Sumário

A nicotina é um factor de risco conhecido para o desenvolvimento de cancro e tem sido demonstrado que alteram a expressão génica em células e tecidos após a exposição. Nós usamos a tecnologia Illumina® Next Generation Sequencing (NGS) para obter uma visão biológica imparcial para o transcriptoma de células epiteliais normais (MCF-10A) para exposição à nicotina. Geramos dados de expressão de 54,699 transcrições utilizando triplicatas de controle e nicotina células estressado. Como resultado, identificamos 138 transcritos diferencialmente expressos, incluindo 39 genes não caracterizados. Além disso, 173 transcritos que estão associados principalmente com a replicação de ADN, a recombinação e a reparação mostrou evidência de splicing alternativo. Descobrimos a maior resposta nicotina estresse, HPCAL4 (up-regulada por 4,71 vezes) e NPAS3 (down-regulada por -2,73 vezes); ambos são genes que não tenham sido previamente implicado na exposição à nicotina, mas são ligadas ao cancro. Nós também descobrimos a regulação negativa significativa (-2,3 vezes) e splicing alternativo de NEAT1 (lncRNA) que podem ter um importante papel regulador, ainda não descoberto. análise do gene ontologia revelou genes exposição influenciado nicotina envolvidas em processos celulares e metabólicas. Este estudo revela conseqüências previamente desconhecida de estresse nicotina sobre o transcriptoma de células epiteliais normais da mama e fornece insights sobre a influência biológica subjacente da nicotina sobre as células normais, marcando a base para futuros estudos

Citation:. Bavarva JH, Tae H, Settlage RE, Garner HR (2013) Caracterização da base genética para a nicotina induzida Desenvolvimento Câncer: Um Estudo de Seqüenciamento do transcriptoma. PLoS ONE 8 (6): e67252. doi: 10.1371 /journal.pone.0067252

editor: Emmanuel Dias-Neto, Hospital AC Camargo, Brasil

Recebido: 05 de fevereiro de 2013; Aceito: 15 de maio de 2013; Publicação: 18 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Bavarva et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos do diretor de Informática médica e Sistemas Divisão da Virginia Bioinformatics Institute. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em todo o mundo, mais de 1 milhão de mulheres são diagnosticadas com câncer de mama a cada ano e mais de 410.000 morrem da doença [1]. Grandes estudos de coorte realizados nos Estados Unidos e no Japão indicam que o risco de câncer de mama está associado com o tabagismo ativo e passivo [2], [3]. Os estudos mostraram que 80-90% da nicotina é absorvida sistemicamente inalado durante o fumo, 1 mg a partir de um único cigarro, que resulta em concentrações plasmáticas de cerca de 15 ng /mL imediatamente depois de fumar [4]. Estudos in vivo demonstram nicotina promove o crescimento de tumores sólidos, o que sugere que a nicotina pode contribuir para a proliferação celular, invasão, angiogénese e [5] – [7]. Além disso, a nicotina é mostrado para substituir o ADN do ciclo celular induzida por danos restrição G1 /S e, portanto, promove a instabilidade genética [8]. Estudos anteriores têm demonstrado que a estimulação da nicotina poderia alterar a expressão de genes em células endoteliais e de neuroblastoma [9], [10]. Um estudo com base microarray ligada nicotina estimulação com factor de transcrição NF-kB, mas concluiu que a análise futura seria necessário uma vez que apenas avaliada 4132 genes e houve uma forte possibilidade de genes importantes foram perdidas [9]. Outro estudo micromatriz de células de neuroblastoma sugerido que os efeitos fisiológicos e psicológicos da nicotina exposição pode ser devido aos efeitos sobre a expressão do gene, mas também tinham limitações técnicas similares [10]. Além disso, os estudos sobre a nicotina falta consenso sobre dosagem de nicotina.

