Abstract

Background

Genome-largos estudos de associação (GWAS) em caucasianos identificou catorze índice único polimorfismos de nucleotídeo (iSNPs) que influenciam o cancro colorectal risco (CRC).

Métodos

Nós investigamos o papel de onze iSNPs ou SNPs substitutos (sSNPs), em alta desequilíbrio de ligação (LD, r

2≥0.8) e dentro de 100 kb arredores de iSNPs, em 2.000 (SCH) casos e controles pareados por idade e gênero Cingapura chineses.

resultados

Somente rs6983267 ISNP em 8q24.21 e rs6695584 sSNPs, rs11986063, rs3087967, rs2059254 e rs7226855 em 1q41, 8q23.3, 11q23.1, 16q22.1 e 18q21.1 mostrou respectivamente evidência de associação com o risco de CRC, com odds ratio (OR), variando 1,13-1,40. rs827401 SSNP em 10p14 foi associado com o risco de câncer retal (OR = 0,74, 95% CI 0,63-0,88), mas não o prognóstico da doença (OR = 0,91, 95% CI 0,69-1,20). Curiosamente, rs3087967 SSNP em 11q23.1 foi associado com o risco CRC em homens (OR = 1,34, 95% CI 1,14-1,58), mas não as mulheres (OR = 1,07, 95% CI: 0,88-1,29), sugerindo um papel específico do género . Metade das variantes caucasianos-identificados, incluindo a via loci recentemente fine-mapeados BMP,

BMP4

,

GREM1

,

BMP2

e

LAMA 5

, não mostraram qualquer evidência de associação com a CRC no SCH (OR ~ 1; valor-p 0,1). Comparando-se os resultados deste estudo com a dos norte e Hong Kong chinesa, única variantes nos cromossomos 8q24.21, 10p14, 11q23.1 e 18q21.1 foram replicados em pelo menos dois dos três estudos chineses.

Conclusões

Os resultados contrastantes entre caucasianos e chinês pode ser devido a diferentes padrões de LD e freqüências alélicas ou heterogeneidade genética. Os resultados sugerem que as variantes comuns adicionais que contribuem para CRC predisposição permaneceu a ser identificado

Citation:. Thean LF, Li HH, Teo YY, Koh W-P, Yuan J-M, Teoh ML, et al. (2012) Associação das variantes Caucasiano-identificada com Colorectal Cancer Risk em Singapura chinês. PLoS ONE 7 (8): e42407. doi: 10.1371 /journal.pone.0042407

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Abril de 2012; Aceito: 04 de julho de 2012; Publicação: 03 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Thean et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por uma bolsa do Conselho Nacional de Pesquisa médica de Singapura (NMRC /1193/2008) para PYC e bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (números de subvenção R01-CA55069, R35-CA53890, R01-CA80205, R01-CA98497 e R01-CA144034) para WPK e JMY. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Até o momento, GWAS nas populações caucasianas descobriram catorze iSNPs nos cromossomos 1q41, 3q26.2, 8q23.3, 8q24.21, 10p14, 11q23.1, 12q13.13, 14q22, 15q13.3, 16q22.1, 18q21.1, 19q13.1, 20p12.3 e 20q13.33 associado com o risco CRC [1]. Mapeamento fino em várias dessas regiões candidatas foram identificados outros SNPs que poderiam ser potencialmente variantes funcionais [2], [3]. Uma vez que existem diferenças significativas nas freqüências alélicas e padrões LD em diferentes populações, essas variantes têm de ser replicados para determinar seu papel no CRC. Mais de um terço dessas variantes, por exemplo, foram encontrados para ter odds ratio na direção oposta nos afro-americanos [4].

Apenas cinco variantes, rs6983267 (8q24.21), rs10795668 (10p14 ), rs3802842 (11q23.1), rs4939827 (18q21.1) e rs961253 (20p12.3) foram replicadas no norte da China [5]. Mais recentemente, quatro variantes, rs7014346 (8q24.21), rs4779584 (15q13.3), rs10795668 (10p14) e rs4939827 (18q21.1) foram replicados em Hong Kong chinesa [6]. Não há nem LD nem população informações de estrutura em nenhum dos estudos. Vários relatos indicam que há um “norte-sul” estrutura populacional estreitamente correlacionados com a localização geográfica e que a maior diferença genética é entre o Han do Norte e do Sul chineses han [7], [8].

