Abstract

Apesar dos notáveis ​​avanços na terapia e prevenção do câncer de próstata ainda é a segunda causa de morte por cancro nos países industrializados. Muitas terapias inicialmente demonstrado ser benéfico para os pacientes foram abandonadas devido à alta resistência à droga e a taxa de evolução dos tumores. Um dos agentes terapêuticos potenciais mesmo utilizados nos ensaios clínicos primeira etapa, 1,25-di-hidroxivitamina D3, foi mostrado para ser imprevisível ou ineficaz em muitos casos. Nós já demonstraram que TRPV6 canal de cálcio, que é o alvo directo do receptor D3 1,25-di-hidroxivitamina, controla positivamente a proliferação do cancro da próstata e resistência à apoptose (

Lehen’kyi et ai.

, Oncogene, 2007). No entanto, como os conhecidos 1,25-di-hidroxivitamina D3 efeitos anti-proliferativos podem ser compatíveis com a regulação positiva de canal TRPV6 pró-oncogénica permanece um mistério. Aqui demonstramos que, em condições de baixo esteróides 1,25-dihidroxivitamina D3 regula positivamente a expressão de TRPV6, enchances a proliferação através do aumento do número de células que entram em fase S. Mostra-se que estes efeitos pró-proliferativas de D3 1,25-di-hidroxivitamina são directamente mediadas através da sobre-expressão de canal TRPV6 que aumenta a absorção de cálcio em células LNCaP. A resistência à apoptose de células LNCaP dependente de androgénios conferidos pelo canal TRPV6 é drasticamente inversa quando a 1,25-di-hidroxivitamina D3 efeitos foram combinadas com o knockdown TRPV6 bem sucedida. Além disso, a utilização de linhas de células LNCaP C4-2-andrógeno deficiente DU-145 e de androgénio-insensível permitido sugerem que a capacidade de D3 1,25-di-hidroxivitamina para induzir a expressão de canal TRPV6 é um determinante importante do sucesso ou falha de 1,25-di-hidroxivitamina D3-terapias baseadas

citação:. Lehen’kyi V, Raphael H, Oulidi A, Flourakis H, Khalimonchyk S, Kondratskyi A, et al. (2011) TRPV6 Determina o efeito da vitamina D3 sobre o Câncer de Próstata celular Crescimento. PLoS ONE 6 (2): e16856. doi: 10.1371 /journal.pone.0016856

editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Setembro, 2010; Aceito: 16 de janeiro de 2011; Publicação: 11 de fevereiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lehen’kyi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Ministère de l’Education Nationale et Ligue Nationale Contre Cancer le. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata continua a ser a malignidade humana não-cutâneos mais comum e o segundo tumor mais letal entre os homens com maior incidência nos países industrializados [1]. O receptor de androgénio e outros esteróides regular aspectos importantes do crescimento celular e a função da próstata, incluindo a proliferação, diferenciação, apoptose, metabolismo lipídico, acção secretora e [2]. supressão androgênica tem sido o tratamento de liderança e atualmente o mais bem sucedido [3]. No entanto, os carcinomas da próstata eventualmente tornar-se andrógeno-irresponsive, e que o câncer é refratária à terapia hormonal -. A razão mais importante para a mortalidade por câncer de próstata [4]

Diferentes receptores nucleares têm sido alvo de terapia e entre eles 1, 25-dihidroxivitamina D3 que exerce uma multiplicidade de actividades anti-tumor contra as células de cancro da próstata em cultura e xenoenxertos de [5]. células epiteliais prostáticas normais e malignas expressam o receptor da vitamina D3 (VDR), e a activação de RVD por 1,25-di-hidroxivitamina D3 geralmente resulta na inibição da proliferação e do ciclo celular prisão [6]. No entanto, para prevenir ou tratar o cancro da próstata, as interacções de outros receptores nucleares e via de sinalização devem ser considerados [7].

A função dos canais iónicos tem sido discutido em relação à proliferação e apoptose. Mais recentemente, armazenar operado Ca

2 + canais eo Ca

2 + piscina no retículo endoplasmático também têm sido relacionados com a [8] desenvolvimento do câncer de próstata. A proliferação das linhas celulares de cancro da próstata LNCaP e PC3 foi inibida por TH-1177, uma substância que bloqueia Ca

2+ entrada [9]. Alterações no Ca

2 + piscina e citosólica Ca

2 + não só foram descritos para aumentar a proliferação e sarcoendoplasmatic Ca

2 + -ATPase (SERCA) expressão em células LNCaP [10], mas também para induzir apoptose [11]. Assim, Ca

2 + homeostase está envolvida criticamente no desenvolvimento e progressão do câncer.