Nossa hipótese é o elo perdido entre o estresse nicotina e câncer será encontrada usando uma abordagem de sequenciação imparcial, em vez de uma abordagem baseada em array alvo. Next-Generation Sequencing técnicas (NGS), em contraste com cDNA microarrays utilizados anteriormente, permite o exame sistemático do conhecido, expressão transcrição descaracterizado em uma ampla faixa dinâmica e eventos alternativos e novas emendas, sem qualquer viés tecnológico e /ou biológica. Esta abordagem all-inclusive pode proporcionar melhores pistas para vias complexas, compreensão das transcrições descaracterizados e fornecer informações em falta sobre a regulação do gene sob estresse nicotina que anteriormente não eram possíveis com microarrays. Além disso, foi selecionada uma LD

50 doses porque é padronizado e é estabelecido como um meio preciso de medir os efeitos [11]. Aqui, descrevemos os resultados desta análise sistemática e descobriu associações previamente desconhecida de transcrições descaracterizados.

Materiais e Métodos

Os reagentes, produtos químicos e de cultura de células

A nicotina foi comprado de Sigma (St. Louis, MO, EUA). MCF-10A, linha celular de epitélio de mama normal, foi obtido a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As células MCF-10A foram cultivadas em meio DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com soro de cavalo (5% final, Invitrogen), antibiotics- Pen /Strep (1% final, Invitrogen), factor de crescimento de EGF (20 ng /fINAL mL, Peprotech, Rocky Hill, NJ), hidrocortisona (0,5 mg /fINAL ml, Sigma), toxina da cólera (100 ng /mL de concentração final, Sigma), e insulina (10 ng /mL de concentração final, Sigma) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de dióxido de carbono.

experiências

Vinte e quatro horas antes das experiências, as células MCF-10A foram semeadas a uma densidade de aproximadamente 3 x 10

5 células /poço em placas de seis poços ou 5 × 10

7/500 cm

2 placas de cultura celular Corning (quadrados). A nicotina foi diluída em meio de cultura completo às concentrações finais exigidas de série. experiências de dosagem de nicotina foram realizados em placas de seis poços durante 72 horas e no final; o número de células vivas foram calculados utilizando um contador de células TC10 BioRad®. Estas experiências de dosagem foram adicionalmente analisadas e comparadas para a nicotina LD

50 dose (5 mM /811 ng /mL) em 500 cm

2 placas durante 72 horas. Após o período de exposição, as células aderentes foram colhidas para extracção de ARN usando o kit Qiagen de um RNeasy® seguindo o protocolo do fabricante. RNA foi devidamente testado para a qualidade de Nano-drop® e Bioanalyzer® antes sequenciamento do transcriptoma foi realizado utilizando Illumina HiSeq®.

transcriptoma sequenciamento

bibliotecas de RNA foram preparados de acordo com a preparação da amostra TruSeq® RNA orientar de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante (Illumina, San Diego, CA). RNA total para os três repetições biológicos de controle e nicotina salientou populações de células foram transcritas para cDNA. Amostras de DNA de cortesia foram então cortado por nebulização (35 psi, 6 min). Duplexes foram tornadas rombas (fragmento grande de Klenow, T4 polinucleótido cinase e polimerase T4) e uma única porção 3’adenosine foi adicionado usando Klenow exo- e dATP. adaptadores Illumina, contendo locais de iniciadores para o recozimento da superfície da célula de fluxo, a amplificação e sequenciação, foram ligados nas extremidades do ADNc reparados. A electroforese em gel foi utilizado para seleccionar para construções de ADN de 200-250 pares de bases de tamanho, que foram subsequentemente amplificados por 18 ciclos de PCR com Phusion polimerase (NEB). Estas bibliotecas foram então desnaturadas com hidróxido de sódio e diluiu-se a 3:05 num tampão de hibridação por carregamento para uma única pista de uma célula de fluxo Ilumina HiSeq®. formação de aglomerados, as reacções de hibridação e sequenciação de iniciadores foram de acordo com o protocolo do fabricante. sequenciamento de alto rendimento foi realizada utilizando emparelhado-end, 100 pares de bases lê. Uma pista de fluxo foi utilizado para a sequenciação de cDNA, produzindo uma média de 45.260 mil leituras por amostra com escore médio de qualidade de . 36,3

