Sumário

L-asparaginase que tem baixa glutaminase foi um agente terapêutico fundamental no tratamento da leucemia aguda lymphpoblastic (A.L.L). No presente estudo, uma L-asparaginase extracelular com baixa actividade de glutaminase, produzido por

Bacillus licheniformis

foi purificado até à homogeneidade. A proteína foi encontrado para ser um homotetrâmero de 134,8 kDa com tamanho monomérico de 33,7 kDa e muito específico para o seu substrato natural,

i.

L-asparagina. A actividade da L-asparaginase purificado aumentada em presença de catiões de Na incluindo

+ e K

+, ao passo que foi moderadamente inibida na presença de catiões divalentes e reagentes de tiol grupo de bloqueio. A enzima purificada foi maximamente activo ao longo da gama de pH 6,0-10,0 e a temperatura de 40 ° C e a enzima era estável máxima a pH 9,0 e -20 ° C. Os espectros de CD de L-asparaginase previu a enzima consistir em 63,05% hélice α- e 3,29% de p-folhas, na sua forma nativa com o t

222 de 58 ° C. espectroscopia fluorescente mostrou que a proteína de ser estável, mesmo na presença de mais de 3 m GdHCl. Os parâmetros cinéticos K

m, V

max e K

gato da enzima purificada foram encontrados como 1,4 × 10

-5 M, 4,03 IU e 2,68 × 10

3 s

– 1, respectivamente. O purificada L-asparaginase teve atividade citotóxica contra várias linhas de células cancerígenas

viz.

Clone Jurkat E6-1, MCF-7 e K-562 com IC

50 de 0,22 UI, 0,78 UI e 0.153 UI, respectivamente . No entanto, a enzima não teve nenhum efeito tóxico sobre eritrócitos humanos e linhas celulares CHO, portanto, deve ser considerado candidato potencial para uma maior utilização farmacêutica como uma droga anticâncer

Citation:. Mahajan RV, Kumar V, Rajendran V, Saran S, Ghosh PC, Saxena RK (2014) purificação e caracterização de uma nova e robusta L-asparaginase Tendo Low-Glutaminase Atividade de

Bacillus licheniformis: In Vitro

Avaliação do anti-cancerosos Propriedades. PLoS ONE 9 (6): e99037. doi: 10.1371 /journal.pone.0099037

Autor: Philip C. Trackman, Boston University Goldman Faculdade de Medicina Dentária, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de fevereiro, 2014; Aceito: 09 de maio de 2014; Publicação: 06 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mahajan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O autor Richi V. Mahajan graças Conselho de Pesquisa Científica e industrial (CSIR), Nova Deli, para o apoio comunhão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, as despesas de equipamento de experimentação e de produtos químicos, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

a incapacidade das células leucémicas de sintetizar a sua própria asparagina-L fez com que a enzima L-asparaginase um componente chave da quimioterapia no tratamento de leucemia linfoblástica aguda (LLA) [1] , [2]. Esta enzima hidrolisa L-asparagina em ácido L-aspártico e amoníaco em sistema vascular arterial, tornando as células leucémicas desprovidas de essencial exógena de L-asparagina, conduzindo à inibição da síntese de proteínas e a apoptose [3] – [5], por conseguinte, tornando esta enzima um agente anti-cancerígeno potente.

A oferta comercial atual de L-asparaginase é principalmente derivado de

E. coli

e

Erwinia chrysanthemi

mas o fármaco a partir destas fontes são fortemente imunogénica, por conseguinte, neutralizando os efeitos terapêuticos e fazendo com que os sintomas em mais de 50% dos casos de cancro [6]. Além disso, muitos estudos têm observado o aumento no número de pacientes com resistência clínica para o medicamento no mercado actual [6] – [8]. A L-asparaginase comercial verificou-se ter

In vitro

resistência contra as células de pacientes com recidiva A.L.L [9]. Outro problema associado com os L-asparaginases comerciais é a sua baixa especificidade de substrato e elevada actividade de glutaminase, o que pode causar disfunção hepática, pancreatite, leucopenia, convulsões neurológicas, e anomalias de coagulação que levam a trombose ou hemorragia intracraniana [10]. Por conseguinte, existe uma necessidade de novos e L-asparaginases robustas de GRAS (

Geralmente Reconhecido como Seguro)

microorganismos que melhorou a estabilidade, a actividade de glutaminase inferior com alta afinidade para o substrato, de baixo K

m e valor metade suficiente -life sob condições fisiológicas para que ele possa superar os desafios enfrentados no atual cenário acima indicado.

