Sumário

Este estudo foi realizado para avaliar a relevância prognóstica de aberrações cromossômicas no cromossoma 4q em pacientes com NSCLC. Nós já identificou alterações no número de cópias no 4T12-q32 a ser significativamente associada com a disseminação hematogênica precoce do câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), e agora visam diminuir potenciais hot-spots dentro desta 107 Mb região que abrange. Usando oito marcadores microssatélites na posição 4q12-35, desequilíbrio de alelos (AI) foram realizadas em uma coorte do estudo preliminar (

n =

86). Posições indicando associações clínicas e prognósticos na AI análises foram posteriormente validado em uma coorte do estudo maior, usando fluorescência

in situ

fluorescente (FISH) em 209 pacientes com NSCLC. As perdas nas posições 4q21.23 e 4q22.1 foram mostrados para ser associado com características clinicopatológicas avançadas, bem como com a doença encurtado livre (DFS) e sobrevida global (OS) (DFS:

P = 0,019

; OS:

P =

0,002). A análise multivariada identificou as perdas de 4q21.23-22.1 ser um marcador independente de prognóstico tanto para DFS e OS em NSCLC (HR 1,64-2,20, todo

P

0,04), e, especialmente no cancro do pulmão de células escamosas (

P

0,05). Um estudo relata o caso de um paciente com câncer de pulmão revelou ainda uma perda de 4q21.23 nas células tumorais disseminadas (CDT). Nem os ganhos nas últimas posições, nem as aberrações cromossômicas no 4T12, 4q31.2 e 4q35.1, indicou uma importância prognóstica. Em conclusão, os nossos dados indicam que a perda de 4q21.23-22.1 em NSCLC é de relevância prognóstico em pacientes com NSCLC e, portanto, inclui potenciais novos genes supressores de tumor com relevância clínica

Citation:. Uzunoglu FG, Dethlefsen E, Um Hanssen, Wrage H, L Deutsch, Harms Effenberger-K, et ai. (2014) Perda de 4q21.23-22.1 é um marcador de prognóstico para a doença Livre e da sobrevivência global nos Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (12): e113315. doi: 10.1371 /journal.pone.0113315

editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Março, 2014; Aceito: 26 de outubro de 2014; Publicação: 11 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Uzunoglu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Hamburger Krebsgesellschaft e.V., Hamburgo, Alemanha. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

instabilidade genômica é uma das marcas principais de câncer [1]. Numerosos estudos em instabilidade genómica no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) puseram em evidência padrões específicos supressão para ambos os tumores metastáticos e primários [2] – [4]. aberrações no número de cópias em NSCLC podem ser encontrados em várias regiões, algumas sendo específico para o subtipo histológico, e algumas sendo dependente da gravidade das alterações histopatológicas (por exemplo, fase de tumor ou peneiração) [5] – [11] Por outro lado, a ocorrência de cópia Número alterações tem mostrado ser um evento precoce na patogénese do cancro do pulmão. Isto pode ser encontrado em combinação com um padrão sequencial de perda de heterozigosidade (LOH), que começa com a perda alélica no cromossoma 8p, seguida de 3p e 9p deleções [7], [12], [13].

p> Nós mostramos anteriormente que a disseminação hemática precoce de células tumorais é accionado por um padrão específico de modificações genómicas. Em adição a este padrão, um grande deleção do cromossoma 4q12-q32 ( 107 Mbp) indica uma forte associação com a presença de células tumorais disseminadas (DTC) na medula óssea, bem como metástases cerebrais de doentes com cancro do pulmão [14] . No entanto, a relevância prognóstico de esta região não foi ainda investigado. O objetivo deste estudo foi o de diminuir as regiões hotspot relevantes e investigar o seu impacto prognóstico em NSCLC. Além disso, procurou-se analisar se essa perda também pode ser detectado em CDT de um paciente NSCLC.

Para este fim, realizada pela primeira vez desequilíbrio alélicas (AI /LOH) analisa em uma coorte estudo preliminar (

n =

86). Para mais verificação, foi realizada uma fluorescência

in situ

hibridação análise (FISH) de 209 pacientes com NSCLC. Uma perda dentro de um menos de 4 MB-abrangendo a região em 4q21.23-4q22.1 foi identificado como um marcador negativo significativo prognóstico para a doença livre, bem como a sobrevida global em NSCLC. Além disso, foi realizada imunof luorescência consecutivo (SE) e FISH análises sobre a CDT de um único paciente NSCLC, mostrando uma perda de 4q21.23 no tumor primário. A mesma perda também pode ser detectado no CDT.