análise

RNA-Seq dados

RNA-Seq dados foram analisados ​​de acordo com o método descrito por Trapnell et al., [12]. Resumidamente, TopHat v2.0.3 foi usada para alinhar o RNA-Seq lê ao genoma Ensemble GRCh37 como fornecido por Ilumina iGenome com anotações. a expressão do gene foi medida para cada gene do banco de dados Ensembl por fragmentos mapeadas por modelo quilobases de Exon por Milhão mapeados lê (FPKM) calculada utilizando Abotoaduras v2.0.1. Utilizou-se o programa CuffDiff v2.0.1 para testar a expressão diferencial de transcrição e eventos de splicing alternativo de cada grupo de linhas de células. Os parâmetros padrão foram utilizados para todas as análises. Os genes foram consideradas diferencialmente expressas após o ajuste para os testes múltiplos; p≤0.05. pacote cummerbund para R foi usado para gerar gráficos de dispersão mostrado na dados suplementares. Os genes que têm evidência de splicing alternativo (aqueles com um valor Q 0,05, sugerindo uma alteração na abundância relativa de transcritos de diferentes derivados de um único local de início da transcrição) foram identificados por CuffDiff. Abotoaduras realiza inferência transcrição e estimativa de abundância seguido pelo teste diferencial da abundância relativa usando Jensen-Shannon Divergência (JSD) para detectar evidências de splicing alternativo [13]. Neste contexto, JSD é uma medida da variação na abundância relativa de transcritos de múltiplos cada locus através de duas condições experimentais [14]. funções de genes e processos biológicos foram investigados utilizando o sistema de classificação PANTERA [15] e enriquecimento factor de transcrição foi efectuada utilizando o software Engenho Pathway Analysis (IPA) (https://www.ingenuity.com). Sequência lê estão disponíveis em células NIH leitura curta Arquivo sob o número de acesso experimento SRX254950.

RT-PCR quantitativo

Para cada amostra, 1 ug de RNA total foi transcrito de forma reversa utilizando o Qiagen QuantiTect transcrição reversa kit (Valencia, CA) de acordo com protocolo padrão do fabricante. Para Taqman PCR em tempo real, 1,0 ul de ADNc diluída foi usado para 20 ul de PCR em tempo real utilizando Gene Expression Taqman Master Mix de acordo com o protocolo padrão do fabricante. ensaios Taqman da Applied Biosystem utilizados foram os seguintes: HPCAL4 (Hs04188853_g1), NEAT1 (Hs01008264_s1), actina (Hs01060665_g1) e 18S rRNA (Hs03928985_g1). RT-PCR quantitativa foi realizada em um sistema StepOnePlus PCR em tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Resultados e Discussão

O controle de qualidade e diferenciado análise de expressão

Este é o primeiro estudo do transcriptoma sequenciamento da nicotina sublinhou células epiteliais normais da mama. análise de expressão através de transcriptoma sequenciação directa (RNA-Seq) investiga as transcrições mais raros e mais células e de contexto específico. Além disso, os métodos de RNA-Seq não são influenciados pelo conhecimento prévio de splicing e permitir a análise para determinar o repertório completo de isoformas de splicing alternativo. Finalmente, RNA-Seq como um método tem sido demonstrado ser mais quantitativo como o número de leituras produzido a partir de um transcrito de ARN é uma função da referida transcrição e expressão de genes, em vez de uma propriedade química de hibridação da sonda que muda com a composição da amostra [16 ] – [18]

Para identificar genes e transcritos diferencialmente expressos, primeiro confirmou os dados RNA-Seq era livre de preconceitos sequenciamento e mostrar uma cobertura uniforme em amostras (Figura S1).. Em seguida, normalizou as amostras (FPKM), calculado a estatística de teste (p-valor) e p-valor ajustado (q-valor). A partir daí, houve um total de 2015 transcritos diferencialmente expressos (valor Q 0,05), 1680-regulada e 335 sub-regulada (Tabela S1). Um total de 138 transcrições foram diferencialmente expressos com ± mudança de 2 vezes (107 up-regulada e 31 regulada para baixo) sobre a exposição à nicotina e 39 destes foram descaracterizados (Tabela 1). Usamos Taqman PCR em tempo real para validar os dois principais genes (HPCAL4 e NEAT1) e confirmou a cima e para baixo-regulação respectivamente (Figura S2).

