos de quimioterapia, a quimiorresistência de células de cancro frequentemente resulta na recorrência e metástase de câncer [30], [31] subsequente. Considerando o mau prognóstico para pacientes com câncer de bexiga, principalmente por causa de seu diagnóstico tardio e baixa resposta à quimioterapia, buscou-se identificar marcadores preditivos de resposta terapêutica e alvos moleculares para aumentar a sensibilidade ao tratamento.
Nossos estudos fornecem uma base racional para o uso potencial de transdução HIPK2 para sensibilizar células de cancro da bexiga quimiorresistentes a cisplatina. Nós mostramos que os níveis de expressão HIPK2 são significativamente regulada negativamente em cisplatina-resistente RT4 celular (RT4-CISR) em comparação com células RT4. Regulação negativa do HIPK2 aumenta a resistência à cisplatina em uma dose e modo dependente do tempo em células RT4, enquanto que a expressão forçada de HIPK2 reduz a viabilidade celular durante o tratamento com cisplatina. Além disso, a sobre-expressão de HIPK2 supera parcialmente a resistência a cisplatina em células RT4-CISR. Estudos anteriores mostraram que HIPK2 é activada em resposta a vários tipos de agentes que danificam o ADN, tais como cisplatina, ultravioleta e fármacos quimioterapêuticos roscovitina [14], [32], e é um importante regulador da actividade de p53 em resposta a um fármaco quimioterapêutico [ ,,,0],11], [14]. A sobre-expressão de HIPK2 em p53 do tipo selvagem re-sensibiliza as células de cancro do ovário quimiorresistentes à quimioterapia por mediar a fosforilação da p53. No entanto, o mecanismo molecular de HIPK2 na regulação quimiorresistência de células de cancro não é completamente compreendido.
Wip1 é uma fosfatase de serina /treonina-p53 induzível que desliga-se respostas de checkpoint de dano do DNA pela desfosforilação de certas proteínas envolvidas no DNA reparação e o posto de controle do ciclo celular [19]. O gene Wip1 é amplificada em muitos tipos de tumores [33]. Música
et ai mostraram que Wip1 interage com e desfosforila BAX para suprimir a apoptose mediada por BAX em resposta a irradiação y em células de cancro da próstata [19]. células LNCaP resistente à radiação mostrou um aumento dramático nos níveis de Wip1 e movimento BAX prejudicada para a mitocôndria após c-irradiação, e esses efeitos foram revertidos por um inibidor Wip1 [19]. Wang
et al
mostrou que Wip1 é um alvo eficaz droga para a terapia do cancro reforçada [21]. inibição Wip1 aumenta a sinalização de danos ao DNA e resensitizes células CEC oral à cisplatina. Wip1 regulação positiva promove a tumorigénese e sua inhbition melhora a resposta do tumor à cisplatina. Consistente com resultados anteriores, verificou-se que o nível de Wip1 expressão é regulada positivamente em células RT4-CISR em comparação com células RT4, e Wip1 superexpressão aumenta a viabilidade celular durante o tratamento com cisplatina em células RT4. Importante, nós demonstramos que HIPK2 regula negativamente a expressão Wip1 em células de câncer de bexiga. HIPK2 e expressão Wip1 também está correlacionada negativamente após a quimioterapia combinada à base de cisplatina
in vivo
. A expressão forçada de HIPK2 sensibiliza células de câncer de bexiga resistente à quimioterapia cisplatina pela regulação da expressão Wip1. Conclusão: Estes dados demonstram que a sinalização HIPK2 /Wip1 representa uma nova via de regulação chemoresistance. Assim, este estudo revela que HIPK2 /Wip1 é um alvo eficaz droga para terapia de câncer avançado.
Informações de Apoio
Figura S1. nível de expressão
HIPK2 foi analisada por PCR em tempo real em células 253J. N.C = controle negativo (mexidos) siRNA. *
p Art 0,05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0098418.s001
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