Portanto, o presente estudo é voltado para purificar L-asparaginase de

Bacillus licheniformis

RAM-8 (solo Isolate), que foi confirmado para ser um romance L-asparaginase e foi avaliada por suas características biofísicas e bioquímicas e seu potencial como um agente anticancerígeno contra diferentes linhas de células cancerosas humanas.

Materiais e Métodos

declaração de Ética:

as amostras de sangue no atual trabalho foram obtidos a partir Rotary sangue em branco, Nova Deli como um dom e estas amostras de sangue estão comercialmente disponíveis no Banco de sangue Rotary para fins de pesquisa. aprovação do comitê de ética não é necessário para a obtenção de sangue humano para fins de pesquisa. Temos vindo a utilizar sangue humano para fins de pesquisa obtidos a partir Rotary Banco de Sangue e publicado no mesmo anteriormente [11].

2.1 Química

Os produtos químicos utilizados para a purificação da enzima (matrizes cromatográficas) e caracterização foram adquiridos de Sigma Aldrich. reagente de Nessler foi adquirido à Fluka (Buchs, Suíça). L-asparagina foi comprado de Spectrochem (India). Todos os produtos químicos utilizados na produção foram de grau analítico e foram adquiridos da Hi-Media (Índia). Produtos químicos e marcadores usados ​​em PAGE nativa e SDS foram obtidos a partir de BioRad.

2.2 L-asparaginase Produção

produção de L-asparaginase por

Bacillus licheniformis

RAM-8 (isolada de solo ; identificados com base em 16 s de ARN e análise de pb 500; Midi-Labs, EUA) foi realizada em meio Czapek Dox optimizado modificado [12]: na

2HPO

4, 6 g /L; KH

2 PO?

4, 2 g /L; NaCl, 0,5 g /L; L-asparagina, 20 g /L; glicerol, 2 g /L; MgSO

4.7H

20, 0,2 g /L; CaCl

2,2H

2O, 0,005 g /L. Os frascos contendo o meio de produção (50 ml em frasco de 250 ml) foram inoculadas com 2% de inoculo (v /v) (2,0 O. D.). A incubação foi realizada a 37 ° C a 200 rpm durante 24 h. A produção da enzima foi extracelular e a actividade da enzima foi determinada usando-se o filtrado de cultura. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e os valores médios com desvios-padrão (DP) foram calculados.

2.3 Ensaio Enzimático

Ensaio de enzima foi realizada de acordo com o procedimento nesslerization dada pelo Shirfrin

et al

. [13], utilizando 189 mM de L-asparagina como substrato ou mencionado em contrário, em 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,6) e lendo a absorvância a 436 nm. solução de sulfato de amónio foi usado para a preparação da curva padrão. Uma unidade internacional (UI) de actividade de asparaginase é definida como a quantidade de enzima requerida para libertar um mole de amoníaco por ml por minuto a pH 8,6 a 37 ° C.

2,4 Enzima A purificação

2.4.1 ultrafiltração.

o caldo de fermentação isento de células foi sujeita a ultrafiltração com um cartucho de membrana de 30 kDa, para remover as proteínas menores e de se concentrar a proteína desejada. Retido e permeado recolhido após ultrafiltração foram analisados ​​para a actividade a L-asparaginase e a concentração de proteína utilizando o método de Bradford [14]. Precipitação

2.4.2 acetona.

acetona arrefecida (-20 ° C) foi adicionado ao caldo concentrado, com agitação constante, a 4 ° C na concentração de gradiente de 20 a 80%, para as proteínas a precipitar. As fracções que mostram a actividade máxima foram centrifugadas seco ao ar e dissolvido em uma quantidade mínima de Tris HCl 50 mM (pH 8,6) e dialisado contra o mesmo tampão para se obter a proteína concentrada.