O câncer é uma doença multifatorial, ligada à o número de eventos biológicos subjacentes, tais como a resposta inflamatória, genes supressores de tumores, oncogenes e factores de transcrição. Um, todos abordagem inclusiva imparcial com sequenciamento de última geração pode, portanto, fornecer detalhes mais completos e nos ajudar a entender melhor as ligações que faltam. Nossos resultados indicaram que HPCAL4, TREM1, EFNA2, SPATA22 e KRT85 estão as cinco principais genes regulada e NPAS3, DEFB129, NEAT1, WDR96 e VRK2 estão as cinco principais genes reprimidos após a exposição à nicotina. Hippocalcin como 4 (HPCAL4) e receptor de disparo expressos em células mielóides 1 (TREM1) foram altamente regulada positivamente genes com maior do que quatro vezes a mudança sobre o stress nicotina. HPCAL4 é um gene relativamente pouco estudada e tem a função desconhecida, mas é relatado para ser sobre-expresso no carcinoma pulmonar [19]. A região do cromossoma 1p34.2, onde HPCAL4 situa-se, também está associada a muitos tipos de cancro incluindo cancro da mama, pulmão, neuroblastoma, e colorrectal [19]. É possível que o gene HPCAL4 poderia ser a razão para tais associações nestes cancros. TREM1 é mostrado para ser envolvido na resposta inflamatória e é um regulador positivo de TNF-α e IL-8 [20]. TREM1 também é um alvo para metaloproteinases de matriz (MMPs), que podem clivar proteínas extracelulares. Esta glicoproteína transmembranar possui um ectodomínio Ig-like prontamente derramado por MMPs para gerar strem-1. Enquanto a membrana ancorada TREM-1 amplifica as respostas inflamatórias, sTREM1 exibe propriedades anti-inflamatórias [21]. Neste estudo, também observamos a regulação positiva de MMP2 que pode indicar um possível aumento na sTREM1 e efeitos, portanto, anti-inflamatórios. Isto reforça descobertas anteriores, em que a nicotina foi relatado para exibir efeitos imunossupressivos e anti-inflamatórios [22]. activação EFNA2 promove a resposta inflamatória de células endoteliais [23], SPATA22 tem um papel na reparação do ADN meiótica ou recombinação e é necessária para o progresso da meiose em células de ratinho germinativas [24] e KRT85 é um gene de queratina do cabelo que tem sido relatado para ser transcricionalmente activados por NF-kB efectora p65 /RelA [25]. O gene mais sub-regulada, NPAS3, demonstrou actividade supressora de tumores [26] e, por conseguinte, a sua regulação para baixo em nicotina células estressadas é sugestivo de uma possível função desconhecida de NPAS3 num aumento da susceptibilidade ao cancro. Interessantemente, nenhum dos principais genes regulados foram detectados como diferencialmente expressos em estudos anteriores microarray [9]. Este é provavelmente devido a várias razões, incluindo diferentes tipos de células utilizadas, tempos diferentes doses e exposição e limitações tecnológicas. Mais impressionante é o fato de que, exceto para TREM1, todos os outros principais regulados genes são razoavelmente novo e escassos. Isto justifica ainda mais a razão para sequenciar transcriptomes para a nicotina sublinhou células, uma vez que, provavelmente, revela ligações anteriormente desconhecidos.

Um gene-down regulada distinta é NEAT1, que é uma longa não-codificante RNA (lncRNA) conhecido por ser um determinante essencial estrutural da paraspeckles [27]. O papel funcional de RNAs não-codificantes não estão bem definidas; No entanto, Chen et. al., recentemente propôs um papel funcional da NEAT1 na regulação do mRNA de exportação [28]. Estamos, pela primeira vez, relatando a resposta diferencial de lncRNA à nicotina. Isso cria oportunidades para se aventurar em novas avenidas inexploradas na pesquisa do câncer e exemplifica um papel maior para lncRNAs nos regulamentos de transcrição e desenvolvimento do câncer.

análise de splicing alternativo

Defeitos no mRNA splicing são uma importante causa de doença e vários estudos relataram splicing alternativo específico do cancro, mesmo na ausência de mutações genómicas [29]. Foram identificados 173 genes que mostraram evidência de splicing alternativo (Tabela S2). Vinte e três dos que também são diferencialmente expressos (Tabela S3). É também importante notar que NEAT1 é um dos mais lncRNAs regulada negativamente que também apresentaram evidência de splicing alternativo sobre o stress nicotina. Os dezoito melhores genes com raiz quadrada da

