Abstract

Fundo

pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é um tumor altamente desmoplastic com um prognóstico sombrio para a maioria dos pacientes. Fibrose e inflamação são características de desmoplasia tumor. Foi anteriormente demonstrado que a prevenção da activação de células estreladas pancreáticas (CSP) e aliviando a desmoplasia estratégias são benéficos no tratamento de PDAC. A metformina é um medicamento para baixar a glicose amplamente utilizado. É também frequentemente prescritos para doentes com cancro do pâncreas diabéticos e foi mostrado para associar com um melhor resultado. No entanto, os mecanismos subjacentes a este benefício permanecem obscuros. Metformina tem sido encontrado para modular a actividade de células estreladas em outras configurações de doença. Neste estudo, nós examinamos o efeito da metformina sobre a atividade PSC, fibrose e inflamação em PDACs.

Métodos /Resultados

Em pacientes com sobrepeso, diabetes PDAC e modelos pré-clínicos, o tratamento com rato metformina níveis reduzidos de tumor de matriz extracelular (ECM) componentes, em particular de hialuronano (HA).

In vitro

, descobrimos que a metformina reduziu a sinalização TGF-ß e a produção de HA e colágeno-I em PSCs cultivadas. Além disso, verificou-se que a metformina alivia a inflamação do tumor, reduzindo a expressão de citoquinas inflamatórias incluindo IL-1, bem como infiltração e M2 polarização de macrófagos associados a tumores (TAM)

In vitro

e

In vivo

. Estes efeitos sobre macrófagos in

in vitro

parecem estar associados com uma modulação da via AMPK /STAT3 por metformina. Finalmente, encontramos em nossos modelos pré-clínicos de que o alívio da desmoplasia pela metformina foi associada com uma redução na remodelação ECM, epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT) e metástase, em última análise sistêmica.

Conclusão

metformina alivia o microambiente fibro-inflamatório em indivíduos obesos /diabéticos com cancro do pâncreas através da reprogramação de unidades e TAM, que se correlaciona com a progressão da doença reduzida. A metformina deve ser testado /explorada como parte da estratégia de tratamento em pacientes diabéticos com sobrepeso PDAC

Citation:. Incio J, Suboj P, Chin SM, Vardam-Kaur T, Liu H, Hato T, et al. (2015) a metformina reduz Desmoplasia no cancro do pâncreas pela reprogramação das células estreladas e Tumor-Associated macrófagos. PLoS ONE 10 (12): e0141392. doi: 10.1371 /journal.pone.0141392

editor: Keping Xie, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, United States |

Recebido: 04 de julho de 2015; Aceito: 06 de outubro de 2015; Publicação: 07 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Incio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade

Data: Todos os arquivos de dados estão disponíveis no banco de dados HARVARD DATAVERSE (número de acesso (s) https://dx.doi.org/10.7910/DVN/LLN5FL)

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (http: //nih.gov/; R35-CA197743, CA80124, CA85140, CA96915, CA115767 e CA126642 a RKJ e DF), a Fundação Lustgarten (https://www.lustgarten.org/; bolsa de pesquisa para RKJ) e da Fundação para a Ciência e Tecnologia (https://www.fct.pt/; Portugal, POPH /programa de financiamento FSE, companheirismo e bolsa de pesquisa para JI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores deste manuscrito ter lido a política da revista e ter a interesses concorrentes seguinte: RKJ recebeu honorários de consultores de Ophthotech, SPARC e SynDevRx. RKJ possui equidade em Enlight, Ophthotech, SynDevRx e XTuit e atua no Conselho de Administração da XTuit e os Conselhos de Curadores da Tekla Healthcare Investors, Tekla Ciências Biológicas investidores e Tekla Fundo de Saúde de Oportunidades. Sem reagentes ou fundos dessas empresas foi utilizada nestes estudos. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O prognóstico para pacientes com câncer de pâncreas é sombrio, com uma taxa de sobrevida global em cinco anos de 7% [1]. Obesidade e diabetes tipo 2 (DM2) tornaram-se uma pandemia mundial [2, 3]. Estudos recentes têm demonstrado que essas anormalidades metabólicas estão associados com o aumento da incidência, progressão e prognóstico ruim de PDAC [4-9]. No diagnóstico, aproximadamente metade dos pacientes PDAC estão com sobrepeso ou obesos, e até 80% dos pacientes apresentam com diabetes ou intolerância à glicose [10-17]. DM2 e obesidade pode promover PDAC através de pró-tumorigénico insulina e insulina-like growth factor-1 (IGF-1) [18-20] bem como a inflamação crónica [21, 22]. Assim, as intervenções farmacológicas que têm como alvo a diabetes /obesidade também pode produzir efeitos anti-tumorais. Um desses agentes, atualmente sob intensa investigação, é a metformina, o mais amplamente prescritos medicamentos genéricos anti-diabético, que também é administrado frequentemente para pacientes diabéticos PDAC [23]. A metformina tem sido mostrado para melhorar os resultados do tratamento em modelos pré-clínicos de PDAC [24-30]. Além disso, reduz a incidência de câncer de pâncreas em pacientes diabéticos, bem como melhora a sobrevida (redução do risco de morte em 32%) em novos casos diagnosticados [31-33]. No entanto, os mecanismos de acção da metformina no cancro pancreático não são bem compreendidos.

