Humana

Abstract

Os tumores contêm uma pequena população de células-tronco cancerosas (CSC) propostas para ser responsável pela manutenção do tumor e recaída. Aldeído desidrogenase uma actividade (ALDH1) tem sido utilizado como um marcador funcional de células estaminais para isolar CSCs em diferentes tipos de cancro. Este estudo utilizou o ensaio Aldefluor® e análise de separação de células activadas por fluorescência (FACS) para isolar ALDH1

altas células de cinco linhas celulares de sarcoma humanos e uma linha celular cordoma primário. ALDH1

células de alta variam de 0,3% (MUG-Chor1) para 4,1% (SW-1353) de células fechadas. coloração imuno-histoquímica, análise da eficiência formação clone, e tecnologia de sensor de microeletrônica xCELLigence revelou que ALDH1

células de alta de todas as linhas de células de sarcoma têm um aumento da taxa de proliferação em comparação com ALDH1

células de baixa. Ao investigar de reguladores importantes da biologia das células estaminais, em tempo real de dados de RT-PCR mostraram um aumento da expressão de c-Myc, β-catenina, e SOX-2 no ALDH1

população elevada e um maior nível significativo de ABCG2. A análise estatística dos dados demonstraram que ALDH1

altas células do SW-982 e SW-1353 apresentaram maior resistência ao comumente usado agentes quimioterápicos como doxorrubicina, epirrubicina e cisplatina do que ALDH1

células de baixa. Este estudo demonstra que em diferentes linhas celulares de sarcoma, ALDH1 elevada actividade pode ser utilizado para identificar uma subpopulação de células caracterizadas por uma taxa de proliferação significativamente maior, o aumento da formação de colónias, expressão aumentada de genes transportadores de ABC e marcadores stemness em comparação com células de controlo. Além disso, a resistência aos medicamentos melhorada foi demonstrado

Citation:. Lohberger B, Rinner B, Stuendl N, Absenger M, Liegl-Atzwanger B, Walzer SM, et al. (2012) a aldeído desidrogenase 1, um potencial marcador de células-tronco cancerosas em Sarcoma Humano. PLoS ONE 7 (8): e43664. doi: 10.1371 /journal.pone.0043664

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |

Recebido: 19 Abril, 2012; Aceite: 23 de julho de 2012; Publicação: 23 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Lohberger et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro pela Universidade de Medicina de Graz (concessão START), concessão OeNB (# 14356) e Grant “EccoCell” é reconhecido agradecimento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a população celular da maioria dos tumores é heterogénea no que diz respeito à sua capacidade de proliferação e a capacidade de iniciar a formação de tumores em ratinhos imunodeficientes. Uma célula-tronco do cancro (CSC) é definida como uma célula dentro de um tumor que possui a capacidade de auto-renovação e de gerar linhagens de células cancerosas heterogéneas que compreendem o tumor [1], [2]. Numerosas investigações forneceram provas de que existem CSCs numa variedade de tumores humanos, tais como doenças malignas hematopoiéticas, tumores cerebrais, cancro da mama, e cancro Gastroenterological [3], [4], [5], [6].

aldeído desidrogenases citossólicos (ALDHS) são um grupo de enzimas envolvidas na oxidação de uma grande variedade de aldeídos intracelulares nos seus ácidos carboxílicos correspondentes [7]. Entre as enzimas teses, ALDH1 é passando por ter um papel importante na oxidação do álcool e de vitamina A e na quimiorresistência ciclofosfamida. Ginestier et ai. [8] mostrou que ALDH1 era um marcador de células-tronco mamárias humanas normais e malignas e um preditor de mau resultado clínico dos pacientes com câncer de mama. Uma elevada actividade ALDH1 foi usado para definir populações de células estaminais em muitos tipos de cancro incluindo o mieloma múltiplo humano, leucemia mielóide aguda [8], o cancro do pâncreas [9], e cancro da mama [10]. Por conseguinte, a actividade ALDH1 pode ser usado como um marcador comum para populações de células estaminais malignos [11]. A falha de quimioterapia de cancro pode ocorrer através de um aumento do efluxo de agentes quimioterapêuticos, que conduz à redução dos níveis de droga intracelular e consequente insensibilidade droga. transportadores ABC têm a capacidade para exportar muitas drogas citotóxicas e evidências recentes sugerem que o fenótipo de células estaminais do cancro está associado com a expressão de alto nível do transportador ABCG2 [12], [13], [14].