Materiais e Métodos

Amostras

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da câmara de médicos, Hamburgo, Alemanha . consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. Toda a investigação clínica tem sido conduzido de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Todas as amostras de tumor foram obtidos durante a ressecção cirúrgica da Universidade Medical Centre Hamburg-Eppendorf ou departamentos cirúrgicos associados. dados clínico-patológicos foram extraídos de um banco de dados em perspectiva, e dados de acompanhamento foram obtidos por meio de entrevistas com o clínico geral ou o paciente no ambulatório.

Para o desequilíbrio alélicas (AI) analisa a 4T, 86 tratados cirurgicamente pacientes com NSCLC primária com carcinoma combinado disponível e DNA genômico saudáveis ​​foram avaliados para a inclusão. A idade média da coorte do estudo foi de 65,9 anos, com uma proporção masculina predominante (65,1% versus 34,9%). No que respeita aos tipos de células de câncer de pulmão, 37 pacientes (43,0%) tinha um carcinoma de células escamosas (SqCC) e 49 (57,0%) de um adenocarcinoma (AC). A mediana do tempo de seguimento foi de 21,4 meses (2-60). Mais detalhes são apresentados na Tabela S1.

Para aberrações no número de cópias de DNA (FISH) no 4T, um tissue microarray (TMA), que consiste em 209 pacientes com câncer de pulmão primário avaliáveis, foi usado, com uma idade média de 62,3 anos no momento da cirurgia. distribuições de género foram comparáveis ​​aos do estudo de coorte AI, com uma predominância similar de pacientes do sexo masculino (68,4%). A coorte do estudo FISH abrangeu 88 (42,1%) pacientes com SqCCs, 78 (37,1%) com ACs, 34 (16,3%) com carcinoma do pulmão de células grandes, e nove pacientes (4,5%) com câncer neuroendócrino de pulmão. A mediana do tempo de seguimento foi de 24,7 meses (2.5-60). Mais detalhes são apresentados na Tabela S1.

Todos os pacientes foram reclassificados de acordo com a sétima edição da classificação TNM dos tumores malignos [15]. No que diz respeito à administração da terapia adjuvante, os seguintes especificado critérios foram aplicados desde 2004: pacientes ≥ fase II recebeu quimioterapia adjuvante com cisplatina e Vinorelbina. Encenadas Ib pacientes foram avaliados para a terapia adjuvante se o tumor era 4 cm ou em pacientes com invasão na veia (V +) ou a invasão de vasos linfáticos em (G +). A quimioterapia adjuvante, seguida por radiação (50-60 Gy) foi discutido para ≥ Stage III. As características dos pacientes para ambos os grupos de estudo estão apresentados na Tabela S1.

isolamento do DNA

O ADN genómico de carcinoma de correspondência (fresco congelado) e tecido pulmonar não-maligna patologicamente-verificados ou leucócitos de sangue periférico, feita antes da cirurgia foi extraída e purificada de acordo com o protocolo do fabricante utilizando o kit de tecido QIAamp (Qiagen, Hilden, Alemanha) ou InnuPREP ADN Microkit (AnalytikJena, Jena, Alemanha). Se necessário, microdissecação manual foi realizada, de modo a obter um teor de célula de tumor de pelo menos 70%. concentração de ADN foi determinada por NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Wilmington, DE) e as amostras foram diluídas para 10 ng /mL e armazenado a -20 ° C até à sua utilização.