In vitro

estudos têm abordado o impacto da metformina sobre fatores de transcrição, microRNAs, danos no DNA, células-tronco do câncer e do metabolismo [34-38]. Além disso, a metformina tem sido mostrado para modular a função de células estreladas hepáticas, reduzir o stress oxidativo em fibroblastos associados ao cancro, e diminuir a inflamação tumoral [34, 35, 39, 40]. Nós e outros autores demonstraram que a reprogramação unidades reduz a produção de matriz extracelular (ECM) componentes, tais como o colagénio-I e hialuronano (HA), e retarda a progressão do cancro pancreático [41-45]. No entanto, o impacto da metformina sobre a ativação PSC, nunca foi descrito produção de componentes da MEC e desmoplasia tumor.

O objetivo deste estudo é elucidar os mecanismos funcionais de metformina dentro do microambiente do tumor fibro-inflamatório PDAC.

In vivo

estudos de cancros pancreáticos até à data foram realizados principalmente em modelos de xenoenxerto em ratos de peso normal /não-diabéticos, onde a metformina tem sido mostrados para ser menos eficaz [26, 46-48]. Por isso, foram utilizados dois modelos de mouse sing�icos imunocompetentes que perto imitar a obesidade /DM2, para melhor representar pancreático pacientes de câncer maioria dos pacientes com câncer pancreático presentes com qualquer nova DM2 início ou tolerância à glicose diminuída no momento do diagnóstico [10-17] – e a população-alvo da metformina. Além disso, complementamos os nossos modelos de rato com

in vitro

estudos, bem como com a análise de amostras humanas de câncer de pâncreas de peso normal e os pacientes com sobrepeso /obesidade. Descobrimos que a metformina reprograma diretamente PSCs e TAM e alivia fibrose e inflamação em modelos obesos /diabéticos de PDAC. Estes efeitos da metformina correlacionada com a redução da remodelação de ECM e epitelial para mesenquimal transição (EMT), em última análise afectar a metástase. Nós confirmamos que os níveis de ECM em amostras PDAC humanos em pacientes com sobrepeso e obesidade foram de facto mais baixo na população de doentes tratados com metformina.

Materiais e Métodos

Experiências com animais

A Institucional animal Care e Use Committee do Hospital Geral de Massachusetts aprovou todo o uso experimental de animais neste estudo. Todos os procedimentos com animais seguidos Política de Serviço de Saúde Pública no cuidado humano de diretrizes laboratoriais animais. Tipo selvagem (WT) C57BL /6 e camundongos machos FVB foram originalmente obtidas a partir de The Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) e criados e mantidos no nosso biotério-flora definido. Os ratinhos foram mantidos num ciclo de luz-escuro de 12 h numa instalação de barreira, com temperatura controlada, com

ad libitum

acesso a comida e água acidificada. Para gerar modelos diabéticos obesos /rato, ratos (6 semanas de idade) foram dadas uma dieta de gordura de 60% (D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ) durante 10 semanas tal como previamente descrito [49-51] (tempo de implantação do tumor) e continuou durante a duração dos estudos de tumor. Para as experiências de tumor, o PAN02 e modelos singeneicos PDAC AK4.4 foram usadas em ratos C57BL /6 e ratinhos imunocompetentes FVB, respectivamente. PAN02 células (