Jensen-Shannon divergência

0.8 são mostrados na Tabela 2. Disher et. ai., sugeriram que a mis-splicing seguinte estresse oxidativo representa um novo resultado e genotóxica significativa e que não é simplesmente de ADN lesões induzidas pelo stress oxidativo que leva a mis-splicing mas as alterações na própria máquina de processamento alternativo [30]. A nicotina é relatado para induzir o stress oxidativo em células de cultura [31] e, por conseguinte, que pode ser uma razão para a detecção de variantes de splicing aberrante em nicotina células estressadas. Várias formas de splicing de um único gene pode ter propriedades biológicas contrastante. Por exemplo, variantes de splicing de MDM2 exibe ambas as propriedades oncogénicas e inibidor do crescimento [32]. Portanto, para descobrir a importância biológica dos genes splicing alternativo sobre o estresse nicotina merece mais investigações.

Gene ontologia

Para obter insights sobre a natureza dos genes regulados e splicing alternativo sobre o estresse nicotina , foi realizada gene análise ontologia usando o sistema de classificação PANTHER analisados ​​utilizando estatísticas de teste binomial e a correção de Bonferroni. Significativamente enriquecido processos e funções do gene biológico são mostrados na Figura 1. Durante o stress nicotina, a maioria dos genes regulados diferencialmente e de splicing alternativo foram envolvidos no metabolismo, processos celulares e de desenvolvimento e têm funções catalíticas e de ligação. Curiosamente, expressos diferencialmente (DE) genes tinham maior associação com a actividade molecular estrutural versos a função de regulação da transcrição de genes de splicing alternativo. genes DE foram ainda analisadas por Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para identificar vias bioquímicas que podem ser afetados. Figura S3 mostra a rede de genes que estão associadas com o cancro, o sistema endócrino e do sistema nervoso, os quais são influenciados pela nicotina. O complexo NF-kB e receptor de estrogénio também são encontradas na rede de genes diferencialmente expressos sugerindo a sua ligação à tensão induzida nicotina DE genes. É evidente a partir desta análise que a nicotina afeta genes de resposta imuno-relacionadas, indicando a possível influência da nicotina na modulação da atividade do sistema imunológico normal. cancro epitelial e dermatológicas foram as duas principais funções biológicas associadas a genes regulados destacou-nicotina como revelado pelo IPA. Curiosamente, receptor de estrogênio está ligada indiretamente à rede sugerindo uma relação distante e possível influência do estresse nicotina. Além disso, esses genes foram associados com o movimento celular, sinalização, proliferação, morte e funções de sobrevivência. vias de câncer de ovário sinalização canônicos foram significativamente associados a estes resultados. Três das moléculas de via de câncer de ovário canônica, MMP2, CGA e WNT7B subiram regulado mediante exposição à nicotina. significado funcional de genes de splicing alternativo avaliados através IPA revelou o top rede de genes associados com a replicação do DNA, recombinação e reparação (Figura S4).

Carta de torta ilustrando as semelhanças e diferenças entre os termos ir de acordo com as seguintes categorias. (1A) processo biológico por genes expressos diferencialmente. (1B) para o processo biológico de genes de splicing alternativo. (1C) função molecular de genes diferencialmente expressos. (1D) função molecular de genes de splicing alternativo.