A nossa atenção foi elaborado pela observação de que um potencial receptor transiente altamente Ca membro

2 + seletivo canal da subfamília V 6, TRPV6 é fortemente expresso no cancro da próstata avançado e correlaciona-se significativamente com o Gleason 7 classificação representando um forte marcador da progressão tumoral e invasão subsequente para os tecidos saudáveis ​​[12], [13]. Nós temos mostrado previamente que as formas TRPV6 altamente cálcio canais seletivos em células da próstata, cuja amplitude e comportamento de inactivação atual são fortemente regulada pela concentração intracelular de cálcio [10], [14]. Além disso já foi demonstrado que TRPV6 canal está envolvido no controlo da proliferação de cancro da próstata e na resistência à apoptose [15]. No entanto, o papel preciso de TRPV6 na fisiopatologia da próstata permanece ilusória, e sua regulação por andrógeno – contradictive [16]. Além disso, VDR ser um ativador direto de

TRPV6

promotor [17], e 1,25-di-hidroxivitamina D3 um tratamento antineoplásico amplamente utilizado ter concluído uma hipótese intrigante para a regulação TRPV6 e importância no câncer de próstata. Os nossos estudos basearam-se no facto de que a 1,25-di-hidroxivitamina D3, já usado na primeira fase de ensaios clínicos demonstrou ser imprevisível ou ineficaz em muitos casos, e o facto de TRPV6 positivamente que controla a proliferação do cancro da próstata e apoptose resistência [15] é um alvo directo de 1,25-dihidroxivitamina D3 [17]. A questão de como os conhecidos 1,25-dihidroxivitamina D3 efeitos antiproliferativos podem ser compatíveis com a regulação positiva de canal TRPV6 pró-oncogénico era o objectivo do nosso estudo.

Materiais e Métodos

cultura celular

LNCaP humano (cancro linfático da próstata), LNCaP C4-2, e DU-145 linhas celulares foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em meio RPMI (Gibco-BRL, CergyPontoise, França ) suplementado com soro a 10 ou de 2% de vitelo fetal (FCS) e contendo canamicina (100 ng /ml) e L-glutamina (2 mM). As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2 no ar. O meio foi mudado três vezes por semana e as culturas foram divididas por tratamento das células com tripsina a 0,25% (em PBS) durante 5 min a 37 ° C antes de se atingir a confluência. Para as experiências, as células foram semeadas em placas de 6 poços para PCR e Western-blot e sobre lamelas de vidro para imunocitoquímica e imagem de cálcio. Para a 1,25-di-hidroxivitamina D3 células estudos foram tratados com EtOH como um controlo para a D3 1,25-di-hidroxivitamina. -Listrado carvão vegetal de soro fetal de vitelo (2%) foi adicionada a meio RPMI livre de fenol vermelho, juntamente com canamicina e L-glutamina como acima se incubar as células para criar condições de privação de esteróides.

RT-PCR

o ARN total foi isolado utilizando o método de extracção tiocianato-fenol-clorofórmio guanidinio. Depois de ADNase I (Life Technologies) de tratamento para eliminar o ADN genómico, 2 ug de RNA total foi transcrito de modo reverso em ADNc a 42 ° C por meio de iniciadores de hexâmero aleatório (Perkin Elmer) e MuLV da transcriptase (Perkin Elmer) reversa num volume final de 40 ul, seguido por PCR em tempo real quantitativo.

Quantitative PCR em tempo real

Quantitative PCR em tempo real de TRPV6 e transcritos de mRNA HPRT foi feito usando MESA VERDE qPCR MasterMix Plus para SYBR Assay (Eurogentec, França ) sobre o Sistema de Detecção de PCR em Tempo real Biorad CFX96. As sequências dos iniciadores estão indicadas na Tabela 1. O gene HPRT foi usado como um controle endógeno para normalizar variações em extracções de RNA, o grau de degradação de ARN, e a variabilidade da eficiência de RT. Para quantificar os resultados utilizou-se o método comparativo ciclo limiar ΔΔC (t)

