Abstract

A membrana pentaspan glicoproteína CD133 (também conhecido como prominin-1) tem sido amplamente utilizado como um marcador para tanto células estaminais normais e do cancro. No entanto, a função de CD133 não tem sido elucidado. Descrevemos aqui uma linha celular de cancro da haste estabelecida a partir de carcinoma de células claras do ovário (CAC) e mostram que interage com CD133 placoglobina (também conhecido como γ-catenina), uma proteína ligante desmossomal. Demonstramos ainda que knockdown de CD133 por interferência de RNA (RNAi) resulta na regulação negativa de desmogleína-2, uma caderina desmossomal, e ab-roga a adesão célula-célula e a tumorigenicidade das células estaminais CCC. Nós especulamos que CD133 pode ser um alvo promissor para quimioterapia do câncer

Citation:. Koyama-Nasu R, Takahashi R, S Yanagida, Nasu-Nishimura Y, Oyama M, Kozuka-Hata H, et al. (2013) A Stem Cell Cancer marcador CD133 interage com placoglobina e Controles Desmogleína-2 Níveis de proteína. PLoS ONE 8 (1): e53710. doi: 10.1371 /journal.pone.0053710

editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Setembro, 2012; Aceito: 03 de dezembro de 2012; Publicação: 10 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Koyama-Nasu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa de Biologia celular inovador por Innovative Technology (Análise de Sistemas integrados de celulares oncogênicos Sinalização Networks), Grants-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras (Integrative Pesquisa sobre o Câncer Microenvironment Rede) e de Investigação Científica (C), Takeda Science Foundation e em parte pelo Programa global de COE (Integrative Ciências da vida com base no estudo de Biosignaling Mecanismos), MEXT, Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

células-tronco cancerosas são acreditados para ter a capacidade de proliferar e se auto-renovar e ser responsável por tumorigênese, metástase e recorrência [1], [2]. A presença de células estaminais de cancro tem sido demonstrada em uma variedade de tumores [1]. Em particular, as células estaminais glioblastoma têm sido extensivamente estudada como eles podem ser mantidas em meio isento de soro que favorecem o crescimento de células estaminais neurais [3]. No entanto, ainda é difícil de manter e expandir as células-tronco do câncer derivadas de outros tecidos

in vitro

. No presente estudo, conseguiu estabelecer uma linha de células-tronco do câncer de carcinoma de células claras do ovário (CCC), que tem o pior prognóstico entre os cânceres de ovário epiteliais [4] e mostrar que CD133 interage com placoglobina, controla desmogleínas-2 proteína níveis e é necessária para a adesão célula-célula e tumorigenicidade de células-tronco CCC.

resultados e Discussão

Nós cultivaram células-tronco CCC isolados de um paciente com diagnóstico de CCC em condições isentas de soro. Semelhantes a haste de glioblastoma células [5], as células estaminais CCC cresceram exponencialmente em placas revestidas com laminina, em condições isentas de soro (Fig. 1A e S1A). Como relatado anteriormente por outros cancros [3], [6], [7], as células estaminais CCC sofreu diferenciação quando cultivadas em meio contendo soro (células diferenciadas CCC): eles exibiram uma ligeira alteração morfológica (Fig. 1A), e a níveis de marcadores de células-tronco, como expressão

CD133

[8],

SOX2

[9] e

Lgr5

[10], foram significativamente reduzidos (Fig. 1B) . Quando as células estaminais CCC foram injectados subcutaneamente em ratinhos imunocomprometidos, todos os ratinhos desenvolveram tumores que eram histologicamente semelhante ao seu tumor original (Fig. 1C e S1B). Em contraste, nenhum dos murganhos transplantados com tumores CCC células diferenciadas desenvolvidos, apesar da sua capacidade para proliferar exponencialmente

in vitro

(Fig. 1C e S1A).