regulador de transcrição análise

Para identificar quais os reguladores de transcrição regular a expressão diferencial desses genes descritos nestas experiências, o para cima e para baixo genes regulados foram reintroduzidas no IPA e foram analisados ​​para o enriquecimento de reguladores de transcrição associados aos promotores de genes diferencialmente expressos. Havia cinco up genes reguladores (S100A14, HEY1, CGA, IGFBP2 e LGALS1) a partir da lista. As moléculas-alvo, incluindo a MMP2 e PROX1, foram também se regulada no estudo indicando uma forte correlação (Tabela 3). Todos os reguladores de transcrição possíveis cujos genes alvo foram expressos diferencialmente estão detalhadas na Tabela S4. A regulação da S100A14 está associado a cânceres de mama do tipo basal em comparação com tipos não-basais [33]. S100A14 também é sugerido para ser um marcador útil para detectar colorretal metastático e câncer de mama [34]. CGA é identificado como um novo gene responsivo ER-α em células de cancro da mama humano e, possivelmente, um marcador para prever a capacidade de resposta forte tamoxifeno no cancro da mama [35]. Significativamente mais elevada expressão de IGFBP2 é relatado em tecidos de cancro da mama em comparação com o tecido mamário benigno [36]. LGALS1 suprime as respostas imunitárias citotóxicas mediadas por células T e promove a angiogénese de tumores [37]. Portanto, ao longo expressão de S100A14, CGA, IGFBP2 e LGALS1 em nicotina sublinhou células é sugestivo de seu papel acumulada no aumento da susceptibilidade ao câncer em fumantes. Em nosso estudo, o estresse nicotina up-regula HEY1 e MMP2. O cenário inverso foi observado quando se avalia os efeitos anti-câncer de curcumina, que resultou em diminuição da regulação da HEY1 e MMP2, devido à inactivação do Notch-1 como a curcumina inibiu a proliferação e invasão [38]. Estes sugerem o papel da nicotina no apoio ao desenvolvimento do câncer ea possibilidade de curcumina para ajudar a reduzir o risco e desenvolvimento de câncer em fumantes. MMP-2 sobre-expressão tem sido relatada em muitos neoplasias [39], incluindo ovário [40] e da mama [41] cancros. Tem sido sugerido que a MMP-2 pode não só ser um preditor independente do aumento da agressividade do tumor, mas também importante na activação de outras proteases que estão directamente envolvidas na angiogénese tumoral [42]. Relata-se que a nicotina aumenta a expressão de MMP2 e estimula a (TE-13) migração e invasão [43] esofágica de células de carcinoma epidermóide. Portanto, a regulação positiva de MMP2 em cima estresse nicotina em nosso estudo reforça descobertas anteriores e destaca a possibilidade de que MMP2 é um biomarcador importante para avaliar o risco de câncer em fumantes. PROX1 é um regulador transcricional envolvido na neurogénese, bem como uma variedade de tipos de cancro. Alterações na PROX1 são relatados em várias formas de câncer, embora nem sempre é claro se PROX1 exerce supressora de tumor ou propriedades oncogênicos. Cólon e cancro do cérebro mostra PROX1 sobre a expressão, ao passo que o cancro da mama revela expressão reduzida devido à hipermetilação [44]. Portanto, em nosso estudo, os efeitos da expressão PROX1 elevada sobre o estresse de nicotina são desconhecidos.

Curiosamente, HEY1 regulador de transcrição está localizado na faixa de citogenética 8q21. A amplificação de 8q21 está associada com mau prognóstico do paciente no cancro da mama e é independente da MYC [45]. Outros genes interessantes nas proximidades que foram afetados pelo estresse nicotina incluem splicing alternativo NAPRT1 e CPSF1 na banda citogenética 8q24. Apesar de não estudar a amplificação cromossomo neste estudo, o efeito do estresse nicotina sobre o regulador de transcrição HEY1, NAPRT1 e CPSF1 em ou perto 8q21 é instigante. Para investigar os efeitos globais da nicotina sobre genes por cromossomo, analisamos todos os diferencialmente expressos e splicing alternativo genes (false descoberta correção q≤0.05) (Figura S5). Doze por cento dos genes localizados no cromossomo 19 foram diferencialmente expressos e 14 transcritos no cromossomo 12 mostrou evidências de splicing alternativo sobre o estresse nicotina. No entanto, cromossoma 17 tinham um elevado nível de transcritos expressos diferencialmente e de splicing alternativo e é interessante notar que o BRCA1 marcador de cancro da mama também está localizado no cromossoma 17. Embora a razão para a polarização cromossómico é desconhecida, desequilíbrio expressão é anterior documentada na hepatocelular carcinoma [46]. viés cromossómico de transcritos expressos diferencialmente em cima de stress, justifica futuras investigações nicotina em profundidade.