neste estudo, foi utilizado o ensaio Aldefluor® e análise de separação de células activadas por fluorescência (FACS) para isolar ALDH1

células de alta a partir de cinco linhas celulares de sarcoma humanos e uma linha celular cordoma recentemente estabelecida. Analisamos ALDH1

células de alta

in vitro Compra de sua capacidade de repovoamento, clonogenicidade, propriedades de proliferação celular, a expressão de marcadores de células-tronco e transportadores ABC, e as suas capacidades de resistência a múltiplas drogas.

Materiais e Métodos

Cultura celular

Todas as linhas de células de sarcoma humano (SW-684, SW-872, SW-982, SW-1353, e TE-671 foram obtidas a partir de CLS ( Eppelheim, Alemanha) e cultivadas em Dulbecco-meio de Eagle modificado (DMEM-F12) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e 0,25 ug de anfotericina B. CANECA células-Chor1 foram cultivadas em IMDM /RPMI 1649 (04:01) (PAA, Pasching, Austria) suplementado com 1% de L-glutamina e 1% de ITS (PAA). Todas as células de incubação foi realizada a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 e as culturas são periodicamente verificados por micoplasma. O meio de cultura e suplementos foram adquiridos a partir de Gibco®, Invitrogen (Darmstadt, Alemanha).

fluorescência em função da dispersão para a frente foi mostrado num blot densidade de (a ) deab células controle e (B) células que expressam ALDH1 (chamado ALDH1

alto). (C) a expressão ALDH1 em% de células fechadas. A maior proporção de ALDH1

células de alta é representado por SW-684 células (1,77 ± 0,9%; n = 12), SW-982 células (2,23 ± 1,0%; n = 11), e células SW-1353 (2,69 ± 1,3%, n = 8). (D) Depois de duas semanas cultivadas a ALDH1

populacional gerado um maior conta significativo de ALDH1

células de alta. (E) A atividade de ALDH aumentada também foi demonstrada por western blot.

Aldefluor® Ensaio e Separação do ALDH1

+ População celular por análise FACS

aldeído actividade da enzima desidrogenase (ALDH) de células viáveis ​​foi determinada utilizando um ensaio com base corante fluorogénico Aldefluor® (Stem Cell Technologies, Grenoble, França) de acordo com as instruções do fabricante. 1 × 10

6 /ml de células foram suspensos em tampão de ensaio contendo substrato Aldefluor® ALDH (Bodipy-aminoacetaldeído) e incubadas durante 45 min a 37 ° C. Como controlo de referência, as células foram suspensas em tampão contendo substrato Aldefluor® na presença de dietilaminobenzaldeído (DEAB), um inibidor da enzima ALDH1 específica. As células que expressam ALDH1 brilhantemente fluorescentes (ALDH1

alto) foram detectadas no canal de fluorescência verde (520-540 nm) de FACSAria (BD Biosciences, San Diego, CA) e os dados foram analisados ​​utilizando o software DIVA FACS (BD Biosciences ). Para excluir as células não viáveis ​​de iodeto de propídio. (PI; Sigma Aldrich, Viena, Áustria) foi adicionado a uma concentração final de 2 ug /ml

A análise imuno-histoquímica utilizando anticorpos anti-Ki-67 marcador de proliferação revelaram um nível de proliferação diminuíram de (a) SW-1353 ALDH1

células baixos e em comparação com (B) ALDH1

células de alta SW-1353. (C-E) curvas de proliferação dinâmicos para ALDH1

alto e ALDH1

células de baixa semeadas a 10.000 células por poço medido com o sistema xCELLigence.

Repovoamento Ensaio

para comparar a capacidade de repovoamento de sarcoma ALDH1

células de alta com ALDH1

células de baixa

in vitro

, as células recém-ordenados foram cultivadas separadamente sob as mesmas condições de cultura. Após 2 semanas, as células foram re-corados com o ensaio Aldefluor® e novamente analisadas através FACSAria (BD Biosciences).