2.4.3 cromatografia em celulose DEAE

.

a enzima concentrada foi aplicada à coluna de dietilaminoetil celulose (celulose DEAE) (4 × 60 cm) equilibrada com 50 mM de Tris-HCl (pH-8,6). A coluna foi lavada com 2 volumes de tampão inicial e a proteína foi eluida com um gradiente linear de NaCl (0-0,5 M) preparado em tampão de fosfato de pH 7,4 a uma taxa de 60 ml por hora. As fracções que apresentam uma actividade de L-asparaginase foram reunidas dialisada contra 50 mM de Tris-HCl (pH 8,6) e concentradas com concentradores banco de proteína superior a 4 ° C.

2.4.4 A filtração em gel.

a solução de enzima concentrada foi adicionada no topo de Sephadex coluna G-100 (4 x 60) cm equilibrada com Tris-HCl 50 (pH 8,6) e eluída com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 0,5 ml por minuto. As fracções que apresentam uma actividade de L-asparaginase foram reunidas e dialisadas contra o mesmo tampão e liofilizou-se com bancada liofilizador. A homogeneidade da proteína foi verificada por SDS PAGE e nativa.

2.5 Caracterização de Purificada L-asparaginase

2.5.1 Determinação do peso molecular.

O L- purificada asparaginase foi aplicada sobre Sephacryl ™ S-200 da coluna de alta resolução (Pharmacia, 16/60), equilibrada com Tris-HCl 50 mM (pH-8,6) e eluidas a um caudal de 0,5 ml por minuto [15]. As proteínas padrão de marcadores moleculares foram aplicados à coluna e o volume de eluição (v

E) de cada proteína marcadora e volume vazio (V

o) da coluna foram registados. A massa molecular da proteína foi determinada num gráfico semi-log locando V

E /V

ó em eixo X e o logaritmo do peso molecular no eixo Y.

2.5.2 efeito do pH e da temperatura sobre a actividade e a estabilidade da enzima.

a actividade da L-asparaginase foi avaliada em diferentes valores de pH e temperatura. o pH óptimo para a actividade de L-asparaginase foi determinada ao longo de um intervalo de pH de 4 a 10. Para os estudos de estabilidade do pH, as preparações de enzima foram incubadas a pH de 4-10 durante 24 h a 4 ° C e a actividade residual foi determinada sob condições de ensaio ( pH 8,6, 50 mM). A gama de temperatura óptima para a actividade da enzima foi determinada através da realização do ensaio de enzima a diferentes temperaturas variando de 25 a 65 ° C. Além disso, a estabilidade ao calor da enzima foi determinada por incubação da enzima liofilizado a diferentes temperaturas

viz

-20 ° C, 4 ° C, 10 ° C, 30 ° C e 60 ° C durante 30 dias.

especificidade

2.5.3 substrato.

as actividades enzimáticas foram avaliadas com diferentes amidas como substratos,

viz.

L-asparagina, D-asparagina, L-glutamina, D-glutamina, L -aspártico, ácido D-aspártico, ácido L-glutâmico, L-ornitina e ureia, em concentrações de 10 mM, respectivamente. Os resultados foram apresentados nos termos de actividade relativa percentual.

2.5.4 Efeito de vários iões metálicos, componentes do soro e inibidores sobre a actividade da enzima.

Foi determinada

Efeito de diferentes íons inorgânicos na atividade da enzima por pré-incubação da enzima com diferentes sais, na concentração de 100 mM durante 6 horas a 4 ° C. Além disso, o efeito do soro, componentes e inibidores de soro (de sulfidrilo e serina) foi determinada incubando a enzima na concentração de 10 mM efectoras durante 6 horas a 4 ° C. Os resultados foram apresentados nos termos de actividade relativa percentual.