Allelic análise de desequilíbrio

baseada em nosso estudo anterior, quatro regiões hotspot representadas em posições 4T12, 4q21.23, 4q31.2 e 4q35.1 foram escolhidos para análise posterior [14]. Para cada região, dois marcadores microssatélites foram utilizados para avaliar a frequência e relevância clínica da AI (ver Tabela S2, para obter detalhes de todos os marcadores microssatélites). iniciadores directos foram marcadas com um corante fluorescente (6-FAM) por electroforese capilar subsequente. Os PCRs foram realizados numa mistura reaccional de 10 ul que consiste em 10 ng de molde de ADN, 2,5 mM de desoxirribonucleótido mistura trifosfato (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha), 2,5 pmol de sentido e anti-iniciador (MWG, Ebersberg, Alemanha), 0,25 U de AmpliTaq Gold polimerase ( Applied Biosystems) e 5 mL de água livre de nuclease. As condições de PCR consistiram em repetidos ciclos a 95 ° C, 60 ° C-62 ° C e 72 ° C durante 30 s. Para a determinação do AI, electroforese capilar com um ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Freiburg, Alemanha), utilizando uma mistura de 40 ml de formamida (Oi-DI), 0,2 ul Genescan-500-ROX padrão, bem como 0,1 ul de PCR produto e desnaturação a 94 ° C durante 2 min e foi realizado o comprimento de fragmentos de alelos e intensidade de fluorescência foi avaliada. Os alelos foram definidos como os dois maiores picos dentro do intervalo de tamanho esperado e uma proporção de ≥1.5 entre as alturas dos picos do tumor e alelos normais foram pontuados como AI. Para garantia da qualidade geral, 10% das amostras utilizadas foram usadas aleatoriamente para análises repetidas. A concordância do estado alélicas foi . 99%

fluorescência

in situ

fluorescente (FISH) análise

análise cópia de DNA perda de número de duas regiões hot-spot com base em o AI análises foi avaliada em uma população estudo maior por fluorescência

in situ

fluorescente (FISH). Três sondas BAC diferentes visando a regiões 2 (RP11-570L13: 4q21.23 e RP11-1053C2: 4q22.1) e 3 (RP11-634D8: 4q31.2) foram hibridizados em uma TMA. As sondas BAC utilizados foram obtidos a partir Fonte BioScience LifeSciences (Nottingham, Reino Unido). Um? G de cada sonda BAC foi marcado por iniciação aleatória (BioPrime Labeling Sistema, Invitrogen) com fluorescente etiquetado dUTPs (RP11-570L13 e RP11-634D8: Laranja Spectrum, RP11-1053C2: Espectro Verde; Enzo Life Sciences, Abbott). Como referência, uma sonda centrômero (CEP 10, SpectrumAqua) foi empregado (Enzo Life Sciences, Abbott). A fim de controlar a qualidade e especificidade das sondas BAC fluorescentemente marcado, o peixe foi testado pela primeira vez em diferenciais de cromossomas em metafase. Em seguida, os protocolos para os slides de parafina foram estabelecidos para cada sonda BAC separadamente. Em primeiro lugar, as lâminas foram incubadas a 60 ° C durante uma hora antes de eles foram desparafinados em xileno e hidratados de uma série de etanol. A fixação foi conseguida colocando os diapositivos numa solução de 2% de formaldeído e metanol a -20 ° C, seguido de enxaguamento das mesmas em solução salina tamponada com fosfato (PBS 1x) e pré-tratamento com uma solução de pré-tratamento (Invitrogen) a 90 ° C durante 10 min. Após lavagem em PBS, as lâminas foram tratadas com uma pré-aquecido enzima-reagente (Invitrogen) a 37 ° C durante 10 min. Mais uma vez, estas foram lavadas em PBS e, em seguida, desidratadas em séries de etanol. Finalmente, as lâminas foram desnaturadas a 85 ° C durante 5 min, antes de serem incubados com as misturas de hibridação com sonda a 37 ° C durante a noite. lavagem pós-hibridação foi então realizada em 2 x SSC, 0,3% de tampão NP-40 a 70 ° C e a temperatura ambiente, seguido por um segundo hidratação numa série de etanol. solução DAPI foi aplicado para a detecção de células tumorais que não se sobrepõem morfologicamente intactas. Em média, os sinais fluorescentes de 32 células tumorais para cada sonda foram contadas (intervalo 11-57). A fim de avaliar a polarização experimental, bem como para definir os pontos de corte de a relação sinal-para-centrómero, os sinais de hibridação de 10 amostras de controlo normais (também localizados no TMA) foram contadas. Correspondentemente, um rácio 1,5 foi definida como uma célula transportando um DNA de ganho, enquanto que uma relação 0,75 foi definida como uma perda