(A) da haste CCC e diferenciada (diff) células em cultura. fotografias de contraste de fase são mostrados. (B) Os níveis de ARNm dos genes indicados foram avaliados por RT-PCR quantitativo e mostrado como mudança vezes em relação aos níveis de ARNm em células estaminais CCC. As barras de erro representam o S.D. (

n

= 3). (C) CCC estaminais ou células diferenciadas foram transplantadas subcutaneamente em ratinhos NOG (

N

= 3). Sete meses após o transplante, os ratinhos (superior) e tumores (inferior) foram fotografados. (D) elui a partir de CD133 imunopurificada a partir da fracção de membrana de células estaminais CCC foram resolvidas por SDS-PAGE e visualizado por coloração com prata. proteínas (E) desmossômicas identificadas por espectrometria de massa. Os números de péptidos únicos são mostrados identificados. (F) As amostras foram preparadas como descrito em (D) e imunotransferidas com anticorpos para as proteínas indicadas. (G) Co-localização de CD133 (vermelho) com proteínas desmossômicas (verde). células estaminais CCC foram imunocoradas com anticorpos para as proteínas indicadas. TO-PRO-3 iodeto foi usada para coloração de ADN nuclear (azul). barras de escala representam 20 mm.

A expressão de CD133 é estritamente limitado a uma população rara de células estaminais somáticas e câncer [8]. Por conseguinte, é difícil a obtenção de um número suficiente de células para realizar a análise bioquímica do complexo de proteína contendo CD133. Aproveitando-se da capacidade de células-tronco CCC a crescer exponencialmente e manter os níveis de CD133 alta expressão

in vitro

, nos propusemos a immunopurify o complexo CD133 endógeno. CD133 foi imunoprecipitada a partir da fracção da membrana com anticorpo anti-CD133 e após confirmação por SDS-PAGE e coloração com prata, os imunoprecipitados foram submetidos a cromatografia em espectrometria de massa de líquido (Fig. 1D). Entre as proteínas co-purificado identificados (Tabela S1), que foca nossa atenção para placoglobina e desmoplakin (Fig. 1E), uma vez que são componentes do desmossoma, que medeia a adesão célula-célula [11]. Desmososmas são complexos juncionais constituídos por membros da família da caderina de proteínas de adesão celular e que ligam proteínas que se ligam as proteínas de adesão da superfície celular para filamentos de queratina do citoesqueleto intracelular. Placoglobina e função desmoplaquina como as principais proteínas desmossômicas ligando.

Foi confirmada a capacidade do CD133 para interagir com placoglobina pelo

in vivo

ensaios pull-down. Quando um lisado a partir de células estaminais CCC foi submetido a imunoprecipitação com anticorpo anti-CD133, seguida de imunotransf erência com anticorpos anti-placoglobina, placoglobina foi encontrada para ter co-imunoprecipitada com CD133 (Fig. 1F). Placoglobina não foi detectado quando IgG de controlo foi utilizado para imunoprecipitação. No entanto, os nossos ensaios in

in vitro

pull-down falhou para detectar a co-precipitação de placoglobina com fragmentos contendo domínios citoplasmáticos individuais de CD133 (dados não mostrados). Isso pode ser porque a topologia de membrana de CD133 é importante para a sua associação com placoglobina. Alternativamente, CD133 pode não estar directamente relacionado com placoglobina. Resultados com desmoplaquina foram inconclusivos, como co-precipitada ou com o anticorpo anti-CD133 ou controlar IgG nas nossas condições experimentais.

A análise imunohistoquímica de células-tronco CCC revelou que CD133 e placoglobina co-localizados dentro das regiões de celular contato -cell (Fig. 1G). CD133 coloração não foi detectado quando as células foram infectadas com um lentivírus expressando um shRNA segmentação CD133 (Fig. 2C), indicando a especificidade do anticorpo anti-CD133. Desmoplaquina foi encontrado parcialmente co-localizar com CD133 (Fig. 1G).

células-tronco CCC (A) foram infectados com um lentivírus expressando uma segmentação CD133 shRNA. As células foram submetidas a um stress mecânico por pipetagem em PBS contendo 1 mM de CaCl

2 e MgCl 0,5 mM

2. Imagens representativas são mostradas (superior). O gráfico de barras que representa a relação do número de número de células /cluster (inferior). As barras de erro representam o S.D. (

n

= 3).

p = 0,011

com a comparação para controlar shRNA pelo teste t. (B) As células-tronco do CCC foram tratados tal como descrito em (A). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a imunotransf erência com anticorpos para as proteínas indicadas. (C) As células-tronco do CCC foram tratados tal como descrito em (A). As células foram imunocoradas com anticorpos para as proteínas indicadas (vermelho). TO-PRO-3 iodeto foi usada para coloração de ADN nuclear (azul). barras de escala representam 20 mm. (D) As células-tronco do CCC foram tratados tal como descrito em (A). As células foram transplantadas subcutaneamente em ratinhos imunocomprometidos (

N

= 3). Onze meses após o transplante, os ratinhos (superior) e tumores (meio) foram fotografados. O gráfico de barras representa o peso do tumor (inferior). As barras de erro representam o S.D. (

n

= 3).

p = 0,007

com a comparação para controlar shRNA pelo teste t.