Embora este estudo piloto tenta utilizar concentrações padronizada de nicotina para documentar os efeitos fisiológicos e genotóxicos, menor concentração de nicotina idênticos aos encontrados em o plasma depois de fumar podem ser utilizados no futuro, para avaliar ainda mais os efeitos.

em conclusão, este estudo revela que o stress nicotina desencadeia respostas a partir de um número de genes não caracterizados e pouco estudados e faz com que eventos de splicing aberrante que poderia contribuir cumulativamente para o desenvolvimento de câncer e atividade do sistema imunológico alterado em fumantes. Além disso, genes localizados no cromossomo 12, 17 e 19 mostram sensibilidade tendenciosa ao estresse nicotina indicando significado biológico desconhecido. Isto implica que a nicotina seria aditivo na propagação do cancro por modulação da actividade imune e de cancro do ovário vias de sinalização. Este estudo tem implicações amplas, como apresentamos novas ligações possíveis entre genes tais como HPCAL4 (up-regulada), NPAS3 (regulada) e NEAT1 (splicing alternativo, bem como altamente regulada lncRNA) que poderiam ser direcionados ou monitoradas para reduzir ou avaliar o risco de desenvolvimento de câncer em fumantes (em particular) e pacientes com câncer. Observações deste estudo transcriptoma proporcionar, assim, uma visão biológica fresco em estresse nicotina sobre as células normais epiteliais de mama que podem ser utilizados em ambientes clínicos para avaliar os efeitos nocivos da nicotina nos fumantes.

Informações de Apoio

Figura S1. Gráfico de Densidade Comprar e gráfico de dispersão. (1A) Cummerbund foi utilizado para gerar um gráfico de densidade de as densidades dos valores FPKM em todos os genes. As amostras de controlo e nicotina foram muito semelhantes, indicando que não há viés na cobertura de sequenciamento entre as amostras. (1B) Os valores FPKM para todos os genes foram traçados para as amostras de controle e nicotina, seguindo a média em toda repetições e normalização. Cada ponto representa um gene

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s001

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Figura S2.

Validação dos dois principais genes por Taqman em tempo real RT-PCR. Em tempo real RT-PCR avaliação de validação Taqman de HPCAL4 (até regulamentada) e NEAT1 (baixo regulamentado) indica que o acordo geral de RNA-Seq constatação e PCR quantitativa. Dobrar as variações foram de em relação ao controlo e normalizadas para os genes de manutenção multiplexados (actina e 18S rRNA). As barras de erro representam erros padrão

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s002

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Figura S3. análise de caminho

Ingenuity de genes diferencialmente expressos. Top rede a partir da análise de caminho Ingenuity indica que genes DE têm papel importante no cancro. Aqueles mostrados em vermelho são up-regulada, verde está regulada para baixo e aqueles em branco servem para fazer a ligação indireta entre os genes DE

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s003

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Figura S4. análise de caminho

Ingenuity de genes de splicing alternativo. Top rede a partir da análise de caminho Ingenuity indica que genes de splicing alternativo tem associação com a replicação do DNA, recombinação e reparo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s004

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Figura S5.

diferencialmente expressos e splicing alternativo transcrições por cromossoma e as suas percentagens relativas. (4A) Gráfico de Rede indica percentagens relativas de De transcrições por cromossoma. (4B) Gráfico em radar demonstra percentagens relativas de transcritos de splicing alternativo por cromossoma. . (4C) Tabela ilustrando o número total de transcritos diferencialmente expressos e splicing alternativo por cromossoma

doi: 10.1371 /journal.pone.0067252.s005

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Tabela S1. : Lista de todos os genes diferencialmente expressos e transcrições descaracterizados (q 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s006

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Tabela S2.

Transcrições que mostraram evidência de splicing alternativo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s007

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Tabela S3.

sobreposição genes que apresentaram expressão diferencial e evidência de splicing alternativo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s008

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Tabela S4.

IPA análise de fator de transcrição enriquecimento apresentando todos os fatores de transcrição que podem ter influenciado genes diferencialmente regulados

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s009

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Reconhecimentos

Este trabalho foi apoiado por fundos do diretor Informática médica e Divisão de Sistemas do Instituto Virginia Bioinformatics.