SMAD4-M174

) [52] foram obtidas a partir de ATCC. células AK4.4 (

KrasG12D

e

p53

+/-

) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Nabeel Bardeesy em MGH. Estas células foram isoladas de ratos gerando tumores pancreáticos espontâneas (

PTF1-Cre /LSL-Kras

G12D

/p53

Lox /+

) [53]. tumores pancreáticos ortotópicos foram gerados através da implantação de uma pequena peça (1 mm

3) de tecido de tumor viáveis ​​(a partir de um tumor de origem em um animal dador separado) em pâncreas de macho magros ou obesos FVB (modelo AK4.4) ou C57BL /6 (modelo PAN02) mouse. Ambos os modelos de tumor foram utilizados autenticado pela IDEXX Laboratories. (PAN02: IDEXX Caso Radil # 22.366-2.013 AK4.4:. IDEXX Radil Caso # 27818-2014).

estudos de crescimento de tumor de pâncreas

Aos 7 dias após a implantação, ratos portadores PAN02 ortotópico ou tumores pancreáticos AK4.4 foram randomizados em grupos de controle ou tratamento com metformina. No dia 21, as amostras de plasma e tumor foram recolhidos, e os tumores foram pesados ​​e processados ​​para análise posterior.

Metformina tratamento

A dose padrão de metformina para o tratamento de seres humanos é de 1000 a 2500 mg, normalmente dada duas vezes por dia. No presente estudo, a metformina foi administrado a 300 mg /kg na água potável. Isto pode ser traduzido para o equivalente humano da dose, utilizando o método de Reagan-Shaw [54]. De acordo com a fórmula para a dose de animais (mg /kg) de dose humana [equivalente (mg /kg) = x animais (km) /humano (km). Km por 60 kg adultos humanos é igual a 37 e para um ratinho de 20 g é igual a 3], o equivalente humano da dose de murídeo de 300 mg /kg é de 1459 mg para um ser humano médio de tamanho de 60 kg adulto. Por conseguinte, a dose seleccionada no presente estudo está dentro da gama terapêutica segura gravada em seres humanos. Além disso, o presente estudo determinou o período terapêutico a ser de 2 semanas para avaliar o efeito antitumoral de metformina. Este era compatível com os períodos terapêuticas relatadas em estudos anteriores [55, 56]. metformina fresco foi administrado na água de beber a cada 3 dias. A quantidade adicionada de cada gaiola animal foi calculada com base no consumo diário médio para que gaiola durante um período de 2 semanas antes do início do tratamento, e ajustada a cada três dias com base no consumo de água e peso do corpo dos animais. A concentração plasmática aproximada de metformina em pacientes com diabetes tipo 2, tendo esta droga é de 0,05 mM, embora possa acumular-se nos tecidos e atingir localmente concentrações mais elevadas [35]. Para

in vitro

experimentos, uma gama de concentração de 0,05-25 mM, dependendo da linha celular utilizada (por favor, veja abaixo para mais detalhes).

efeito da metformina na PSCs e macrófagos

in vitro

ensaios MTT padrão foram realizadas em unidades e macrófagos tratados com metformina em uma gama de 0.05-25mM, para examinar os efeitos potenciais sobre a viabilidade celular. RAW 264.7 (leucémicas de ratinho de monócitos-macrófagos) foram obtidas a partir da ATCC e utilizadas para avaliar o efeito da metformina sobre macrófagos

In vitro

. As células foram semeadas em placas de 10 cm

2 placas de Petri em meio de soro /livre de soro e tratadas com metformina durante 48 horas a concentrações que variam 0,05-0,4 mM (concentrações que não afectam substancialmente a viabilidade das células). Após o tratamento, as células foram colhidas para extracção de RNA e proteínas, a fim de executar a análise posterior da expressão de genes de citoquinas e marcadores de polarização, e por análise de sinalização e vias metabólicas. PSCs humanos foram semeadas em placas de 10 cm