Foi realizada análise imuno-histoquímica de desmogleínas-2 e desmocolina-2, dois cadherins desmossômicas que são expressos em células-tronco do CCC . Descobrimos que essas proteínas também co-localizados com CD133 (Fig. 1G). Em particular, CD133 e desmogleínas-2 tinha padrões de distribuição muito semelhantes. No entanto, nem desmogleína-2 nem desmocolina-2 pode ser detectada em imunoprecipitados de CD133, indicando que não estão fisicamente associados (Fig. 1F). Em contraste, os imunoprecipitados placoglobina foram encontrados para conter CD133, bem como caderinas desmossômicas (Fig. 1F). No seu conjunto, estes resultados sugerem que interage com CD133 placoglobina, mas não com o complexo de proteína contendo desmossomal desmogleína-2 e desmocolina-2.

próxima estudaram o papel de CD133 na regulação da adesão célula-célula. Observou-se que as células estaminais CCC não podia ser prontamente disperso por pipetagem. No entanto, quando as células foram infectadas com um lentivírus expressando um shRNA segmentação CD133, as células poderiam ser disperso por pipetagem (Fig. 2A). Além disso, penduradas ensaios de agregação de células queda demonstraram que as células knockdown CD133 não agregar força e pode ser disperso por pipetagem (Fig. S2). Assim, CD133 pode ser importante para a adesão de células estaminais CCC. Para elucidar o mecanismo subjacente a esta molecular diminuição da adesão célula-célula, foram examinados os níveis de expressão das proteínas desmossômicas. Imunotransferência e de RT-PCR A análise revelou que o knockdown de CD133 resultou numa diminuição nos níveis de proteína de desmogleína-2, mas não

desmogleína-2

ARNm (Fig. 2B e S3A), um resultado que foi confirmado pela imuno-histoquímica (Fig. 2C).

Knockdown de CD133 usando um shRNA distinta também resultou na regulação negativa da desmogleínas-2 (Fig. S3B). Foram obtidos resultados semelhantes com a linha celular epitelial intestinal humano Caco-2, que também expressa a níveis elevados de CD133 [12] (Fig. S3C). Além disso, o knockdown de CD133 levou a uma localização ligeiramente difusa de placoglobina (Fig. 2C). Além disso, verificou-se que knockdown de placoglobina resultou numa diminuição nos níveis de desmogleína-2 da proteína (Fig. S3D, E). Consistente com estes resultados, os ensaios de agregação celular gota em suspensão revelou que knockdown de desmogleína-2 resultou num decréscimo na adesão de células CCC (Fig. S2). Estes resultados sugerem que a CD133 é necessária para a estabilidade e a localização correcta de proteínas desmossômicas.

CD133 é amplamente utilizado para isolar uma variedade de células estaminais do cancro, incluindo CCC do ovário [8], [13]. No entanto, a sua contribuição funcional para tumorigênese tem sido pouco clara. a adesão célula-célula é uma característica inerente de tumores sólidos, e vários relatórios sugeriram que desmogleína-2 é essencial para a tumorigenicidade de vários tumores epiteliais [14]. Deste modo, examinou-se o papel potencial de CD133 na tumorigenicidade de células estaminais CCC utilizando um lentivírus shRNA que codifica para knockdown expressão estavelmente CD133. Ensaios de formação de colónias de agar mole, revelou que knockdown de CD133 resultou numa diminuição na capacidade de formação de colónias de células-tronco CAC (Fig. S4). Além disso, o knockdown de desmogleína-2 também reduziu a formação de colónias. Quando as células CD133-knockdown foram injectados subcutaneamente em ratinhos imunocomprometidos, que cresceu a uma velocidade significativamente reduzida em comparação com as células de controlo (Fig. 2D). Este resultado sugere que CD133 é necessária para a tumorigenicidade de células-tronco CCC.