(A) A quantificação da eficiência de formação de clones SW-684, SW-982, e SW -1353 células. Dados de cinco experimentos independentes representam média de contagem de colónia /bem depois de 14 dias. (B) unidades de formação de colónia representativas de todas as três linhas de células.

Análise Western Blot

Para análise das proteínas totais, as células foram re-suspensas em tampão de lise (50 mM de Tris-HCL pH 7,4, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, EDTA 1 mM, 10% de NP-40, 1% de Triton-X e inibidores da protease), incubadas em gelo durante 10 min e centrifugada a 15000 rpm durante 15 min. As aliquotas de extractos de proteína (20 ug) foram separadas em 12% SDS-PAGE e electro-transferidas para 0,45 um Hybond ECL membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido). A membrana foi bloqueada com tampão de bloqueio de leite 3% durante 1 h e, em seguida, incubadas com os anticorpos primários durante 2 h à temperatura ambiente. Como o anticorpo primário, anticorpo policlonal de coelho ALDH1 2 de anticorpo /(# sc50385; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foi usado. A principal isoforma do fígado ALDH1 localizada ao espaço citosólico, enquanto ALDH2 localizada nas mitocôndrias. As manchas foram reveladas utilizando rábano anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Dako, Viena, Áustria) à temperatura ambiente durante 1 h e a SuperSignal® West Pico quimioluminescente Substrato (Thermo Scientific, Rockford, IL), de acordo com o protocolo dos fabricantes.

o nível de expressão foi normalizado (ôc

T) para a expressão de ARNm de GAPDH, ACTB, e HPRT-N como um controlo interno e em comparação com o correspondente ôc

t (ΔΔC

t) nos controlos. Os níveis de expressão normalizados a partir de (A) c-Myc, (B) β-catenina, e (C) SOX-2 foram mostrados. (D) ABCG2 foi mais altamente expresso em ALDH1

alta do que em ALDH1

células de baixa, enquanto que os valores p para (E) ABCA2 não foram significativas. (F) ALDH1

células de alta SW-1353 também mostraram uma maior expressão significativa de ABCB1.

Imunohistoquímica

Cada 1 × 10

4 ALDH

alta e ALDH

células baixas foram semeadas em lâminas de cultura de poliestireno (BD Biosciences), fixada com formalina a 4% /solução PBS e desidratadas em uma série crescente de álcool. Imuno-histoquímica (IHQ) estudos utilizando o método complexo peroxidase estreptavidina-biotina foram realizadas empregando anticorpo contra o-67 Ki (clone 30-9) anticorpo anti-coelho monoclonal primário (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), utilizando o instrumento Ultra BenchMark ( Ventana Medical Systems). As células foram fotografadas utilizando um microscópio Olympus BX51 com câmera digital Olympus DP71 microscópio. As lâminas coradas foram escaneados digitalmente e as células positivas e negativas foram quantificados utilizando o software ImageScope (ImageScope Virtual Slide, versão 6.25, Aperio Technol., Vista, CA). O total de células células positivas positividade = N /N.

Ambos os subopulations foram tratados com 0-5,0 mM doxorrubicina, 0-5,0 mM epirubicina, 1-100 � cisplatina, e medidos após 48 h. valor médio ± SD de todas as medições foi montado de acordo com a equação de Hill. diferenças significativas nas concentrações individuais foram incorporadas nas curvas.

Sistema xCELLigence

O dispositivo xCELLigence DP da Roche Diagnostics (Mannheim, Alemanha) pode ser usado para monitorar quantitativamente e dinamicamente celular proliferação em tempo real [15]. Respectivamente 1 × 10

4 recém-ordenados ALDH1

alto e ALDH1

células baixas foram semeadas em placas de microtitulação eletrônico (e-Plate ™; Roche Diagnostic) e medida por 72 h com o sistema xCELLigence de acordo com as instruções no manual do usuário. A aplicação de uma baixa tensão (inferior a 20 mV) sinal AC conduz à geração de um campo eléctrico que interage com o ambiente iónico dentro dos poços do e-placas e é diferencialmente modulado pelo número de células no poço, a morfologia das células, e a força de aderência celular. medidas de densidade celular foram realizadas em quadruplicado com uma detecção de sinal programado a cada 20 minutos e foram normalizados para o ponto de tempo de 6 h. aquisição e análise de dados foi realizada com o software RTCA (versão 1.2, Roche Diagnostics).