2 placas de Petri em meio com soro a 2,5% e tratado com metformina durante 48 horas a concentrações que variam de 0,1 a 10 mm. As células foram colhidas para extracção de proteínas para análise da activação de vias relacionadas com a fibrose. Além disso, unidades foram semeadas numa câmara de corrediça 8 poços (20000 células /poço), tratado com metformina (1 mM, uma concentração que não afecte a viabilidade celular) durante 48 h, e coloração de imunofluorescência foi realizada de acordo com protocolos padrão. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e bloqueadas com soro de burro normal de 5% durante 1 h. Elas foram incubadas com os anticorpos primários designados durante a noite a 4 ° C e depois durante 2 h com os anticorpos secundários apropriados à TA. PBS foi usado para todas as lavagens, e as amostras manchadas foram montadas com Prolong ouro com DAPI. As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio confocal. Os anticorpos utilizados e configurações de aquisição de imagem são descritos abaixo. Ambos os tipos de células foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 5% (v /v) de soro bovino fetal inactivado pelo calor (FBS; Sigma), 100 unidades /ml de penicilina e de estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada incluindo 5% de CO

2

amostras Humanos

As amostras humanas de cancro do pâncreas foram obtidos a partir do repositório de tecido MGH (http:. //www.massgeneral.org/research/resourcelab.aspx?id=31) ao abrigo de um protocolo IRB ativa (número de aprovação Partners Healthcare IRB: 2013P001969). consentimento informado por escrito, do dador ou o parente mais próximo foi obtida para a utilização dessas amostras para fins de investigação. Tumores selecionados receberam nenhuma quimioterapia ou radioterapia prévia antes do espécime cirúrgico foi coletado no momento da ressecção do tumor. Um total de 28 amostras foram seleccionados aleatoriamente a partir deste subconjunto de amostras. índice de massa corporal foi obtido para a amostra respectiva. 7 das amostras (25%) correspondem a pacientes que foram medicados com metformina no momento da ressecção. As secções de parafina foram coradas para o colagénio-I e de HA, como descrito abaixo. As imagens foram adquiridas através de microscopia confocal e quantificadas usando Matlab. Os dados foram analisados ​​de forma anónima.

Gene Expression

Imediatamente após a excisão, tecido tumoral foi snap-congelado e armazenado em nitrogênio líquido. O ARN total foi extraído e a expressão do gene relativo dos marcadores de macrófagos M1 /​​M2 foi determinada utilizando um protocolo normalizado com base Sybr-verde. Além disso, o ARN total foi extraído, e a expressão do gene relativa foi determinada usando o sistema de RT2 Profiler PCR matrizes (Qiagen) em um Mx3000P QPCR Sistema Stratagene utilizando matrizes pré-fabricados focada-via ( “Fibrose” -Cat Número:. PAMM011Z; “epitelial para mesenquimais Transição (EMT) “- Cat Número:. PAMM090Z;” TGF-ß sinalização alvos “-PAMM235Z;” Matriz extracelular Moléculas de Adesão:; citocinas comuns “-Cat Número: PAMM021Z” -Cat Número PAMM013Z e. “. ).

Protein Expression

análise de Western blot.

Cada amostra de tumor foi homogeneizada diretamente em tampão de lise para extração de proteínas. 20ug de proteína desnaturada por amostra foi carregada em 7%, 10%, e 12% de géis de SDS-poliacrilamida. Anticorpos utilizados: fosfo-p38 MAPKT

180 /Y182 e p38; fosfo-JNK (SAPK /JNK)

Thr183 /Tyr185 e JNK; fosfo-AKT

Ser473 e AKT, fosfo-ERK (p44 /42 MAPK)

T202 /Y204 e ERK; fosfo-NF-kB

Ser536 e NK-kB; p65

Ser536; fosfo-Smad2

Ser465 /467 e Smad2; fosfo-IGF-I Receptor ß

Tyr1135 e IGF; Phospho-IRS-1

Ser612 e IRS; IR; phpspho-stat3

Tyr705 e stat3; Phospho-AMPKα

Thr172 e Ampkα; fosfo-Ampkβ

Ser108 e AMPK; fosfo-ACC

Ser79 e ACC; Phospho-PDGF receptor ß

Tyr751 e PDGF receptor ß e caracol, e-caderina e vimentina, TGF-ß, ß-catenina, torção, LC3B. Todos os anticorpos listados acima foram obtidas a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA), e diluído 1: 1000 com a excepção de fosfo-JNK (SAPK /JNK)