Realizamos genotipagem de 2.000 séries de caso-controle equivalente em idade e sexo do Singapore Chinese (SCH) pacientes de um único centro e controles saudáveis ​​com base na população de todo o genoma. O SCH com 50 anos ou mais compreendem principalmente os descendentes de imigrantes das províncias chinesas de Guangdong e Fujian, e é assim representante dos sul chineses han. Determinar o risco genético para a CRC no SCH é pertinente como o SCH tem a maior incidência CRC entre todas as raças em Singapura; internacionalmente, a sua incidência é maior do que a dos moradores de Xangai, China e comparável à dos brancos caucasianos [9].

Materiais e Métodos

Ética Declaração

a recolha de amostras e informações clinico-patológico de pacientes e controles foi realizado com o consentimento informado por escrito e aprovação de SingHealth centralizado Institutional Review Board B.

Coleta de amostras

amostras correspondentes de mucosa e tumor são rotineiramente coletados e arquivados de pacientes submetidos a ressecção em Singapore general Hospital (SGH). SGH é o hospital público premier que trata cerca de metade dos pacientes com CCR em Singapura. As amostras da mucosa correspondentes recolhidos são tipicamente pelo menos 10 cm de distância do local do tumor. Mucosa Espécimes de 1.000 pacientes com CCR chineses esporádicos (definidos como 50 anos de idade ou mais na data da operação e sem história familiar dominante da FAP e HNPCC) arquivados ao longo dos últimos dez anos foram selecionados como casos para o estudo.

A Predio para SNPs em cromossomos 19q13.11 (a), 11q23.1 (B), 20p12.3 (C) e 20p12.3 (D) foram derivados de controles SCH e indivíduos HapMap CHB, respectivamente. Flecha e seta indicam posições de ISNP e sSNPs interrogados. Os sSNPs interrogados nos cromossomos 11q23.1 (B) e 20p12.3 (D) foram rs3087967 e rs5005940, respectivamente. LD foi medida como R

2.

Amostras de sangue de 1.000 doadores pareados por idade e gênero saudáveis, da Singapore Health Study chinês (SCHS) (n = 931) [10] e do Unidade de Triagem SGH Saúde (n = 69) constituíram os controles do estudo. A idade foi correspondida dentro de três anos do ano de operação dos casos. Os controles foram entrevistados para garantir que eles não têm história familiar CRC.

Genome-wide Genotipagem

As amostras foram randomizados para que as amostras consecutivamente adquiridos não foram extraídos de forma consecutiva. O ADN genómico foi extraído utilizando procedimentos padrão (Methods S1). verificação de todo o genoma foi realizada com Affymetrix GeneChip Mapping Human SNP matriz 6.0 que consiste 906, 600 SNPs. A 600 ng de amostra de ADN genómico foi digerido com as enzimas de restrição NSPI e Styl, amplificado, fragmentada, rotulado e hibridizado para a matriz durante 16 h conforme as instruções do fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). Arrays foram digitalizados com o scanner Affymetrix 3000-7G e analisados ​​com o v3 Genotipagem Console. arquivos CHP foram gerados com o algoritmo Birdseed. Para minimizar o efeito de lote, a genotipagem foi realizada por um operador; e casos pareados e amostras de controle foram processados ​​e vestiu juntos.

Análise Estatística

Os CHP (genótipos) arquivos da varredura do genoma foram importados para Ouro Helix SVS para análise estatística . SNP loci que não estavam em Hardy-Weinberg (p≤1E-7) nos controles foram filtrados. Análise de Componentes Principais (PCA) foi realizada em 869, 371 SNPs autossômicas em todas as 2.000 amostras e 270 HapMap (consistindo de 90 CEU, 45 chineses Han Pequim (CHB), 45 Japonês (JPT) e 90 Yoruba (YRB)) e 268 Singapura Projeto genoma Variant (SGVP) amostras. Os casos e controlos com o cluster CHB e as amostras SGVP chineses indicando que não há nenhuma subestrutura população. Dezesseis casos anómalos, incluindo dois controles que provavelmente têm ascendência mistura, foram removidos. Houve diferença observável no agrupamento de casos e controles para PC1. Esta diferença não era mais aparente após a correção PC1 (Figura S1).