Formação de Colónias Ensaio

Para determinar a eficiência formação clone (CFE) de células ordenadas

in vitro

, ALDH1

alta, ALDH1

células de baixa e células não coradas (controle) foram contadas e 200 células por poço foram semeadas em placas de seis poços. poços em triplicado foram utilizadas para cada grupo. As células foram cultivadas em meio DMEM-F12 com suplementos de 14 dias, fixadas em metanol durante 10 minutos e coradas com violeta de cristal (Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha). O número de clones que consistiu em mais do que 50 células foram contadas. A CFE foi calculada de acordo com a fórmula:. (O número de clone /o número de células plaqueadas) x 100

em tempo real de RT-PCR

em tempo real de RT-PCR foi realizada de acordo com critérios MIQE [16] para determinar a expressão relativa da ABC genes transportadores ABCG2 /BCRP1, ABCA2, e ABCB1 /MDR1 e os marcadores stemness c-myc, β-catenina, e SOX-2. O ARN total foi isolado com o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O ADN foi digerido com 1 U de DNase (Fermentas, St.Leon-Rot, Alemanha) por ug de ARN. 1 ug de ARN foi transcrito reverso utilizando o kit de síntese de ADNc RevertAid (Fermentas). As reacções de PCR em tempo real foram efectuadas em triplicado usando a mistura de SYBR Verde Super platina com ROX (Invitrogen) em AB7900HT (Applied Biosystems, Invitrogen). O genes housekeeping gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), β-actina (ACTB) e hipoxantina (HPRT-N) serviu como um controlo interno devido à sua expressão estável em diferentes tecidos. A Tabela 1 lista os iniciadores utilizados para PCR em tempo real. Os níveis de expressão foram calculados com base no

método -ΔΔCT 2 [17].

Droga sensibilidade do ensaio

As células seleccionadas foram ajustados a uma densidade de 5 x 10

3 células /100 ul e incubadas em microplacas de 96 poços. As células foram expostas a várias concentrações de fármacos quimioterapêuticos (cloridrato de doxorubicina, cloridrato de epirubicina, e

cis

-diammineplatinum (II) cloreto de (cisplatina), Sigma Aldrich), durante 48 h. sensibilidade ao fármaco quimioterapêutico foi determinada pelo ensaio de MTS (Promega, Mannheim, Alemanha), seguindo as instruções dos fabricantes em quatruplicates usando um fotómetro (Spektramax;. BMG Labtech, Offenburg, Alemanha) no comprimento de onda de 490 nm. IC

50 valores foram determinados a partir dos dados de inibição do crescimento.

Análise Estatística

As variáveis ​​de resultados foram expressos como média ± SD. de Student não pareado

t

-teste eo teste exato de Wilcoxon foi utilizado para avaliar diferenças entre os grupos, com as estatísticas PASW 18 software (IBM Corporation, Somers, NY). Frente e verso

P

-Valores abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. IC

50 curvas foram ajustadas de acordo com a equação de Hill (sigmóide, 3 parâmetros). dados gráficos foram preparadas com SigmaPlot® (Systat Software Inc., San Jose, CA).

Resultados

Linhas sarcoma de células Exibir uma fração distintivo do ALDH1

altos Cells

o sistema de ensaio Aldefluor® tem sido desenvolvida para detectar a actividade da isoforma ALDH1. Utilizou-se este ensaio seguido por análise FACS para avaliar a presença e quantidade de ALDH1

altas populações de células em cinco linhas celulares de sarcoma humanos e uma linha celular cordoma [18].