Thr183 /Tyr185, fosfo-NF-kB p65

Ser536 , fosfo-Smad2

Ser465 /467, fosfo-IGF-I Receptor ß

Tyr1135, caspase-3, Phospho-IRS-1

Ser612. Outros anticorpos utilizados foram: αSMA e fosfo-receptor de insulina

Y972 (1: 1000 e 1: 500, Abcam, MA); COL-1 (1: 1000); MMP-9 e MMP-2 (1: 500 e 1: 200, Merck-Billerica, MA), AT1 (1: 1000, LifeSpan BioSciences Inc, WA), ZEB1 (1: 1000, Novus Biologicals, CO), e ß-actina (1: 5000, Sigma, MO). Quantificação da expressão da proteína em relação ao receptor, total ou ß-actina foi obtido usando o software Image J..

array Multiplex.

Cada amostra de tumor foi homogeneizada diretamente em tampão de lise para extração de proteínas. Foi utilizado 2 ug /ul de amostra. Foi utilizada uma matriz de proteína de citocinas inflamatórias múltipla multiplex (kit do mouse V-PLEX pró-inflamatórias Panel1, Cat Número:. K15048D). para a análise ELISA

Imunofluorescência /imuno-histoquímica

Para a análise de secções congeladas de rato tecidos de tumor, os tumores foram excisados ​​e congelados em composto de temperatura de corte óptima (Tissue-Tek). secções transversais de tumores, 10 mm de espessura, foram imunocoradas com anticorpos específicos. Para obter imagens em mosaico de secções de tumor, foi utilizado um Olympus FV1000 microscópio confocal de varredura a laser. Um objectivo 10x ar adquirida ladrilhos quadrados de 1260 ^ m, e uma fase automatizado digitalizado ao longo de toda a secção transversal do tecido tumoral. As telhas fotografada foram costurados em uma imagem mosaico final usando o software Olympus. expressão do antigénio foi quantificada pela medição da área ocupada pela mancha de interesse normalizada pela área de núcleos corados DAPI (isto é, sem unidade), e analisados ​​por meio de um algoritmo de costume em Matlab (The MathWorks). configurações idênticas e limiares para a análise foram utilizados para todos os tumores. Os anticorpos utilizados para imunofluorescência foram os seguintes: colagénio-I [LF-68 do anticorpo, diluição 1:50, fornecida pelo Dr. Larry Fisher (NIDCR)]; O hialuronano (fragmento biotinilado hialuronano proteoglicano, 385911, Calbiochem, diluição 1: 200); αSMA (anticorpo C6198, Sigma, diluição a 1: 500); e /80 (anticorpo MCA497A488, ABDserotec, 1: 200 de diluição) F4. Cy3-, Cy5- ou anticorpos secundários conjugados com FITC foram utilizados para a detecção de sinais por meio de microscopia confocal. As lâminas foram contrastadas com DAPI para a coloração nuclear.

actividade MMP ensaio

Cada amostra de tumor foi homogeneizada diretamente em tampão de lise para extração de proteínas. Um ensaio padrão comercial (Abcam ab112146) foi utilizado para detectar a actividade geral das MMPs nas amostras de tumor. Os lisados ​​de tumor foram incubadas com [péptido transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET)] substrato fluorescente para 1, 2, e 16 horas, e a fluorescência foi medida utilizando um leitor de microplacas fluorescente.

Citometria de Fluxo

ratinhos portadores de tumor foram perfundidos através de injecção intracardíaca de PBS e sacrificados. tecidos de tumor pancreático foram colhidas, picados, e digeriu-se a 37 ° C durante 1 h com DMEM contendo colagenase tipo 1A (1,5 mg /mL), hialuronidase (1,5 mg /mL), e ADNase (2 ug /mL). As misturas de digestão foram filtradas através de filtros de células de 70 mícrons. Suspensões de uma única célula foram incubadas com rato anti-CD16 /CD32 mAb de bloqueio e coradas com anticorpos fluorocromo-conjugados, em tampão frio (1% de BSA, 0,1% NaN3 em PBS). 7-amino-actinomicina D (7AAD) reagente (eBioscience) foi adicionado aos tubos corados por instrução do fabricante imediatamente antes de executar a análise de fluxo. A citometria de fluxo de dados foram adquiridos num citómetro de fluxo LSRII (Becton Dickinson) e foram analisados ​​com o software FACSDiva. FSC-A vs. FSC-W e SSC-A vs. SSC-W foram aplicados para discriminar os /eventos agregados gibão. Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais anti-rato: CD45-PE, CD45-PE-Cy7, CD45-FITC, CD11b-APC-Cy7, CD11b-APC, F4 /80-APC (BD Biosciences) e F4 /80-FITC e F4 /80-PE (eBioscience).