consecutiva imunofluorescência e FISH análise

Para a. isolamento dos DTC, as células mononucleares a partir de aspirados de medula óssea de doentes com NSCLC foram isolados por centrifugação em gradiente de FICOLL. As células foram então cito-centrifugadas em lâminas de vidro. Para detectar o DTC, uma coloração imunocitoquímica foi realizada de acordo com o método APAAP (fosfatase alcalina anti fosfatase alcalina), utilizando um anticorpo contra citoqueratinas (A45-B /B3, MICROMET, Martinsried, Alemanha) [16]. Um anticorpo do mesmo isotipo monoclonal de murino (MOPC 21, IgG1; Sigma-Aldrich) serviu como controlo negativo. pacientes positivos DTC foram utilizados para analisar a perda de 4q22.1 por análise de FISH. FISH foi realizada sobre as células de tumor que foram detectadas previamente por se a coloração com um anticorpo marcado com Cy3 anti-citoqueratina (A45-Cy3; MICROMET). Para fixação das células, foi usada solução B (Micromet). Após um passo de lavagem PBS, os sítios de ligação não específicos foram bloqueados com 10% de soro AB (Biotest AG, Dreieich, Alemanha). Outra lavagem de PBS foi seguido por 45 min A54-Cy3 tratamento com o anticorpo (1:300). As células foram novamente lavadas e DAPI (CellSearch) foi aplicada para a coloração nuclear. DTCs foram identificados de forma automatizada (Ariol digitalização, Leica Biosystems, Nussloch, Alemanha) e localizada com a Inglaterra Finder for re-identificação. Para a análise de FISH consecutivas, as células foram lavadas com PBS e incubadas durante 7 minutos num pré-aquecido proteinase K (0,1 ug /ml) solução de (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, 0,2% ad CaCl2xH2O 50 ml de água destilada.). Em seguida, as células foram desidratadas numa série de etanol e desnaturados durante 5 minutos a 75 ° C (70% de formamida, 0,6 x SSC, pH 7,4). As células foram novamente desidratada e misturas de hibridação de sonda foram desnaturadas durante 5 min a 75 ° C. A hibridação foi realizada durante a noite a 37 ° C. lavagem pós-hibridação foi realizada em formamida a 50% /SSC 2x, em 2x SSC e em 0,1 x SSC a 45 ° C. Depois de aplicar DAPI, os DTCs foram realocados e os sinais fluorescentes de centrômero 3 e sondas RP11-1053C2 foram contados. Uma razão de 0,75 foi definida como uma perda

A análise estatística

Para a análise estatística, SPSS 21.0 para MAC (SPSS Inc., Chicago, IL) foi utilizada.. Correlação entre o número mudanças AI /cópia e os parâmetros clínico foram avaliadas pelo teste do qui-quadrado. A sobrevida global (OS) foi calculado como o período compreendido entre a data da cirurgia, quer a data da morte ou último follow-up, o que ocorrer primeiro no prazo de 60 meses. A sobrevida livre de doença (DFS) foi definido como o período compreendido entre a data da cirurgia até a data de recorrência ou de morte relacionada com o tumor, o que ocorrer primeiro no prazo de 60 meses. Pacientes vivos sem recorrência na última data de seguimento ou após 60 meses foram censurados. A mortalidade hospitalar (no prazo de 60 dias) levou à exclusão da análise de sobrevivência. A sobrevivência foi analisada por meio do teste de log-rank e plotados utilizando o método de Kaplan-Meier. Se não for especificado de outro modo, os resultados são apresentados como a sobrevivência mediana em meses, com intervalo de confiança de 95% (IC 95%). Para uma análise multivariada, modelo de risco de regressão de Cox foi utilizado para avaliar o valor prognóstico da AI /copiar alterações numéricas. Os resultados são apresentados como taxa de risco (HR) e IC 95%. declarações significativas referem-se a valores de P de testes bicaudais. 0,05