Para definir um marcador para ALDH1

células de alta células controle deab foi usado para garantir a precisão da análise. As células representativas SW-1353 foram tratadas na presença do inibidor de DEAB ALDH1 (Figura 1A) ou manchado com reagente Aldefluor®, que são definidos como ALDH1

de células de alta (Figura 1B). experimentos de triagem foram realizados um mínimo de cinco vezes em cada linha celular. A quantidade de ALDH1

de células de alta dada em média ± DP foi de 1,77 ± 0,9% para a linha de células de fibrossarcoma SW-684 (n = 12), 0,77 ± 0,4% para a linha celular lipossarcoma SW-872 (n = 5) , 2,23 ± 1,0% para a linha celular de sarcoma sinovial SW-982 (n = 11), e 2,69 ± 1,3% para a linha celular de condrossarcoma SW-1353 (n = 8), respectivamente. A linha celular cordoma MUG-Chor 1 mostrou apenas uma pequena proporção de 1,11 ± 0,5% ALDH1

de células de alta (n = 9) (Figura 1C). Por isso, centrou-se nas três linhas celulares de sarcoma SW-684, SW-982, SW-1353 e nas experiências seguintes. No ensaio de repovoamento do ALDH1

populacional gerado um maior conta de estatística significativa de 41,73 ± 18,5% (* p = 0,0039) ALDH1

células de alta nas SW-684 células, 52,5 ± 8,75% (* p = 4,39 e-07) na linha de células SW-982, e 31,7 ± 11,1% (* p = 0,0025) (n = 5) em 1353 SW-células de condrossarcoma (Figura 1D). Adicionais nossas observações de expressão ALDH1 reforçada poderia ser ainda ser comprovadas por análise western blot (Figura 1E; Tabela 2).

ALDH1

Células altos Mostrar Proliferação Superior e clonogenicidade

Usando o ImageScope software Ki-67 células positivas e negativas foram quantificados após a coloração imuno-histoquímica. ALDH1

células de alta de todas as três linhas de células têm um aumento do nível de proliferação em comparação com ALDH1

células de baixa. Representante de coloração SW-982 ALDH1

alta (Figura 2A) e ALDH1

células baixos (Figura 2B) são mostrados e resumidos na Tabela 2 (n = 5). Além disso, ALDH1

alto e ALDH1

células de baixa diferiram significativamente na velocidade de crescimento logarítmica medido com o xCELLigence-System (Figura 2C-E).

Figura 3A mostra a atividade clonogênica de ALDH1

células de alta e ALDH1

baixos. Os dados de cinco experiências independentes representam a contagem média de colónias /cavidade ao fim de 14 dias e todos os valores são listados na Tabela 2. A eficiência de formação de clones foi significativamente maior em 1353 SW-ALDH1

de células de alta em comparação com ALDH1

células de baixa correspondente ( * p = 0,0005). Para as outras duas linhas celulares estes efeito também podia ser demonstrado, no entanto, em menor extensão. O maior número de colónias no SW-684, SW-982, e-1353 SW ALDH

células de alta é apresentado (Figura 3B).

A expressão de mRNA de ABCG2, c-Myc, β- catenin, e SOX-2 são regulados positivamente em ALDH1

altos Cells

Nós investigamos se ALDH1

células de alta são enriquecidas para a expressão de genes que têm sido postuladas para desempenhar papéis importantes na biologia de células-tronco, tais como c-myc, β-catenina, e SOX-2 [19]. RT-PCR quantitativo mostraram aumento da expressão de c-Myc na ALDH1

população elevada, enquanto as células de controlo não triados (Ctrl) e ALDH1

células de baixa teve expressão apenas o mínimo (Figura 4A). De modo semelhante, um ligeiro, mas não significativo, aumento na expressão de β-catenina, e SOX-2 no ALDH1

fracção de elevado poderia ser observado (n = 6) (Figura 4B-C).

A expressão relativa das três principais transportadores de fármacos ABCG2 /BCRP1, ABCA2, e ABCB1 /MDR1 foi determinada pelo tempo real de RT-PCR (n = 5). Curiosamente o ALDH1

alta população de todas as linhas de células de sarcoma demonstrado, com significância estatística, o aumento dos níveis de ABCG2 expressão em relação ao controle ou ALDH1

células baixas (Figura 4D), enquanto o valor p para ABCA2 não foi significativa (Figura 4E). Além disso, em ALDH1

elevadas células SW-1353 uma maior expressão significativa estatística da ABCB1 (p = 0,0302) poderia ser observado (Figura 4F). O 2

-ΔΔCT valores e os valores de p correspondentes estão listados na Tabela 2.