2.5.5 Parâmetros cinéticos.

O

V

max,

K

m

,

k

gato, e

k

cat /

K

m

foram determinados a 25 ° C usando L-asparagina como substrato, nas concentrações que variam de 2 a 20 mm, com a concentração de enzima constante de 1 mg /ml. Calculou-se a taxa de turnover inicial em dez concentrações diferentes de substrato, e o tipo de inibição e parâmetros de Michaelis-Menten foram determinadas a partir de gráficos Lineaweaver-Burk, utilizando a equação derivada a partir da análise por regressão linear da curva. O

k

valor gato foi calculada pela aplicação da equação

k

cat =

V

max /[E], onde [E ] é a concentração da enzima no ensaio. k

gato e constantes de especificidade (k

cat /K

m) foram calculados com base em um sítio activo por 33,7 subunidade kD como descrito por Kumar

et al

. [16].

2.5.6 dicroísmo circular.

espectros CD foram gravadas em um JASCO J-815 espectropolarímetro (JASCO Corporation, Hachioji-shi, Tokyo, Japão), utilizando uma célula de quartzo cilíndrica de comprimento de percurso de 1 mm e 1 cm, respectivamente, para a região de UV distante e quase-. Mudanças na estrutura secundária e terciária da proteína foram monitorados na região de longe e de perto -UV entre 190-260 nm e 260-320 nm, respectivamente. Três varreduras espectrais consecutivos foram avaliados e corrigidos subtraindo espaços correspondentes e submetido a redução de ruído. O padrão de transição desdobramento de purificado L-asparaginase foi monitorada de longe CD espectroscopia UV, onde as mudanças na intensidade do sinal a 222 nm foram comparados com a função da temperatura.

2.5.7 Espectroscopia de fluorescência.

as medições de fluorescência foram realizadas utilizando Eclipse Varian Cary UV-Vis espectrofluorímetro (Varian, Inc. Hansen Way, Paio Alto, CA, EUA) ligado a um controlador de temperatura de Peltier. Um comprimento de onda de excitação de 280 nm com uma fenda de excitação de 5 nm e uma fenda de emissão de 5 nm foi utilizado e a fluorescência foi registada a partir de 300 nm a 400 nm. Revelação padrão e a estabilidade da proteína foi determinada utilizando 0-6 M de guanidina HCl (GdHCl) como descrito por Bansal

et ai.

, [17]. A intensidade de fluorescência foi representada graficamente em função do comprimento de onda utilizando M

400 nm como a linha de base.

2.5.8 A sequenciação N-terminal de L-asparaginase.

De modo a confirmar a identidade da proteína, amostras de proteína correspondentes a uma massa molecular de 33,7 kDa em SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilo (PVDF) (Sigma-Aldrich, EUA) e submetido a determinação da sequência de aminoácidos N-terminal usando uma proteína automatizada sequenciador PPSQ31A (Shimadzu, Japão).

2.6 Anti-tumor Aplicação da L-asparaginase de

Bacillus licheniformis

2.6.1 células e condições de cultura de células.

As propriedades anticancerígenas de purificado L-asparaginase foram avaliados em diferentes linhas celulares tumorais humanas

viz. clone

Jurkat E6-1, MCF-7 e K-562 (obtido a partir de NCCS, Pune). As células de Jurkat e de K-562 foram crescidas como uma suspensão em meio RPMI-1640 e MCF-7 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com calor a 10% de FBS inactivado (Sigma), penicilina (100 ug /ml) e estreptomicina (100 ug /ml ). As células foram mantidas sob uma atmosfera totalmente humidi ficada de ar ambiente 95% e 5% de CO

2 a 37 ° C.

Medição viabilidade

2.6.2 celular.