Neste relatório, nós demonstramos que CD133 interage com placoglobina e controla adesão célula-célula em células-tronco CCC. De particular interesse é o facto de knockdown de CD133 nas células estaminais CCC causado uma redução nos níveis de desmogleína-2. O mecanismo pelo qual o complexo CD133-placoglobina estabiliza desmogleína-2 continua a ser investigado. Em células-tronco hematopoiéticas, CD133 é conhecido por ser enriquecido nos locais de contacto com osteoblastos [15]. Assim, CD133 pode funcionar em ambas as células estaminais normais como um regulador de interacções célula-célula e do cancro. Mostramos ainda que CD133 é importante para a tumorigenicidade de células estaminais CCC. Este resultado é consistente com relatórios anteriores que mostram que desmogleínas-2 está envolvido na tumorigênese [14]. É, portanto, interessante especular que a CD133 e /ou desmogleína-2 podem ser alvos terapêuticos para o cancro de células estaminais epiteliais CD133-positiva.

Materiais e Métodos

tumor e culturas de células de amostra

o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica da Jikei Institutional Review Board, a Escola de Medicina da Universidade de Jikei, Tóquio, Japão. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito. amostra de tumor classificado como carcinoma de células claras do ovário foi obtido a partir de um paciente submetido a tratamento cirúrgico no Hospital Universitário Jikei. Os tumores foram lavadas, e mecanicamente e enzimaticamente dissociada em células individuais. As células de tumor foram cultivadas em laminina (Sigma) -Revestido prato em meio DMEM /F-12 (Life Technologies) contendo suplemento B27 (Life Technologies), EGF e FGF2 (20 ng /mL de cada vez; Wako Pure Chemical Industries). Para

In vitro

diferenciação, as células tumorais foram cultivadas em DMEM /F-12 (Life Technologies) contendo soro fetal bovino a 10%. 293FT e células Caco-2 foram cultivadas em DMEM (Nissui) contendo 10% de soro fetal de bovino.

xenoenxertos subcutâneos

Uma semana depois de infecção por lentivírus, 1 × 10

5 células foram injectados por via subcutânea em ratos NOG 6 semanas de idade (Instituto Central de Animais experimentais) (

n

= 3). Os tumores foram histologicamente analisadas após hematoxilina e eosina (HE). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética animal, da Universidade de Tóquio, Tokyo, Japão. Todos os protocolos experimentais em animais foram realizados de acordo com a política da Comissão de Ética animal, da Universidade de Tóquio, Tokyo, Japão.

RT-PCR quantitativo

O RNA total foi extraído utilizando NucleoSpin RNA Limpo kit -up (Takara) e reverso-transcrito em cDNA usando PrimeScript RT Mix master (Takara). PCR em tempo real foi realizado utilizando LightCycler480 SYBR Green I mestre e um Instrumento LightCycler480 (Roche). Os resultados foram normalizados com o valor detectado para

da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH)

. Os iniciadores utilizados em PCR em tempo real foram como se segue:

GAPDH

para a frente (5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘),

GAPDH

reverso (5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′);

CD133

para a frente (5′-AGTGGCATCGTGCAAACCTG-3 ‘),

CD133

reverso (5′-CTCCGAATCCATTCGACGATAGTA-3′);

SOX2

para a frente (5′-TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA-3 ‘),

SOX2

reverso (5′-CTGGGGCTCAAACTTCTCTC-3′);

Lgr5

para a frente (5′-GATTTCCTGCTTGACTTTGAGG-3 ‘),

Lgr5

reverso (5′-GCAGGTGTTCACAGGGTTTG-3′);

placoglobina

para a frente (5′-GATCTTCCGGCTCAACACC-3 ‘),

placoglobina

reverso (5′-GATGTTCTCCACCGACGAGT-3′);

desmogleínas-2

frente (5′-GGAAATTTTCAAGCTTTTGATGA-3 ‘),

desmogleínas-2

reversa (5′-CCACAGAGATCCAATTATCTCTATCTT-3′).

Os anticorpos

foi obtida anticorpo monoclonal (mAb) para CD133 (AC133) da Miltenyi Biotec. MAb de murganho para desmocolina-2/3 (7G6), desmogleína-2 (6d8) e α-tubulina foram de Santa Cruz Biotechnology. MAb de murganho para a placoglobina foi da BD Biosciences. MAb de murganho para GAPDH foi de Millipore. MAb de murganho para desmoplakin (2Q400) foi de Abcam e utilizado para imuno-histoquímica. anticorpo de coelho policlonal (PAB) de desmoplakin a partir de Abcam foi utilizado e para imunotransferência.