ALDH1

altas células apresentam maior resistência à droga

A hipótese de células-tronco do câncer propõe que o discrepância entre a resposta ao tratamento e a sobrevivência do paciente observado na maioria dos tipos de cancro reflecte uma resistência inerente das células estaminais cancerosas para quimioterapia. Para investigar possíveis diferenças na resistência aos medicamentos ALDH1

células de alta e ALDH1

baixo classificadas SW-982 e SW-1353 foram tratados com doses crescentes de três agentes quimioterápicos comumente usados ​​depois de uma fase de recuperação de duas semanas. ALDH1

elevados SW-982 células tratadas durante 48 horas com 1,0 | iM (p = 0,016) e 5,0 uM (p = 0,001) doxorrubicina foram significativamente aumentados em comparação com ALDH1

células baixos (Figura 5A). O tratamento com 1,0 uM epirubicina (p = 0,045) induzida uma resistência a drogas melhorada (Figura 5B). células de alta SW-1353 ALDH1

mostrou um efeito significativo semelhante após o tratamento com 5,0 uM de doxorrubicina (p = 2.77E-05) (Figura 5D) e 0,5 uM de epirrubicina (p = 0,039) e 1,0 uM de epirrubicina (p = 0,021 ) (Figura 5E). O tratamento com cisplatina causou apenas pequenas diferenças entre ALDH1

células de alta e ALDH1

baixo SW-982 e SW-1353 (Figura 5C e 5F). Na linha de células de fibrossarcoma poderia ser detectada SW-684 diferenças não significativas. valor médio ± SD de todos os experimentos foi montado de acordo com a equação de Hill. O correspondente calculado IC

50 valores estão listados na Tabela 2.

Discussão

Com base na célula-tronco do câncer de corrente (CSC) hipótese, apenas uma pequena subpopulação na população tumor heterogêneo é capaz de iniciar e re-iniciar tumores. O conceito de CSCs foi baseada na observação de que, quando células cancerosas de muitos tipos diferentes foram ensaiadas quanto ao seu potencial proliferativo em vários ensaios in

in vitro

e

In vivo

, apenas uma minoria de células mostrou proliferação extensiva [20]. CSCs têm sido identificados numa variedade de malignidades [21], [22], [23]. Um método largamente aceite para identificação de CSCs baseia-se na actividade enzimática da aldeído desidrogenase 1 (ALDH1), uma enzima desintoxicante responsável pela oxidação dos aldeídos intracelulares [8], [21]. Há diferentes isoformas de ALDH. O sistema de ensaio Aldefluor® tem sido desenvolvida para detectar a actividade da isoforma ALDH1. ALDH1 actividade mostrou ser aumentado em CSCs e foi usado para isolar CSCs em cancros diferentes [24], [25], [26]. Portanto, ALDH1

células de alta exibir várias características tipicamente visto em CSCs, incluindo a capacidade de auto-renovação, geração de progênie diferenciada, e aumento da expressão de genes marcadores de células-tronco. O estudo da biologia CSC baseia-se na capacidade de avaliar com precisão representação CSC dentro das populações de células de cancro. Como sugerido pelos resultados mais recentes representação CSC pode ser uma função do tipo de célula de origem, microambiente estromal, acumulada mutações somáticas e fase de progressão maligna alcançados por um tumor [27], [28].