Resultados

microssatélites análise

O estudo de coorte utilizado para a análise de microssatélites consistiu de um total de carcinoma de 86 combinados e amostras de tecido normal de pacientes com câncer de pulmão que se submeteram à cirurgia. Uma análise de microssatélites foi realizada em um total de quatro regiões no cromossomo 4q, utilizando dois marcadores polimórficos para cada região. marcadores alélicas próximos uns dos outros revelaram freqüências altamente semelhantes de exclusão que levam a perda final de frequências heterozigosidade de 18,6% (

n =

16) na região 1; 23,3% (

n =

20) na região 2; 25,6% (

n =

22) na região 3 e 34,9% (

n =

30) na região 4. A taxa de casos não informativas variou de 16,3% a 36,0%, dependendo no marcador. O uso de dois marcadores para a detecção de AI em cada região, os casos não informativas poderia ser reduzida a intervalos de 2,3% para 15,1%. Regiões 1 e 3 tiveram resultados concordantes (Normal /prejuízo), enquanto que a região 2 continha três resultados disconcordant e região 4 continha um de cada. Todos os resultados foram disconcordant repetido e os resultados permaneceram idênticos, indicando um possível ponto de interrupção entre os marcadores. No total, 45,3% (

n =

39) revelou pelo menos uma perda de alelos dentro das regiões analisadas. Dentro desses pacientes, 17,9% (

n =

7) revelou uma perda em todas as regiões. resultados numéricos detalhados são apresentados no quadro 1 e S1 Figura, informação de apoio.

AI no cromossoma 4q e as características clinicopatológicas

Não havia nenhuma evidência de uma correlação estatística significativa entre AI com clínico-patológico características nas quatro regiões investigadas. No entanto, 83,3% (

n =

15) de pacientes com AI na região 2 desenvolveram uma recaída em contraste com 16,7% (

n =

3) sem AI (P = 0,073).

AI no cromossoma 4q como um marcador de prognóstico para a sobrevivência

em análises de sobrevida univariada, uma tendência para a livre (DFS) e sobrevida global mediana da doença mais curto (OS) em pacientes com AI na região 1 e 2 foi evidente (diferença de sobrevida mediana de 11,9 meses para 14 meses; detalhes são dados em S3 Tabela). No entanto, as diferenças não atingiram significância estatística (P 0,05). Uma vez que o estudo de coorte para a sobrevivência análises foi limitada a 68-77 casos, incluindo pacientes estágio IV UICC, bem como pacientes com margens cirúrgicas positivas, efeitos sobre a análise de sobrevivência de confusão foram de se esperar. Isso ficou evidente para a região 2. Portanto, após estratificação por idade, sexo, estágio do tumor, e os parâmetros de margens de ressecção, a presença de AI na região 2 foi provado ser um marcador prognóstico independente para DFS (HR 3,82,

P =

0,044). Uma tendência semelhante não significativa foi visto também para OS (HR 3,56,

P =

0,072). Um estágio do tumor UICC ≥ III foi o marcador de prognóstico negativo mais forte e só adicional para DFS e OS, com HR 4,22 (

P =

0,007) e HR 2,87 (P = 0,047), respectivamente (S4 Tabela).

análise do número de cópias FISH

com base nos resultados allelotyping relatados, procuramos verificar estes resultados em uma população maior estudo por análise de FISH. Duas sondas BAC diferentes, uma que hibrida com a região 2 e uma região que hibrida a 3 foram estabelecidas (S5 Tabela).

Para a região 4q21.23 detectado por RP11-570L13, uma perda de ADN foi observada em 24,9% (

N =

52) e um ganho de ADN em 4,3% (

n =

9) das amostras analisadas. Uma perda detectado nesta posição revelou uma correlação significativa dependente do tipo histológico, com 38,0% (

n =

30) perda de SqCC em contraste com 22,7% (

n =

15,

P = 0,049

) em AC. A análise com RP11-1053C2 sonda revelou perda de 30,6% e ganho de 7,2% (

n =

15), mais uma vez revelando uma taxa significativamente mais frequente perda de SqCC (44,6%,

n =

33) em relação ao AC (23,3%,

n =

17,

P =

0,022).

Usando RP11-634D8 sonda (região 3), a taxa de análise bem sucedida foi de 71,6% (

n =

204). Uma perda do número de cópias de ADN foi detectado em 36,8% (

n =

77) e um ganho de 7,7% (

n =

16) das amostras analisáveis.