O efeito anti-proliferativo de L-asparaginase foi medida pelo ensaio colorimétrico que mede a redução de amarelo de 3- (4,5-dimethythiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT) pela desidrogenase mitocondrial succinato de um material insolúvel, colorido ( roxo) do produto formazan escuro que é solubilizado no solvente orgânico e medida espectrofotometricamente. Resumidamente, as células foram plaqueadas a uma densidade celular de 1 x 10

4 células /poço no fundo plano padrão microplacas de 96 poços. A L-asparaginase purificada (100 UI /mg) foi diluída em série em meio incompleto e adicionado às culturas de células numa concentração final 0,75-25 ug /ml. Após incubação durante 24 horas, 20 ul de MTT a uma concentração de 5 mg /ml em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) foram adicionados a cada poço. Após 4 h de incubação, as placas foram centrifugadas a 2000 rpm durante 10 min, após o que as placas foram rapidamente invertido com um movimento firme para remover o meio de cultura. Para solubilizar os precipitados de forma zan por adição de 150 ul de mistura 01:01 de etanol e DMSO foram adicionados a cada poço e as placas foram ainda incubadas durante 20 min à temperatura ambiente. A absorvância foi então determinada por espectrofotometria leitor de microplacas Tecan infinita 200 Pro, num comprimento de onda de teste de 550 nm e um comprimento de onda de referência de 620 nm.

2.6.3

In vitro

teste de hemólise.

a L-asparaginase purificada foi testada quanto à hemólise in vitro por incubação de concentrações crescentes da enzima (6,25 ug a 100 ug) com sangue total humano heparinizado (obtido a partir de Rotary Blood Bank, Nova Deli) em tampão fosfato ( pH 7,2) durante 24 h como descrito por Lubran [18]. A reacção foi terminada por adição de 2,5% de glutaraldeído, após 24 h de incubação e, em seguida, centrifugada. O sobrenadante foi lida a 540 nm contra o controle negativo ou seja, amostra sem enzima. A preparação de sangue humano em água destilada duas vezes foi tratada como controle positivo.

Resultados

3.1 Purificação de L-asparaginase e massa molecular Determinação

A purificação gradual de L- asparaginase de

Bacillus licheniformis

RAM-8 tem sido apresentados na Tabela 1 e Figura 1a. A série de passos de cromatografia foram muito eficazes e deu purificação global de 33 vezes. O conteúdo de proteína final da L-asparaginase purificado foi de 15,25 mg, com o rendimento de 32,95%. A actividade específica da enzima foi purificada 697,09 UI /mg de proteína. A proteína foi encontrada para ter o tamanho molecular de 134,8 kDa (Figura 1b), como determinado por meio de cromatografia de filtração em gel e tamanho monomérico de 33,7 kDa confirmada por SDS-PAGE. O IEF teórico da enzima foi calculada em 5,48.

3.2 Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade de L-asparaginase

purificada L-asparaginase a partir de

Bacillus licheniformis

RAM-8 foi ativos ampla faixa de pH de 6-11, com atividade máxima em pH 9 (Figura 2a). É evidente a partir da Figura 2c que a enzima purificada era activo na gama de temperaturas de 30-50 ° C e mostrou uma decente íngreme em actividade acima de 60 ° C. Além disso, a enzima era estável maximamente na gama de 7,0 a pH 9,0 ao longo do período de 24 horas (Figura 2b). A temperatura mais adequada para o armazenamento da enzima foi encontrado para ser -20 ° C altura em que foi ainda estável após 30 dias de manutenção (Figura 2d).

100% de actividade corresponde a 140 U de enzima. As barras de erro representam DP de três experiências.

3.3 Efeito de íons metálicos, componentes do soro e inibidores de L asparaginase-Activity

É evidente a partir da Figura 3a essa enzima actividade aumentada consideravelmente na presença da maioria dos catiões monovalentes e foi máxima na presença de na

+, K

+ e Mg

++. No entanto, os outros catiões divalentes tinham efeito negativo sobre a actividade da enzima. A enzima manteve actividade superior a 80% na presença de inibidores de proteases viz. PMSF PBA indicando assim que não é uma hidrolase serina. Não havia diminuição de 60% na actividade da L-asparaginase de

Bacillus licheniformis

RAM-8 na presença de inibidores de sulfidrilo. Além disso, agentes de dissociação ureia e EDTA inibiu a actividade em 70% (Figura 3b).