Western-blot

células semiconfluentes LNCaP foram tratadas com um tampão de lise gelado contendo:. 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl 10 mM, PMSF 1 mM, 1% de cocktail de Nonidet P-40, e o inibidor de protease da Sigma. Os lisados ​​foram centrifugados 15.000 x g a 4 ° C durante 20 minutos, misturada com um tampão de amostra contendo: 125 mM Tris-HCl pH 6,8, SDS a 4%, 5% β-mercaptoetanol, 20% de glicerol, 0,01% azul de bromofenol, e fervidas durante 5 min a 95 ° C. As amostras de proteína total foram submetidos a 8, 10, e 15% de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose por semi-secas Western Blotting (Bio-Rad Laboratories). A membrana foi bloqueada em leite a 5% contendo tampão TNT (Tris-HCl, pH 7,5, NaCl a 140 mM e 0,05% de Tween 20) durante a noite, em seguida, sondado utilizando um anticorpo anti TRPV6 RABIT policlonal específico (Alomone Labs Ltd., 1/200) , anti-PCNA (Santa Cruz-, 1/1000), anti-β-actina (Laboratório de Visão Co., 1/1000) anticorpos. As bandas sobre a membrana foram visualizados utilizando o método de quimioluminescência aumentada (Pierce Biotechnologies Inc.). A análise densitométrica foi efectuada utilizando um sistema de aquisição de imagem Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories).

A imunocitoquímica

As células cultivadas sobre as lamelas de vidro foram lavadas uma vez com PBS e, se for caso disso, incubadas com a subunidade B da toxina da cólera Alexa 488 Fluor® conjugado (Molecular Probes, 1/2000) durante 15 min, em seguida, lavada uma vez com PBS e fixadas em 3,5% de paraformaldeído em PBS. PBS-glicina (30 mM) foi usada para extinguir a reacção subsequente com a permeabilização com 0,1% de Triton X-100. As células foram novamente lavadas em PBS e sujeitas a imunocoloração procedimento convencional. Alexa Fluor® 546 IgG de cabra anti-coelho (Molecular Probes, 1/4000) foi usado como um anticorpo secundário para a coloração TRPV6. A análise da fluorescência foi realizada utilizando Carl Zeiss laser sistemas de controlo de LSM 510 ligado a um Zeiss Axiovert 200M com 63 × 1,4 abertura da objectiva de imersão em óleo numérica à temperatura ambiente. Ambos os canais foram animado, recolhidos separadamente e depois se fundiram usando software Carl Zeiss LSM Examiner Imagem.

A proliferação celular

A proliferação celular foi medida utilizando o CellTiter 96 Aqueous ensaio de proliferação celular One Solution (Promega, Madison , WI), com base na conversão celular do reagente colorimétrico MTS [3,4- (5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio sal] em formazan solúvel por enzimas desidrogenases encontrada apenas em células metabolicamente ativas, proliferando. A seguir a cada tratamento, 20 ul de solução de corante foi adicionada a cada placa de 96 poços em e incubou-se durante 2 h. Subsequentemente, foi registada a absorvância a 490 nm de comprimento de onda utilizando um leitor de placas ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). taxa de inibição da proliferação celular é calculado como: (

A

control-

A

sample)/(

A

control-

A

blank)×100%.

Cell ciclo e apoptose ensaios

citometria de fluxo ensaios foram realizados em populações de células cultivadas em triplicado de 25 cm

2 frascos como originalmente descrito [18]. Aproximadamente 10

6 as células foram fixadas com 1 ml de gelo-metanol frio a 70% durante 30 min. Após fixação, as células foram sedimentadas por centrifugação para remover os fixadores, lavou-se três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 ° C, ressuspenso em 100 ul de PBS, tratou-se com 100 ul de RNAse A (1 mg /ml, Sigma), e coradas com iodeto de propídio (PI, Sigma) a uma concentração final de 50 ug /ml. As células marcadas foram armazenadas a 4 ° C no escuro e analisadas dentro de duas horas. As amostras manchadas foram medidos num citómetro de fluxo FACScan (Becton-Dickinson, San José, CA). Os dados foram adquiridos por eventos 7000 com um coeficiente de variação de menos do que 5%, e a fluorescência vermelha foi medida usando um detector de fluorescência 3 (FL3) no

X

-axis. Os dados foram armazenados e analisados ​​utilizando software CellQuest para avaliar padrões de distribuição do ciclo celular (subG1 (apoptóticos), G0 /G1, S e G2 /M fases).

Imagem de cálcio

Células foram plaqueadas em lamelas de vidro e foram carregadas com Fura-4 uM 02:00 à temperatura ambiente durante 45 min, no meio de crescimento. As gravações foram realizadas em HBSS contendo (em mM): 140 NaCl, 5 KCl, 2 de MgCl

2, 0,3 de Na

2HPO

3, 0,4 KH

2 PO?

4, 4 NaHCO

3, 5 de glucose e 10 de HEPES ajustado para pH 7,4 com NaOH. CaCl

2 foi ajustada para 0,07 mM ou 1,8 mM, dependendo da experiência. As lamelas foram então colocados numa câmara de perfusão na fase do microscópio. As imagens de fluorescência das células foram registados com um sistema de análise de imagem de vídeo (Quanticell). A fluorescência de Fura-2, no comprimento de onda de emissão de 510 nm, foi registada através da excitação da sonda, alternativamente, a 340 e 380 nm. A relação sinal a 340/380 nm foi convertido em [Ca