Copiar perda de número no cromossoma 4q e as características clinicopatológicas

Copiar perda número na posição 4q21.23 (RP11-570L13) mostrou uma correlação significativa com o tamanho do tumor avançado (

P =

0,005), mas sem outras características patológicas. número de cópias a perda na posição 4q22.1 (RP11-1053C2) revelaram uma associação significativa com a presença de metástases linfáticas (perda pN0: 25,2%,

n =

26 contra perda ≥pN1: 44,0%,

n =

37;

P =

0,005), bem como estágio avançado UICC (perda UICC I: 25,3%,

n =

23 contra perda UICC ≥II: 41,4%,

n =

41;

P =

0,032). número de cópias a perda na posição 4q31.2 (RP11-634D8) mostrou uma correlação significativa com o tamanho do tumor avançado (

P =

0,019). No entanto, há mais correlações com características clinicopatológicas foram evidentes (S5 Tabela).

Copiar perda número no cromossoma 4q como um marcador de prognóstico para a sobrevivência

No contexto de uma análise univariada, copie perda de número na posição 4q21.23 (RP11-570L13) revelou uma tendência não significativa para menor DFS mediana (12,5 meses versus 28,0 meses,

P =

0,056). análises de subgrupos, no entanto, mostrou uma forte correlação com o DFS em SqCC subgrupo (11,2 meses versus 39,1 meses, P = 0,031; Fig. 1, S6 Tabela). Um efeito similar no OS foi relatado para toda a coorte do estudo (23,9 meses contra 42,6 meses,

P =

0,033) e SqCC subgrupo (12,5 meses versus 41 meses,

P = 0,031

, figo . 2, S6 Table)

a:. Copiar perda número na posição 4q21.23 (RP11-570L13) revelou uma tendência para menor sobrevida livre de doença mediana (DFS) na análise univariada (12,5 meses versus 28,0 meses,

P =

0,056). B: Copiar perda número na posição 4q21.23 (RP11-570L13) no carcinoma de células escamosas (SqCC) subgrupo mostraram fortes correlações com menor DFS (11,2 meses versus 39,1 meses)

P = 0,031

. C: Cópia perda número na posição 4q22.1 (RP11-1053C2) mostrou correlações significativas com menor DFS (12,5 meses versus 32,7 meses),

P = 0,010

. D: Copiar perda número na posição 4q22.1 (RP11-1053C2) mostrou correlações significativas com DFS mais curtos em SqCC subgrupo (11,7 meses versus 35,5 meses),

P = 0,027

. parcelas de sobrevivência para as aberrações de ganho foram desapareceu por uma questão de clareza

A:. Copiar perda número na posição 4q21.23 (RP11-570L13) revelou uma forte correlação com menor sobrevida global mediana (OS) em análise univariada (23,9 meses versus 42,6 meses),

P = 0,033

. B: Copiar perda número na posição 4q21.23 (RP11-570L13) no carcinoma de células escamosas (SqCC) subgrupo mostraram fortes correlações com menor OS (12,5 meses versus 41 meses),

P = 0,031

C: Cópia perda de número na posição 4q22.1 (RP11-1053C2) mostrou correlações significativas com menor DFS (25,8 meses versus 40,3 meses),

P = 0,012

. D: Copiar perda número na posição 4q22.1 (RP11-1053C2) mostrou correlações significativas com DFS mais curtos em subgrupo adenocarcinoma (10,0 meses versus 43,1 meses),

P = 0,035

. parcelas de sobrevivência para as aberrações de ganho foram desapareceu por uma questão de clareza.

Copiar perda número na posição 4q22.1 (RP11-1053C2) mostrou correlações significativas com menor DFS mediano dentro de toda a coorte do estudo, bem como dentro do subgrupo SqCC (12,5 meses contra 32,7 meses,

P = 0,010

e 11,7 meses contra 35,5 meses,

P = 0,027

; Fig. 1, S6 Tabela). Além disso, uma perda de 4q22.1 foi associado com menor OS dentro de toda a coorte de estudo, o subgrupo AC, enquanto que nenhuma correlação foi observada no subgrupo SqCC (estudo de coorte inteira: 25,8 meses versus 40,3 meses,

P =

0,012; AC subgrupo: 10,0 meses versus 43,1 meses,

P = 0,035

, figo 2, S6 Table)

por outro lado, no número de cópias ganhos não revelou uma correlação com a sobrevivência no.. qualquer das posições analisadas. Em linha com os resultados do estudo de coorte AI, copiar perda número em região 3 (RP11-634D8, posição 4q31.2) não teve impacto na sobrevida (S6 Tabela).