Actividade

100% corresponde a 140 U de enzima. As barras de erro representam DP de três experiências.

L-asparaginase actividade entanto purificado era robusta a pH e temperatura fisiológicos, mas a actividade da enzima diminui aproximadamente 40%, quando a L-asparaginase purificada foi incubada com humanos soro e seus componentes, respectivamente, do

in vitro

condições de 48 horas em que a avaliação detalhada obteve-se que o lactato, piruvato e oxilato exibiu mais de 70% de inibição (Figura 3c).

3.4 Substrato especificidade

O purificado L-asparaginase apresentaram alta especificidade contra o seu substrato natural ou seja, L-asparagina. No entanto, menos de 10% e a actividade contra 1% D-asparagina e L-glutamina, respectivamente, foi observada (Figura 3D). Nenhum outro substrato foi encontrado para interagir com a enzima em sua forma pura.

3.5 Kinetic Parâmetros

O enredo Lineweaver Burk na Figura 4 infere que K

m e V

max de L-asparaginase purificada a partir de

Bacillus licheniformis

RAM 8 usando L-asparagina como substrato foi de 1,4 × 10

-5 M e 4,03 IU, respectivamente, e número de turnover (K ​​

cat) da enzima foi determinado a ser 2,68 × 10

3 s

-1. (K

cat /K

m) da enzima foi encontrado para ser 1.503 × 10

6 M

-1S

-1.

K

m = 1,4 × 10

-5 MV

max = 4,03 UI /mg.

3.6 Dicroísmo Circular

espectro de CD de purificado L-asparaginase deu elipticities negativos a 208 e 222 nm (Figura 5a). A análise k2D do espectro de CD no UV distante 240-200 nm previu APHA hélice para ser 63,05% e beta folhas deve ser de 3,29% e T

m de proteínas verificou-se ser de 58 ° C, que indicam a sua razão de íngreme decente na actividade enzimática quando testado foi acima de 60 ° C (Figura 5b). Os espectros de CD no UV próximo da proteína deu elipticities negativos na gama de 260-290 como apresentado na Figura 5c.

C). UV próximo espectros de CD purificada L-asparaginase de 1,0 mg /ml em 0,1 M Tris-HCl (pH-8,4).

3,7 espectroscopia de fluorescência

A proteína L-asparaginase purificada mostrou máximo de fluorescência a 323 nm, na sua forma nativa, na ausência de GdHCl, no entanto um deslocamento a 352 nm foi observada quando a 6 M foi adicionado GdnCl indicando assim o seu desdobramento completo como apresentada na Figura 6. a fluorescência mais elevada foi observada na proteína na sua desdobrado estado frio

nm (excitação comprimento de onda: 292 nm).. e desdobramento transições de L-asparaginase a 0 M, 3 M e 6 HCl M guanidina

3.8 Sequenciação N-terminal de L-asparaginase

as amostras de proteína correspondentes a massa molecular de 33,7 kDa em SDS-PAGE foram transferidas a uma membrana de difluoreto de polivinilo (PVDF) (Sigma-Aldrich, EUA) e foram submetidos ao amino N-terminal determinação da sequência de ácido utilizando um sequenciador de proteínas automatizado PPSQ21A (Shimadzu, Japão). A sequência dos primeiros 15 resíduos de ácidos aminados N-terminal foi encontrado para ser DNKKVEAATGGTQAG que mostrou uma grande variação com a sequência de proteína conhecida e relatada de L-asparaginase.