2 +]

i nível usando um

in vitro

calibração.

transfecção de células siRNA

células LNCaP foram transfectadas durante a noite com 200 nM de ARNsi-TRPV6 1 e 2 por poço de uma placa de seis poços utilizando “Gene Porter 2” (Sistemas de terapia de gene, Inc.), num volume final de 1 ml. Ready-to-use siRNA-TRPV6s (processamento opção: A4) foram sintetizados por Dharmacon Research Inc (Lafayette, EUA) (ver Tabela 1)

Reagentes

Todos os reagentes foram adquiridos de Sigma. (Sigma, L’Isle d’Abeau Chesnes, França) salvo indicação em contrário.

Estatísticas

Os dados foram expressos como média ± SD. As análises estatísticas foram realizadas utilizando não pareado

t de Student

-Testes. * – P 0,05 ou ** – P 0,01 indica significância estatística

Resultados

O efeito de D3 1,25-di-hidroxivitamina sobre a proliferação de células de cancro da próstata tem sido estudada em duas condições experimentais. : 2% e 10% de soro fetal de vitelo (FCS) -supplemented meio RPMI. O crescimento da linhagem de células LNCaP dependente de androgénios foi surpreendentemente aumentada por 100 nM de 1,25-di-hidroxivitamina D3 em 2% de meio FCS suplementado e suprimido em 10% de FCS (Fig. 1A). Nós já demonstraram o papel do canal TRPV6 na proliferação de células cancerosas da próstata [15] e, portanto, procurou-se investigar a regulação da expressão do canal TRPV6 por D3 1,25-dihidroxivitamina. Uma vez que foi demonstrado que

TRPV6

é um gene regulado pelo VDR [17], foi estudada a regulação da expressão TRPV6 por 1,25-di-hidroxivitamina D3 em células de LNCaP em diferentes conteúdos de esteróide de acordo com os meios de comunicação (Fig . 1B, C). 1,25-di-hidroxivitamina D3 parece activar directamente o

TRPV6

gene em células LNCaP, apesar de em meio FCS a 10% dos seus efeitos não eram tão significativa (Fig. 1B) do que em FCS a 2% (Fig. 1C) . 1,25-di-hidroxivitamina D3 dependente da dose significativamente a expressão aumentada de ARNm TRPV6 em 2% de FCS contendo meio RPMI (Fig. 1C). Para verificar se os efeitos diminuídos de 1,25-dihidroxivitamina D3 foram devido ao teor de FCS e não ao tempo que o efeito óptimo realizada a curva do tempo utilizando a concentração máxima de 100 nm durante três dias a intervalos de tempo diferentes (Fig. 1D). Para confirmar a indução significativa da proteína TRPV6 pela D3 1,25-di-hidroxivitamina em FCS a 2% contendo meio RPMI obtido por PCR quantitativo em tempo real, um western-blotting foi realizado. Ele mostrou um aumento considerável do nível de proteína TRPV6 após activação com 100 nM de 1,25-di-hidroxivitamina D3 (Fig. 1E). Imunocitoquímica, utilizando um anticorpo específico TRPV6 mostrou a expressão de canais de TRPV6 em células LNCaP (Fig. 1F), bem como sua localização na membrana de plasma utilizando toxina da cólera (CTX) conjugado com FITC de rotulagem especificamente lípidos na membrana G2M. Assim, os efeitos do D3 1,25-di-hidroxivitamina sobre o crescimento de células LNCaP dependente de androgénios dependerá do teor de esteróides relativa. Além disso, a 1,25-di-hidroxivitamina D3 aumenta significativamente a expressão do canal de TRPV6 em condições de baixa-esteróide.

A, efeitos D3 1,25-di-hidroxivitamina sobre a taxa de proliferação medida por ensaio de MTS de células LNCaP incubadas com dois % ou 10% de meio RPMI, contendo SBF *– P 0,05, ** – P 0,01, em comparação com os controlos respectivos (DMSO), n = 3. B, a supra-regulação da expressão de mRNA por 1,25- TRPV6 di-hidroxivitamina D3 em células LNCaP cultivadas em 10% de FCS contendo meio RPMI; * – P 0,05, em comparação com o controlo (DMSO), n = 3. C, a regulação positiva da expressão do mRNA TRPV6 por 1,25-di-hidroxivitamina D3 em células LNCaP cultivadas em 2% de FCS contendo meio RPMI; * – P 0,05, ** – P 0,01, em comparação com o controlo (DMSO) =, n 3. D, A dependência temporal da expressão TRPV6 abaixo de 100