A análise multivariada cópia identificada perda número em posição 4q21.23 (RP11-570L13) como um marcador negativo prognóstico para DFS e oS para toda a coorte do estudo (cox modelo de risco proporcional, estratificada por idade, sexo, desembaraço margem, classificação e fase UICC; DFS: HR 1,77 (1.10- 2,84 95% CI),

P = 0,019

; SO: HR 2,20 (IC de 95% 1,33-3,64),

P =

0,002, tabela 2), bem como para o subgrupo SqCC ( DFS: HR 2,85 (1,35-6,04 IC 95%),

P = 0,006

; OS: HR 2,77 (1,26-6,13 IC 95%),

P = 0,012

, S7 Tabela). Resultados semelhantes foram observados para a cópia perda número na posição 4q22.1 relativas a todo o grupo de estudo (RP11-1053C2; DFS: HR 1,64 (CI 1,03-2,61 95%),

P = 0,038

; OS: 1,84 ( 1,12-3,01 IC 95%),

P = 0,015

, quadro 3), ao passo que análise de subgrupo não alcançou significância estatística (S8 tabela). Um segundo modelo de análise multivariada incluindo a administração da quimioterapia adjuvante foi realizada (informação disponível em 116 pacientes). Os resultados permaneceu significativa quando a administração da quimioterapia adjuvante foi incluído (dados não mostrados).

Em resumo, ambas as posições na região 2, ou seja, 4q21.23 (RP11-570L13) e 4q22 0,1 (RP11-1053C2), foram identificados como um marcador de prognóstico negativo para DFS, bem como SO dentro de toda a coorte do estudo. No entanto, somente a perda na posição 4q21.23 atingiu significância também no subgrupo SqCC. Um fluxograma resumindo a sobrevivência análises da coorte do estudo, o progresso do estudo e os resultados são dados em S2 e S3 Figuras.

Relato de caso de 4q21.23 perda de CDT

Com base em nossa mais cedo encontrando que 4q12-32 perda correlaciona com o estado DTC positiva, nós quisemos verificar se uma perda de esta região está também presente no CDT de um doente com perda 4q no tumor primário [14]. Uma perda de 4q22.1 foi detectada em 77% (17/22) dos pacientes CDT. A gama de sonda e de centrómero RP11-1053C2 3 sinais eram heterogéneos, variando de 1 a 5 sinais (média de 1,7 e 2,7 respectivamente). análise FISH foi também realizado em material de reincidência do tumor primário do pulmão e embebidos em parafina a partir do mesmo paciente (Fig. 3). Estes resultados revelou novamente uma perda de 4q22.1 e alto grau de heterogeneidade nas células individuais variando de 0-4 sinais no tumor primário e 0-5 em material de reincidência do tumor.

células da medula óssea do paciente foram imunocitoquimicamente coradas contra citoqueratina usando o método de APAAP. A DTC positivo (vermelho) e um leucócito negativo (marrom) são mostrados. B: células da medula óssea do paciente foram coradas fluorescente contra citoqueratina (sinal vermelho) seguida de análise FISH em C) com sonda RP11-1053C2 e sonda CEN3 (sonda RP11-1053C2: 1 sinal verde; sonda CEN3: 3 espectro sinais laranja ; coloração nuclear em DAPI). sonda Cen7 (Cen7 sonda: água espectro exibido na magenta pseudo-cor) foi além utilizado para análise FISH em D) tumor primário (2-5 laranja sinais /célula, 2-4 sinais magenta /celular e 0-2 sinais verdes /celular) e e) material de tumor recaída FFPE (3-6 laranja, 4-5 magenta e 1-3 sinais verdes /célula).