3,8 Efeito anti-proliferativa da L-asparaginase

A actividade anti-proliferativa de L-asparaginase foi monitorizada contra três linhas celulares tumorais humanas diferentes viz. clone Jurkat E6-1, MCF-7 e K-562. A IC

50 de L-asparaginase purificada a partir de

Bacillus licheniformis

RAM-8 verificou-se altamente eficaz contra as linhas de células leucémicas viz. do clone E6-1 de Jurkat linhas de células e linhas de células K-562 com CI

50 UI de 0,22 e 0,15 IU, respectivamente (Figura 7). A linha celular de cancro da mama MCF-7 também mostrou um crescimento retardado contra as concentrações crescentes e mostrou um IC

50 de 0,78 UI.

3,9

In vitro

hemólise de teste para testar a Toxicidade de drogas

a L-asparaginase incubadas com o sangue heparinizado mostrou nenhum efeito, mesmo na concentração de 100 ug /ml (figura 8). Além disso, a droga não tem o efeito inibidor na linha de células de ovário de teste de hamster chinês (CHO) células, portanto, o fármaco pode ser considerado seguro para as outras

In vivo

avaliações

A:. Negativa controlo (sem L-asparaginase); B: controle positivo (com água destilada duas vezes); C: 100 ug /ml; D: 50 ug /ml; E: 25 ug /ml; F: 12,5 ^ g /ml; G:. 6,25 mg /ml de L-asparaginase

Discussão

Purificação de L-asparaginase de

Bacillus licheniformis

RAM-8 foi conseguido através de ultra- filtração, precipitação com 80% de acetona, cromatografia em DEAE celulose e filtração em gel Sephadex G-100, respectivamente. L-asparaginase de

Bacillus licheniformis

RAM-8 foi purificado até à homogeneidade aparente com a dobra de purificação de 30,17 e um rendimento de 32,95%, onde a actividade específica da enzima aumentou de 23,10 IU /mg e 697,09 UI /mg. A proteína tinha um peso molecular de 134,8 kDa mas monomérica tamanho de 33,7 kDa, por conseguinte poderia ser possível um homotetrâmero. Esses achados estão de acordo com os relatórios anteriores que indicam que bactérias L-asparaginase é uma homotetrâmero [19] – [21]. O IEF teórica de enzima foi calculado como sendo 5,48, próxima da L-asparaginase de

E. coli

(IEF 5), mas diferente do de

Erwinia

(IEF 8.7) [16], [22]. Purificado L-asparaginase de

Bacillus licheniformis

RAM-8 foi funcionalmente estável e ativos ampla faixa de pH e temperatura, e mostrou a actividade óptima em condições fisiológicas. Assim, a L-asparaginase este foi mais robusta, em comparação com a L-asparaginase de

E. coli

e

Erwinia

[16], [22] – [23]. A maioria dos catiões monovalentes, Mg

++ e açúcares no soro aumentou a actividade da enzima, enquanto que a actividade de enzima diminuída na presença de outros catiões divalentes e ácidos orgânicos de soro. A este respeito, a enzima foi semelhante ao

Erwinia

L-asparaginase [24]. O efeito inibitório de catiões divalentes, tais como Ca

++ e ácidos orgânicos de soro pode ser superado através da captura da enzima em lipossomas que podem mascarar o efeito inibitório. O aprisionamento de enzima pode prolongar ainda mais a meia-vida do plasma e também reduzir a imunogenicidade, melhorando ainda mais a eficácia terapêutica em comparação com a enzima livre [25]. Actividade de L-asparaginase diminuiu significativamente em 60% em presença de inibidores de sulfidrilo, o que pode ser devido à presença de grupos SH livres com os sítios activos de enzima [26]. A enzima mostrou ser muito específico para o seu substrato natural de L-asparagina, com actividade de glutaminase menos do que 1%. No entanto, o