A imunoprecipi tacão e imunotransferência

A fracção de membrana de células foi lisada em tampão de lise [mM de HEPES-NaOH 50 mM pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% de NP40, 1 mM de ditiotreitol e cocktail de inibidor de protease (Roche)] (Fig. 1D). Alternativamente, a fracção de membrana foi lisadas em tampão de lise contendo 1% de digitonina em vez de NP40 (Fig. 1F). Os lisados ​​foram incubados com anticorpo anti-CD133, anti-IgG1 de controlo placoglobina ou imobilizada a Activated CH-Sepharose 4B (GE Healthcare) durante 4 h a 4 ° C. Após cinco lavagens com tampão de lise, as proteínas ligadas foram eluídas com Glicina mM-HCl a 100 e submetido a digestão com tripsina. Depois de retirado o sal com ZipTip (C18; Millipore), a amostra foi submetida a espectrometria de massa de cromatografia de líquido. Para imunotransferência, as proteínas eluidas foram fraccionadas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore). A membrana foi sujeita a análise de imunotransf erência usando alcalina anti-ratinho conjugado com fosfatase ou IgG de coelho (Promega) como anticorpos secundários. A visualização foi realizada utilizando o sistema de substrato colorimétrico NBT /BCIP (Promega).

Mass análise por espectrometria e Proteína Identificação

Shotgun análises proteômicas foram realizadas por um ion linear espectrômetro de massa trap-Orbitrap (LTQ- Orbitrap Velos, Thermo Fisher Scientific) acoplado com o sistema nanofluxo LC (Dina-2A, KYA Technologies) tal como previamente descrito [16]. identificação de proteínas foi realizada através de pesquisa de dados MS e MS /MS contra a RefSeq (National Center for Biotechnology Information) do banco de dados proteína humana (32,968 sequências de proteínas a partir de 12 de setembro de 2011), utilizando Mascot ver. 2.3.02 (Matrix Science). oxidação de metionina, a acetilação de proteínas N-terminal e piro-glutamination por glutamina no terminal N foram definidos como modificações variáveis. Um máximo de dois clivagens perdidas foi permitido em nossa busca de banco de dados e a tolerância para o desvio em massa foi ajustado para 3 partes por milhão (ppm) para massas peptídicas e 0,8 Da para MS /MS picos, respectivamente. identificação de proteínas foi baseada no critério de ter pelo menos um de dados MS /MS com pontuações Mascot que excedeu os limites (

p Art 0,01).

RNA Interferência

as sequências de oligonucleótidos shRNA foram as seguintes: CD133 # 1 (5′-GGAUACACCCUACUUACUAAA-3 ‘), CD133 # 2 (5′-GCACUCUAUACCAAAGCGUCA-3′), desmogleína-2 # 1 (5’-GUUAGCGAGAGCAUGGAUAGA-3 ‘), desmogleína -2 # 2 (5’-GCAUUAUCAGUAAUAAUUUGU-3 ‘), placoglobina (5′-GAGCAUGAUUCCCAUCAAUGA-3’).

Lentivírus Produção

Lentivirus vetor (CS-RFA-CG) expressando uma shRNA dirigido pelo promotor H1 foi transfectada com os vectores de embalagem pCAG-HIV-gp e pCMV-VSV-G de RSV-Rev-293FT em células utilizando Lipofectamina 2000 Transfection Reagent (Life Technologies). Todos os plasmídeos foram gentilmente cedidas por H. Miyoshi (RIKEN Bioresource Center, Japão). sobrenadante viral foi purificado por ultracentrifugação a 25000 rpm durante 90 min (rotor SW28, Beckman). A eficiência de infecção foi monitorizada pela expressão da proteína de fluorescência verde (GFP), como é dirigido pelo promotor de CMV.