Discussão

Em um estudo anterior , fomos capazes de identificar cinco regiões cromossômicas que diferenciam pacientes com ou sem disseminação do tumor inicial. Perda da 4T12-Q32 mostrou a correlação mais forte com o status DTC positivo. Setenta e três genes nesta região foram encontrados para baixo regulado entre os doentes com NSCLC de medula óssea positiva, indicando uma provável presença de genes supressores de tumores dentro desta região [14]. Neste estudo, nós fomos capazes de diminuir a região alvo e identificar as perdas no número de cópias dentro de um menos de 4 MB-abrangendo a região no cromossomo 4q21.23-22.1 como marcadores prognósticos independentes para DFS, bem como OS em NSCLC. A presença de perdas de número de cópias dentro desta região foi associado com, pelo menos, 18 meses mais curto médio de sobrevivência, em comparação com pacientes com números de cópia normal. Além disso, a presença de perdas no número de cópias causou um aumento do risco de recorrência da doença e da morte variando de 1,6 até 2,9 no prazo de 60 meses de follow-up, independente de marcadores prognósticos estabelecidos para NSCLC (dependente do subtipo histológico e da posição de perda de número de cópias) . Além disso, em nosso estudo relato de caso, fomos capazes de demonstrar que a perda de 4q21.23 região cromossómica não só está presente tanto no tumor primário de pulmão e no tecido reincidência do tumor, mas também em uma grande fração das CDT muito heterogéneos. Isso enfatiza a importância desta região cromossómica para a disseminação do tumor. dissomia uniparental é um mecanismo de como a perda de heterozigotia em células pode originar [17]. Em NSCLC não temos conhecimento de estudos que indicam dissomia uniparental no 4T. Infelizmente não conseguimos realizar qualquer pesquisa específica sobre se o AI em nossas amostras foi devido a dissomia uniparental, como as amostras para análises AI e peixe não foram sobrepostas. Nós não fomos capazes de fazer qualquer declaração sobre se uma perda 4T ocorre mais frequentemente em um caso polysomic do cromossomo 4, como costumávamos centrômero 10 como referência. Em nosso artigo original descrevendo a associação entre a perda de 4T e estado DTC positiva foram investigados 30 pacientes com NSCLC por matriz CGH. Neste pequeno número de casos, não conseguimos encontrar qualquer correlação entre a perda de 4T e número total de aberrações cromossómicas [14], indicando que a perda de 4T é especificamente associada com o comportamento metastático, independente do nível de instabilidade cromossômica no tumor .

Perda de várias regiões porte no cromossoma 4q tem sido associada com menores taxas de sobrevivência em muitos tipos de cancro epitelial, incluindo o cancro colorectal, adenocarcinoma pancreático ductal, hepatoblastoma e carcinoma de células escamosas oral [3], [18] – [22]. Além disso, no NSCLC, as perdas de 4T têm sido associados com adenocarcinomas do pulmão metastático. No entanto, o tamanho e localização das deleções 4q varia entre os diferentes estudos [3], [18] – [22]

Para além da identificação da região alvo 4q em NSCLC e a sua relevância clínica potencial, a. dados indicam desvios específicos do subtipo histológico em termos de freqüências alélicas de perda e relevância prognóstica. A análise de subgrupos revelou uma taxa significativamente mais elevada de perda alélica em sondas SQCC em contraste com sondas de corrente alternada. Em linha com estas diferenças, a perda na 4q21.23 (com marcador RP11-570L13) dentro da região 2 foi identificado como um marcador de prognóstico negativo para DFS e OS dentro de toda a coorte do estudo NSCLC e, especialmente, o subgrupo SqCC. Esta região não foi encontrado para ser um marcador de prognóstico independente no subgrupo AC. As freqüências de perda de alelos observados histológicos específicos do subtipo com influência variável sobre a sobrevivência estão em linha com estudos anteriores relatam várias regiões cromossômicas diferenciadoras SqCC de AC, incluindo a perda mais comum de 4T em SqCC [5], [8] – [10], [23], [24]. Além disso, vários estudos têm indicado que estas alterações genômicas diferentes de AC e SqCC pode proporcionar oportunidades auspiciosos para terapias direcionadas prospectivos de pacientes com câncer de pulmão [11]. Como os LCLC e pulmão neuroendócrino subgrupos de câncer foram pequeno demais para análises de subgrupos, mais estudos são necessários para avaliar o impacto potencialmente desviar dos desequilíbrios alélicas no 4T sobre estes subtipos histológicos.

A nossa coorte estudo não incluiu pré-cancerosa lesões. Como consequência, ainda não está claro quando esses desequilíbrios alélicas cruciais ocorrer dentro do cronograma da patogênese do câncer de pulmão.