Uma vez que a hipótese testada neste estudo era saber se os SNPs CEU-identificadas para o risco de CRC pode ser replicado no SCH, as múltiplas correções de teste incluiu apenas o número de SNPs em situação de risco investigados. Assim, foi aplicada uma correcção de Bonferroni de 0,0031 (0,05 /16). regressão logística multivariada pelo modelo aditivo foi realizada após o ajuste para PC1. SNPs com p 0,0031 ou 0,0031 p 0,1 foram considerados significativamente ou mostrou uma tendência de ser associada com o risco de doença respectivamente. análise de subgrupo foi realizada para SNPs seleccionados. Os iSNPs foram examinados sempre que possível. Se o ISNP não foi encontrado na plataforma SNP 6.0 ou foi não-polimórfica no SCH (MAF 0,01), substituto do SNP (SSNP) em alta L.D. (R

2 0,8) e dentro de 100 kb proximidades de ISNP foi identificado de indivíduos com HBC de HapMap e examinados. sSNPs que foram recentemente identificadas por mapeamento multa no CEU foram interrogados, sempre que possível [2], [3]. A taxa de chamada média dos onze iSNPs e sSNPs interrogado foi de 0,99 (variando de 0,97 a 1) e os genótipos desses SNPs agrupado bem.

A recorrência foi definida como o tempo de operação para recidiva local e /ou metástases à distância . Todos os pacientes sem recorrência até 31 de janeiro

st 2012, foram censurados. A análise de Kaplan-Meier com o teste de log rank foi utilizado para avaliar a relação entre genótipo e sobrevida livre de recorrência. teste de regressão de Cox foi utilizado para testar a independência dos co-variáveis ​​e estimar o risco de recorrência.

Resultados e Discussão

Foram 14% mais homens do que mulheres nesta coorte (Tabela 1) . Maioria dos casos e controles estavam dentro da faixa etária de 61-80. Cerca de 2/3 dos casos tinham cancro do cólon ao início (Dukes A e B) e avançados (Dukes C e D) as fases do CRC foram quase igualmente representados. A maioria dos casos de CRC foram moderadamente diferenciado. As características clínico-patológicas dos casos eram representativas dos pacientes Singapore CRC.

Três regiões candidatas têm ou não iSNPs na plataforma Affymetrix SNP6 (14q22 e 19q13.1) ou os genótipos de rs4925386 ISNP (20q13. 33) agrupado mal. Todas as três regiões não têm sSNPs com alto LD (r

2≥0.8) dentro de 100 kb dos iSNPs, como exemplificado pelo enredo LD do cromossomo 19q13.1 (Figura 1A). Assim, é improvável que essas regiões candidatas abrigar qualquer SNP que poderiam marcar variante causal associado com o risco CRC no SCH.

O único SNP fora do onze interrogado que foi significativamente associada com o risco de CRC no SCH foi rs3087967 SSNP em 11q23.1 (Figura 1B), possivelmente devido às frequências mais altas menores alélicas (MAF) e o tamanho do efeito relativamente mais elevada (Tabela 2). Ao contrário dos estudos GWAS em caucasianos e japoneses [11], [12], não encontramos essa variante em 11q23.1 a ser associado com maior risco de doença no reto (OR = 1,20, 95% CI 1,02-1,42) em comparação com cólon (OR = 1,22, 95% CI 1,06-1,41) (Tabela S1). Nós, no entanto, encontrou rs3087967 a ser associado com maior risco CRC em homens (OR = 1,34, 95% CI 1,14-1,58; p = 0,0005) em comparação com as mulheres (OR = 1,07, 95% CI: 0,88-1,29; p = 0,4954 ), o que implica, portanto, um papel específico do género, que não foi previamente relatada. É interessante notar, no entanto, que rs3802842 ISNP em 11q23.1 foi replicado no Norte da China, mas não o estudo chinês Hong Kong [5], [6]. Não está claro por que isso assim, mas os chineses de Hong Kong da amostra poderia ser uma mistura de trabalhadores migrantes de toda a China, como Hong Kong é uma cidade cosmopolita.