Até à data , a existência de uma tal população de células estaminais, como em osteossarcoma humano e linhas de células de sarcoma de Ewing foi baseada na expressão de genes marcadores de células estaminais, bem como a sua capacidade para formar esferóides

in vitro

[29], [30], [31]. Tem sido sugerido que a identificação do CSC não pode assentar apenas na população lateral (SP) a triagem utilizando efluxo de corante Hoechst 33342. No entanto, o fenótipo SP não é apresentado em todos os CSCs e podem existir outros mecanismos de defesa para os CSCs para evadir terapias de drogas que não podem ser identificadas por coloração com corante Hoechst [32]. Por isso, escolhemos o marcador ALDH1. Nossos resultados mostram que todas as cinco linhas celulares de sarcoma contido percentual diferente de ALDH1

células de alta, com o maior percentual em fibrossarcoma, sarcoma sinovial, e linhas celulares de condrossarcoma. A pequena expressão ALDH1 dos ALDH

células de baixa na análise de Western blot pode ser explicada pela utilização do anticorpo primário ALDH1 /2. A taxa de proliferação e clonogenicidade de SW-684, SW-982, e SW-1353 ALDH1

células de alta

in vitro

foram significativamente maiores do que a de ALDH1

células de baixa, de acordo com as características de o alto fenótipo ALDH1 atividade em outras células cancerosas [33], [34], o que pode indicar que ALDH1

células de alta de sarcoma são parcialmente responsáveis ​​pela metástase do tumor e recorrência e deve ser focado durante a terapia do cancro. Tal como c-Myc foi recentemente reconhecido como um importante regulador da biologia das células estaminais, que possa servir como um elo de ligação malignidade e “stemness” [35]. Introdução de c-Myc com outros factores de transcrição (incluindo SOX-2) induzida gera células estaminais pluripotentes a partir de células diferenciadas [36]. Sinalização de Wnt /β-catenina desempenha um papel importante não apenas no cancro mas também em cancro de células estaminais [37]. Nossos dados quantitativos de RT-PCR mostraram aumento da expressão de c-Myc, β-catenina, e SOX-2 no ALDH1

população elevada, enquanto as células de controlo não triados (Ctrl) e ALDH1

células de baixa tinha apenas expressão mínima.

Um mecanismo proposto de resistência à quimioterapia de cancro de células estaminais é baseado na expressão aumentada de proteínas de transporte da cassete de ligação a ATP (ABC), que são responsáveis ​​por efluxo de droga. maior expressão de proteínas transportadoras de ABC em células estaminais em comparação com células não estaminais resulta em resistência relativa das células estaminais para os efeitos tóxicos de medicamentos de quimioterapia [12], [13]. Analisou-se a expressão de mRNA de três grandes transportadores de drogas (ABCG2 /BCRP1, ABCA2, ABCB1 /MDR1) do ABC família transportador. No presente estudo, ABCG2 foi regulada em ALDH1

células de alta de todas as três linhas celulares sarcoma. Além disso, um outro transportador ABCB1 /MDR1 ABC também foi encontrado com maior nível de expressão de mRNA em SW-1353 ALDH1

células de alta em comparação com ALDH1

células de baixa. Estes genes podem ser responsáveis ​​pela resistência a múltiplos fármacos de células cancerosas e deve ser alvos ideais para a terapia clínica do cancro.

Fármacos quimioterapêuticos

adicionais, ALDH1

de células de alta mostraram um aumento da resistência à vulgarmente utilizados. ALDH1

células de alta de SW-982 e SW-1353 mostrou sensibilidade significativamente menor para ambos doxorrubicina e epirrubicina comparação com ALDH1

células de baixa. O tratamento com cisplatina apresentaram apenas ligeiras diferenças. Juntos, isolado com sucesso ALDH1

células de alta a partir de diferentes linhas celulares de sarcoma utilizando o ensaio Aldefluor®. ALDH1

células de alta exibiu

in vitro

uma maior taxa de proliferação significativa, o aumento da eficiência clone formação, expressão elevada de transportadores ABC e marcador stemness, bem como o aumento da resistência aos medicamentos quimioterápicos comparado a ALDH1

células de baixa .

em conclusão, a presença de células estaminais, como com o aumento da expressão ALDH1 poderia ser um dos possíveis contribuintes para o desenvolvimento da resistência aos medicamentos em sarcomas. Outras estudo será necessário para definir as células-tronco do sarcoma e os mecanismos de resistência aos medicamentos, mas ALDH1

alta população pode servir como um

in vitro

modelo de pesquisa para novas opções de tratamento terapêutico.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer Heike Kaltenegger e Alexandra Novak pela excelente assistência técnica.