isolamento do macrófago

Depois de cortar o tecido tumoral em pedaços de 0,5 mm de diâmetro, os tumores foram dissociadas com colagenase e hialuronidase durante uma hora. tumores dissociados foram lavados com tampão de triagem (0,5% de BSA em PBS) e passados ​​através de filtros de células antes de serem bloqueados usando Fcr e posteriormente incubadas com um anticorpo biotinilado primário F4 /80 (eBiosciences) durante 15 min. Anti-biotina conjugado esferas magnéticas (Miltenyl Biotec) foram adicionados à suspensão de células e incubaram-se durante 15 min antes da exposição das células a colunas magnético (MACS LS-colunas de Miltenyl Biotech) para a separação de células.

A análise estatística

As diferenças estatísticas entre grupos foram avaliadas por um teste t de Student de duas caudas. análise de duas vias de variância foi utilizada na comparação entre o peso corporal ao longo do tempo entre o controle e grupos tratados com metformina. A incidência de metástase e invasão de parede foi analisada utilizando qui-quadrado. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software Prism Graphpad. Todos os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o valor de P foi inferior a 0,05, quando calculada com o teste estatístico adequado. Os resultados são apresentados como a média ± erro padrão.

Resultados

A metformina reduz desmoplasia no mouse e PDACs humanos

Temos demonstrado que a redução dos componentes da MEC para baixar o desmoplasia tais como HA e colágeno-I-in PDACs potenciar tratamentos anti-tumorais [41-43]. Assim, foi examinada a relação entre o tratamento com metformina e desmoplasia no PDACs em tratamento de quimioterapia /radioterapia amostras cirúrgicas PDAC ingênuos. Descobrimos que em pacientes com sobrepeso ou obesos em tratamento com metformina, os níveis de HA foram 30% menor do que em doentes que não tomam metformina (Fig 1-I e 1ii). Curiosamente, não foi observada nenhuma diferença nos níveis de HA em pacientes tratados metformina de peso normal. Por outro lado, o tratamento com metformina parece ter nenhum impacto sobre a expressão de colagénio-I em ambos os grupos de peso corporal (Fig S1).

(i) as imagens histologia representativa mostrando o efeito da metformina sobre os níveis de hialuronano no tumor peso normal [índice de massa corporal (IMC) 25)] ou /pacientes obesos sobrepeso (IMC 25) (n = 22 controles, 7 metformina). (Ii) a análise imuno-histoquímica do total de níveis de ácido hialurônico tumor. Metformina diminui a fração de área hyaluronan-positivo (%) em pacientes com sobrepeso /obesidade. Os dados são apresentados como a média ± erro padrão. * P 0,05 vs controle em pacientes com IMC . 25

Para avaliar se pudéssemos recapitular esses achados em modelos pré-clínicos, foi utilizado FVB e C57BL /6 ratos alimentados com uma dieta rica em gordura . Nós, juntamente com outros mostraram que uma dieta rica em gordura induz a obesidade e anomalias metabólicas típicas do DM2, glicose elevada, insulina e IGF-1 [50, 57-60] nestas estirpes. Depois de 10 semanas na dieta rica em gorduras, AK4.4 e tumores PAN02 foram implantados ortotopicamente na FVB obesos e ratos C57BL /6, respectivamente. Os animais foram distribuídos aleatoriamente a metformina em água (300 mg /Kg) ou nenhum tratamento beber no dia 7 até o dia 21, quando o plasma e os tumores foram recolhidos. O tratamento com metformina correlacionada com a expressão de HA reduzida em 64% (Figura 2ai e 2Aii) e de colagénio-I em 35% (Figura 2ai e 2Aiii) em AK4.4. tumores. Além disso, a percentagem de unidades activados (como determinado pela expressão do antigénio de músculo liso alfa, αSMA) que co-expressam HA e colagénio-I diminuiu em 58 e 38%, respectivamente (Figura 2BI-2Biii). Em um segundo modelo, menos desmoplastic (PAN02), metformina diminuiu a expressão de HA em 40% e de colagénio-I em 22%, embora não alcançou significância estatística (S2i-S2iii Fig). No entanto, a metformina reduz significativamente a densidade de unidades activados positivos colagénio-I em tumores em 54% neste modelo (Fig S2V). A densidade de unidades activados em tumores positivos de HA PAN02 também foi reduzido em 57% (Fig S2iv), mas não alcançaram significância. Nós mostramos anteriormente que o receptor da angiotensina-II 1 (AT1) é crítico para a produção do colagénio e HA-I em PDACs [43]. Com efeito, observou-se que a metformina foi capaz de reduzir a expressão de AT1 (Fig 2C). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a metformina reduz desmoplasia no PDACs em hospedeiros com sobrepeso /obesidade.