E. coli

a L-asparaginase é associada com a actividade de glutaminase significativa [2]. Relata-se que os efeitos negativos são encontrados quando a glutamina é empobrecido abaixo dos níveis críticos, reduzindo a síntese de diversas proteínas importantes

viz. albumina, insulina, fibrinogénio e proteína-C [10], [25]. Baixa actividade de glutaminase também aumenta a depleção de L-asparagina [25]. A enzima purificada tem K

m valor de 1,4 × 10

-5 M que é menor do que a L-asparaginase de

Erwinia

(3,0 × 10

-3 H) [27] e

E. coli

(3,5 × 10

-3 H) [28] e, portanto, uma melhor afinidade para o substrato, embora inferior K

m valor de 7,4 × 10

-6 M foi obtida em caso de L- asparaginase de

Vibrio succinogenes

[28]. espectro de CD do L-asparaginase purificada mostrou elipticities negativos a 208 e 222 nm, que são características dos espectros obtidos para tipos mistos alfa /beta de proteínas [29]. Os espectros de perto de CD no UV da proteína deu elipticities negativos na gama de 260-290, que pode ser atribuída à presença de cadeias laterais de aminoácidos aromáticos de fenilalanina, tirosina e triptofano e dando espectros de CD que é característico para a proteína dobrada compacta nativa estrutura [29]. Houve uma mudança gradual desde 323 nm a 352 nm λ

in no aumento da concentração de GdHCl de 1 a 6 M, no entanto turno era proeminente apenas quando a concentração de GdHCl foram aumentados mais de 3 M. semelhante tem sido reportado em caso de asparaginase hiperterm�ila produzido a partir da mutação

Pyroccocus furiosus

por Bansal,

et al

em 2011 [17]. A sequência dos primeiros 15 aminoácidos N-terminais mostraram uma ampla variação com a sequência de proteína conhecida e relatada de L-asparaginase, no entanto, a sequência conservada de ATGGT foi gravado [16], assim, portanto, esta proteína L-asparaginase é novo, que pode atribuem às suas propriedades robustas e baixa atividade glutaminase. Purificada a partir de L-asparaginase

foi encontrada Bacillus licheniformis

RAM-8 para ser altamente eficaz contra as linhas celulares de cancro, clone E6-1 de Jurkat, MCF-7 e K-562, onde IC

50 foi gravado em a gama de menos do que 1 UI /mL. No entanto, a L-asparaginase comercial de

Erwinia

foi reportado ter IC

50 de 7,5-10,0 UI /ml e a de

E. coli

tem IC

50 de 1,0 UI /ml nas linhas de células semelhantes [30]. Neste respeita a esta, L-asparaginase pode ser considerado como a arma mais potente e eficaz na quimioterapia de tumores, em comparação com as presentes preparações comerciais. Além disso, este L-asparaginase foi não tóxico contra a linha de células CHO normais e os eritrócitos humanos. Aproximadamente 15-20% dos doentes tratados com

E. coli

-derived asparaginase desenvolver hipersensibilidade e toxicidade do fármaco [31], portanto, esta L-asparaginase poderia ser um candidato melhor sob condições fisiológicas.

Conclusões

L-asparaginase de

Bacillus licheniformis

RAM-8 foi purificada até aparente homogeneidade e foi encontrado para ser um homotetrâmero possuindo um tamanho molecular de 134,8 kDa. Este L-asparaginase está ativo e estável ao longo ampla faixa de temperatura e pH e específico para que o seu substrato natural,

i.

L-asparagina. caracterização biofísica concluiu que seja robusta estrutura de α proteína mista /β. A sequência N-terminal desta proteína não corresponder com a sequência de L-asparaginase conhecidos e relatados, por conseguinte, a proteína é uma nova. Este L-asparaginase mostrou efeito anticancerígeno contra clone Jurkat E6-1, K-562 e linhas de células MCF-7 e efeito não-tóxico contra o sangue heparinizado ou linha de células CHO teste.

Reconhecimentos

Autores agradecer ao Dr. TP Singh Departamento de Biofísica, AIIMS para suporte de infra-estrutura na sequenciação N-terminal. Autores agradecem Rotary Banco de Sangue, Nova Deli para o fornecimento de sangue humano para fins de pesquisa como o presente.