A imuno-histoquímica

As células foram plaqueadas sobre lamelas de vidro revestidas com laminina e fixadas com metanol arrefecido com gelo . As células foram incubadas com anticorpos primários seguido de incubação com anticorpos secundários conjugados com Alexa 488 ou 594 (Life Technologies). Para visualização CD133, as células foram incubadas com anticorpo anti-CD133 conjugado com R-ficoeritrina. TO-PRO-3 iodeto de (Life Technologies) foi usado para a coloração do ADN nuclear. As células foram fotografadas com um LSM510 META microscópio de varredura a laser (Carl Zeiss).

celular dissociação Ensaio

5 × 10

4 células foram semeadas em placas de 12 poços revestidas com laminina. As células foram destacadas das placas de cultura com um raspador de células e passada 10 vezes através de uma ponta de pipeta de 200 ul em PBS contendo 1 mM de CaCl

2 e MgCl 0,5 mM

2. As imagens foram capturadas por microscopia de contraste de fase. O grau de dissociação de células foi representada pela razão entre o número o número de células /cluster.

gota em suspensão celular Ensaio de Agregação

As células foram tripsinizadas, lavadas com PBS e ressuspensas a 5 x 10

5 células por mililitro em meio. 7,5 × 10

3 células foram suspensas em gotas pendurado a partir da tampa da placa de cultura e deixada durante a noite para se agregar. Para trituração, as células foram passadas 10 vezes através de uma ponta de pipeta de 200 mL. As imagens foram capturadas por microscopia de contraste de fase. O tamanho das partículas foi medido utilizando o software ImageJ 1.46r.

Apoiando informação

Figura S1.

Caracterização de células-tronco CCC. cinética (A) proliferação de células-tronco CCC. CCC estaminais e células (diff) diferenciadas foram cultivadas durante os tempos indicados. O gráfico de barras representa o dia (

x

-axis) e celular número (

y

-axis). (B) A análise histopatológica de xenoenxertos tumorais. Coloração HE de um células-tronco CCC tumor xenoenxerto e paciente é mostrado

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s001

(TIF)

Figura S2.

CD133 e desmogleínas-2 são necessários para a adesão de células-tronco CCC. células estaminais CCC foram infectadas com um lentivírus expressando um shRNA segmentação CD133 ou desmogleína-2. As células foram semeadas em culturas de suspensão da gota e deixou-se agregar durante a noite. Antes de (-) e depois (A trituração células) foram submetidos a tensão mecânica por pipetagem, as imagens foram capturadas por microscopia de contraste de fase (superior). O gráfico de barras que representa o tamanho médio de partícula em relação a células que expressam shRNA controlo (mais baixo). As barras de erro representam o S.D. (

n

= 3). NS, não significativo; *,

p Art 0,05 pelo teste t

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s002

(TIF)

Figura S3.

CD133 e placoglobina controlar os níveis de desmogleínas-2 expressão. células-tronco CCC (A) foram infectados com um lentivírus expressando uma segmentação CD133 shRNA. Os níveis de ARNm dos genes indicados foram avaliados por RT-PCR quantitativo e mostrado como mudança vezes em relação aos níveis de ARNm em células que expressam shRNA controlo. As barras de erro representam o S.D. (

n

= 3). (B) As células-tronco do CCC foram infectadas com um lentivírus expressando uma segmentação CD133 shRNA (2 CD133 shRNA #). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a imunotransf erência com anticorpos para as proteínas indicadas. células (C) Caco-2 foram infectadas com um lentivírus expressando uma segmentação CD133 shRNA. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a imunotransf erência com anticorpos para as proteínas indicadas. (D) As células-tronco do CCC foram infectadas com um lentivírus expressando um placoglobina segmentação shRNA. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a imunotransf erência com anticorpos para as proteínas indicadas. (E) células estaminais CCC foram tratados tal como descrito em (D). Os níveis de ARNm dos genes indicados foram avaliados por RT-PCR quantitativo e mostrado como mudança vezes em relação aos níveis de ARNm em células que expressam shRNA controlo. As barras de erro representam o S.D. (

n

= 3)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s003

(TIF)

Figura S4.

CD133 e demoglein-2 são necessários para o crescimento independente de ancoragem de células estaminais CCC. células estaminais CCC foram infectadas com um lentivírus expressando um shRNA segmentação CD133 ou desmogleína-2. As células foram semeadas em agar mole, e cultivadas durante 2 semanas. O gráfico de barras representa o número de colónias em relação a células que expressam shRNA controle. As barras de erro representam o S.D. (

n

= 4). *,

p Art 0,05 com relação ao controle shRNA pelo teste t

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s004

(TIF)

Tabela S1.

lista completa de peptídeos identificados na análise por espectrometria de massa.

doi: 10.1371 /journal.pone.0053710.s005

(XLSX)