Depois de 10 semanas de dieta rica em gordura, os tumores foram AK4.4 ortotopicamente implantado em ratos FVB obesos. Os animais foram aleatoriamente atribuídos a metformina em água (300 mg /kg) ou nenhum tratamento beber no dia 7 até ao dia 21 quando os tumores foram recolhidos. (A-I) de imuno-histoquímica imagens representativas mostrando o efeito de metformina em hialuronano de tumores e os níveis de colagénio-I em tumores AK4.4 (n = 3-4). (A-II) Quantificação da expressão de hialuronano em tumores AK4.4. A metformina reduz a fracção da área hialuronano-positiva (%). (A-III) Quantificação da expressão de colagénio-I em tumores AK4.4. A metformina reduz a fracção da área de colagénio-I-positiva (%). (BI) de imuno-histoquímica imagens representativas mostrando o efeito da metformina sobre a expressão (co-localização) de níveis de hialuronano e colagénio-I em células estreladas activadas (positivas) αSMA-pancreáticas (PSCs) em tumores AK4.4 (n = 3-4) . (B-ii) Quantificação de expressão de ácido hialurônico em PSCs. A metformina reduz a percentagem de unidades activadas que expressam hialuronano. (B-III) Quantificação da expressão de colagénio-I em unidades. A metformina reduz a percentagem de unidades activadas que expressam o colagénio-I. (C-i), Western blots representativos para-um receptor de expressão da angiotensina-II (AT1) em tumores AK4.4. ß-actina é usado como um controlo para a carga de proteína. (C-ii) A análise densitométrica de expressão AT1 normalizados para ß-actina. A metformina reduz a expressão de AT1. Os dados são apresentados como a média ± erro padrão. * P 0,05 vs. controlo.

A metformina afeta desmoplasia, reduzindo diretamente a sinalização TGF-β e produção de colagénio-I /HA por PSCs

O colagénio-I e HA são essencialmente produzida por activada PSCs em PDACs [43, 61]. Para determinar se o tratamento com metformina pode reduzir diretamente colagénio-I expressão /HA na PSCs, nós incubadas PSCs

in vitro

com metformina. Descobrimos que, a uma dose (1 mM), que não afecta substancialmente a viabilidade das unidades (Fig S3), metformina diminuiu a expressão de HA e de colagénio-I (Fig 3aa-3Aiii). Isto indica metformina actua em unidades para reduzir a produção destes componentes críticos de ECM. Além disso, verificou-se que a metformina (0.1-1mM) reduziu a expressão de AT1, TGF-β e sinalização a jusante via SMAD-2, bem como PDGF-β, todos os jogadores-chave na produção de ECM por PSCs (Fig 3B). Além disso, a metformina afectada também a activação de vias de sinalização canónicos que promovem a activação de PSC e fibrose [62], em particular de ERK, p38, e STAT3, embora em doses relativamente mais elevadas (1-10 mM) (Fig 3B). É importante ressaltar que em tumores inteiros, metformina diminuiu ativação da STAT3 em ambos os modelos, com uma tendência para a ativação do p38 reduzida em PAN02 (S4i-S4iii Fig), sugerindo que a metformina pode acumular em concentrações altas o suficiente para afetar estas vias de sinalização

in vivo

. Tomados em conjunto, estes dados indicam que a metformina afeta desmoplasia, reduzindo diretamente AT1 /TGF-β /sinalização STAT3 e produção de colagénio-I /HA por PSCs.