Cinco SNPs, rs6687758, rs11986063 ,, rs6983267, rs2059254, e rs7226855 em 1q41, 8q23.3, 8q24.21, 16q22.1 e 18q21.1, respectivamente, mostram tendência de associação (0,0031 p 0,1) com CRC no SCH, mas não atingiram significância estatística provavelmente devido ao tamanho da amostra insuficiente e, portanto, potência (Tabela 2). O MAF para estes 5 SNPs também foram menores do que o CEU embora os tamanhos de efeito foram comparáveis.

O ISNP, rs6983267, no 8q24.21 foi o primeiro loci suscetível a ser identificado nos caucasianos [13], [ ,,,0],14]. Foi também o ISNP mais freqüentemente replicado em várias populações diferentes [5], [11], [15] – [17]. Curiosamente, rs6983267 foi relatado para ser significativamente associada com o risco de CRC em ambos os japoneses e norte chinês em um modelo recessivo apenas [5], [15]. Encontramos rs6983267 ter tamanho maior efeito usando um modelo dominante em vez de SCH (OR = 1,38; IC 1,13-1,69 95%). Não está claro por que isso acontece, mas os japoneses foram encontrados para ser geneticamente mais perto do norte chineses han do Sul Han [8] chinês. O estudo Hong Kong, no entanto, não encontrou rs6983267 mas outro SNP, rs7014346, no 8q24.21 ter evidências de associação com o risco de CRC [6].

Além disso, rs827401 SSNP em 10p14 foi associada com a diminuição do câncer risco no reto (OR = 0,74, 95% CI 0,63-0,88; p = 0,0006), mas não de cólon (OR = 1,02, 95% CI 0,89-1,18; p = 0,7466) em SCH (Tabela S1), apoiando assim os resultados anteriores em do Cáucaso e do Norte chinês [5], [18]. Um estudo recente relatou que o ISNP em 10p14 estava associada com um risco reduzido de recorrência [19]. Nós, no entanto, não foram capazes de replicar isso com rs827401 SSNP nos nossos pacientes com câncer retal. A análise de Kaplan-Meier revelou que o genótipo não foi significativamente associada à sobrevida livre de recidiva seja em todos os pacientes ou pacientes estratificados por quimioterapia. Os pacientes com o alelo protetor (AB /BB) tem razão de risco de 0,91 (IC 95% 0,69-1,20, p = 0,50) com AA como referência.

Notavelmente, rs7136702 iSNPs (12q13.13) e rs4779584 ( 15q13.3) e rs12638862 sSNPs (3q26.2) e rs5005940 (20p12.3) não mostraram qualquer evidência de ser associado com o risco CRC no SCH (Tabela 2; OR ~ 1; valor-p 0,1). O relatório sobre Northern chinês encontrou rs961253 em 20p12.3 a ser significativamente associada com o risco CRC (OR = 1,38; IC 95% 1,19-1,60; p = 0,00002) [5]. Nós não poderiam replicar este achado com rs5005940 SSNP (OR = 1,00; IC 95% 0,79-1,28; p = 0,976), embora a estrutura LD no SCH é semelhante, embora não idêntico às amostras HapMap HBC (Figura 1C e 1D), sugerindo que existe heterogeneidade genética entre o norte e sul da China. Da mesma forma, rs4779584 em 15q13.13, com o alelo de risco sendo a maior alelo nas Chinês (Tabela 2), foi replicada em que os chineses de Hong Kong, mas não o Northern chinês e SCH [5], [6].

em resumo, apenas iSNPs ou sSNPs em 1q41, 8q23.3, 8q24.21, 11q23.1, 16q22.1 e 18q21.1 mostraram evidências de associação com a CRC no SCH (Tabela 2). rs827401 em 10p14 foi associado com um risco aumentado em apenas câncer retal. Além disso, em contraste com os resultados de um estudo recente [19], a região 10p14 não foi associada com o prognóstico da doença em nossa série. Susceptibilidade loci de outros sete regiões candidatas, 3q26.1, 12q13.13, 14q22, 15q13.3, 19q13.1, 20p12.3 e 20q13.3 não mostraram nenhuma evidência de ser associado com a doença. Vale ressaltar que todos os quatro BMP loci,