PSCs (A) foram incubadas

in vitro

com metformina (1 mM) durante 48 h. (A-I) representativos imunocitoquímica imagens que mostram o efeito de metformina em hialuronano de tumores e os níveis de colagénio-I em células estreladas pancreáticos humanos (PSCs)

In vitro

(n = 2). (A-II) Quantificação da expressão de hialuronano em unidades. Metformina diminui a expressão de ácido hialurônico em PSCs. (A-III) Quantificação da expressão de colagénio-I em unidades. A metformina reduz a expressão de colagénio-I em unidades. αSMA denota unidades ativadas. (B) Western blots representativos para a expressão de marcadores relacionados com fibrose e proteínas de sinalização em unidades tratados com metformina, a 0, 0,1, 1 e 10 mM. A metformina reduz a expressão de marcadores relacionados com fibrose e proteínas de sinalização em unidades. A análise densitométrica da expressão da proteína normalizada a ß-actina ou proteína total (no caso de proteínas fosforiladas) é descrito como números por baixo das bandas representativas. Dados em A são apresentados como a média ± erro padrão. * P 0,05 vs. controlo.

A metformina também melhora desmoplasia, impedindo recrutamento e M2 polarização de macrófagos em PDACs

A inflamação que ocorre em PDACs é um componente importante de desmoplasia [63]. Em particular, os macrófagos associados a tumores (TAMs) são uma importante fonte de citocinas que agravam desmoplasia no PDACs [64] e afetam negativamente a evolução da doença [65]. Portanto, determinou-se aqui o efeito da metformina na TAM infiltração em tumores. Descobrimos que os níveis da TAM foram 60% inferiores ao tratamento com metformina no modelo AK4.4 (Fig 4A). Eles também tendem a ser mais baixas (~ 30%, não significativa) no modelo PAN02 (Fig S5A). Para determinar um efeito direto da metformina sobre os macrófagos, nós incubados macrófagos com metformina

in vitro Compra de 48h em concentrações crescentes. Descobrimos que a metformina afectou a viabilidade dos macrófagos em doses de 0,4 mM ou mais elevada (Fig S6). A metformina, a uma concentração de 0,05 mM (semelhantes à concentração medida no plasma de doentes tratados com metformina) reduziu marcadores M2, tais como Arg-1 e IL-10, enquanto a metformina com doses superiores a 0,2 mM reduziu tanto M1 e marcadores M2 (Figura 4B ). Na TAM classificadas fluxo de tumores PAN02

in vivo

, nós, na verdade confirmou um efeito da metformina sobre a expressão de M2 ​​marcadores Arg-1 (~ 1/2) e IL-10 (~ 2/3) sem afectar significativamente a expressão de marcadores M1 (Figura 4C). Em seguida, buscou compreender como a metformina afeta essas células. Diversas vias de sinalização canónicos e não canónicas pode ser activado em PDACs durante a inflamação e promover a expressão de marcadores m2 no MAT [66-69]. Consistente com os efeitos sobre a TAM, a metformina reduz a activação da STAT3, JNK, AKT e p38 em macrófagos

In vitro

em concentrações inferiores a 0,2 mM (Figura 4D). Como mencionado acima, em tumores inteiros metformina diminuiu ativação da STAT3 em ambos os modelos, com uma tendência para a ativação reduzida de p38 em PAN02, em linha com a nossa

in vitro

resultados (S4i-S4iii Fig). Tem sido demonstrado que a actividade da STAT3 é diminuída pela metformina através da activação de energia metabólica sensor de proteína cinase activada por AMP (AMPK) em vários tipos de células [70]. Com efeito, verificou-se que os efeitos inibidores da metformina sobre a sinalização STAT3 em macrófagos

In vitro

associada com a activação da enzima e a jusante AMPKα Acetil-CoA Carboxilase (ACC) (o último evidente apenas em meio de soro adicionado) nestes células (Fig 4D e S7 FIG). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a metformina reduz a infiltração TAM bem como a expressão de marcadores M2, que podem ser mediados, pelo menos em parte, através da AMPK /STAT3 sinalização inibição em macrófagos. Além disso, a inflamação em tumores é caracterizada por um excesso de citoquinas inflamatórias que promovem a desmoplasia, metformina e foi demonstrado que afectam múltiplos mediadores inflamatórios [34, 35]. 0,05, ** p * P * P 0,05, ** p