BMP4

(14q22),

GREM1

(15q13.3),

BMP2

(20p12.3) e

LAMA 5

(20q13.33), os genes da via BMP destacou em um estudo recente [3], não replicar em SCH. Cromossoma 15q13.3 foi implicado a abrigar o

CRAC1 /HMPS

locus Ashkenazi pacientes judeus síndrome de polipose mista hereditária (HMPS) [20]. Anteriormente mostrou que a doença em pacientes Singapura chinês HMPS não estava ligado a 15q13.3, e identificado

BMPR1A

em 10q23 ser o gene que causa a doença [21]. Estes resultados anteriores indicam que a heterogeneidade genética pode dar origem a fenótipos clínicos semelhantes em diferentes populações.

Dos quatorze variantes CEU-identificados para CRC, apenas SNPs em 8q24.21, 10p14, 11q23.1 e 18q21.2 foram replicadas em pelo menos duas das três populações chinesas, o que sugere que as variantes funcionais destas regiões pode ser importante para a tumorigénese colorectal entre diversas populações (Tabela 3). Entre as quatro SNPs, única rs4939827 em 18q21.1 parecem codificar um gene, SMAD 7, na via de sinalização de TGF Â, uma via importante em tumorigénese colorrectal [22]. Os outros três SNPs estão em desertos de genes. As evidências acumuladas indicam que rs6983267 em 8q24.1 fica dentro de uma gama de comprimento intensificador de regular a expressão de C-MYC, um oncogene mais do que 300 kb a jusante pela ligação ao factor de células T 4 (TCF4) e aumentando sinalização Wnt [23] – [25] . relatório recente indicou, no entanto, que não é nem perda somática do alelo de risco nem possíveis elementos potenciadores funcionais na região do LD em 10p14 e 11q23.1 [26], o que implica, portanto, que outros mecanismos desconhecidos podem ser responsáveis ​​para a associação.

Além disso, a região 8q23.3 abrigar o

EIF3H

e

UTP23

genes poderia ser região de risco potencialmente importante para os chineses, assim, como SSNP rs11986063 foi replicado com o maior tamanho do efeito na SCH. A região 8q23.3 não foi interrogado nos outros dois estudos chineses, devido à falta de polimorfismo no rs16892766 ISNP. Pittman et al mostrou que SNP rs16888589 em 8q23.3 promotor ligamento EIF3H e reprimido a sua transcrição [27]. Uma análise da expressão eQTL posterior indicada no entanto, que a expressão de UTP23, em vez do que a de EIF3H, estava correlacionada com o alelo de risco de rs16888589 em 8q23.3. Os autores sugeriram que ambos os genes poderiam ser funcionalmente coordenada [2].

Nem todas as variantes CEU-identificados foram replicadas nas chinês. A disparidade pode ser devido a diferenças nas freqüências alélicas e estruturas LD ou diferenças genéticas reais. Uma vez que os tamanhos de efeito dessas variantes são relativamente pequenos e um estudo recente estimou que pelo menos 60 variantes comuns contribuem para CRC risco [28], os resultados implicam que outras variantes que contribuem para a predisposição para CRC permaneceu a ser identificado.

Informações de Apoio

Figura S1.

PCA lotes para PC1 vs PC2 e PC3 PC2 vs.

doi: 10.1371 /journal.pone.0042407.s001

(DOC)

Métodos S1.

Extração de DNA a partir de buffy coat e mucosa normal.

doi: 10.1371 /journal.pone.0042407.s002

(DOC)

Tabela S1.

Associação de SNPs risco com local do tumor.

doi: 10.1371 /journal.pone.0042407.s003

(DOC)

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Michelle Tan, do Departamento de Investigação Clínica, SGH e Ms . Wei Lin Goh, do Departamento de Cirurgia Colorretal, SGH para assistência técnica.