Abstract

Introdução

A glicose 78-kDa proteína -regulated (GRP78) é induzida no microambiente do cancro e pode ser considerado como um novo indicador da capacidade de resposta à quimioterapia em muitos cancros. Neste estudo, verificou-se que as espécies intracelulares reativas de oxigênio (ROS) e factor nuclear fator 2 (Nrf2) translocação nuclear eritróide 2 relacionados com foram maiores no DLD-1 células cancerígenas do cólon GRP78 knockdown em comparação com células de controlo mexidos.

Metodologia /principais conclusões

O tratamento com epirubicina em GRP78 células DLD-1 knockdown reforçada apoptose e foi associada com diminuição da produção de ROS intracelular. Além disso, a apoptose foi aumentada pela galato de propilo antioxidantes (PG) e ditiotreitol (DTT) em células de controlo tratadas com epirrubicina mexidos. células tratadas com GRP78 knockdown epirubicina resultou em mais membros inactivadas Akt, Akt fosforilada como e GSK-3β, bem como alvos a jusante de expressão β-catenina. Knockdown de Nrf2 com pequeno ARN interferente (siRNA) aumento da apoptose em células tratadas com GRP78 knockdown epirubicina, o que sugeriu que Nrf2 podem ser um mecanismo de defesa primário em células GRP78 knockdown. Também demonstramos que as células tratadas com GRP78 knockdown epirubicina pode diminuir o percurso de sobrevivência de sinalização através da activação de redox de proteína fosfatase 2A (PP2A), que é uma serina /treonina fosfatase que regula negativamente a Akt.

Conclusões

os nossos resultados indicam que a diminuição da epirrubicina intracelular em células ROS GRP78 knockdown, que diminuiu a sobrevivência a sinalização através de tanto a Akt e a activação de PP2A. Em conjunto, estes mecanismos contribuído para melhorar o nível de apoptose induzida por epirubicina que foi observado nas células GRP78 knockdown

citação:. Chang YJ, Huang YP, Li ZL, Chen CH (2012) GRP78 knockdown intensifica a apoptose através a regulação do estresse oxidativo e Akt após Epirrubicina tratamento no câncer de cólon DLD-1 células. PLoS ONE 7 (4): e35123. doi: 10.1371 /journal.pone.0035123

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de fevereiro de 2012; Aceito: 13 de março de 2012; Publicado: 18 de abril 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pelo Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC 99-2320-B-415-002-MY3; site do Conselho Nacional de Ciência: https://web1.nsc.gov.tw/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

GRP78 é um regulador chefe da função retículo endoplasmático (ER). Os papéis de GRP78 incluem (1) o enrolamento de proteínas e de montagem, (2), destinados a proteína mal dobrada para a degradação, e (3) ER Ca

2 + liga�o ao e controlo da activação de sensores de tensão transmembranar ER. Além disso, devido à sua propriedade anti-apoptótica, GRP78 é induzido em uma ampla variedade de células cancerosas e as células cancerosas resistentes a drogas [1]. Curiosamente, a expressão GRP78 é significativamente mais forte do que no cancro do cólon em adenoma do cólon e o tecido normal [2]. Além disso, um estudo recente mostrou que GRP78 knockdown eficiente não só suprimiram a proliferação de células cancerígenas do cólon RKO mas também induziu a apoptose precoce das células [3]. Além disso, a regulação negativa GRP78 foi mostrado para resultar na sensibilização do cancro do cólon para a apoptose induzida por paclitaxel [4]. Tomados em conjunto, estes relatórios destacar o papel importante de GRP78 no tratamento terapêutico.

Vários agentes anticancerígenos resultar em estresse oxidativo através da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e induzindo citotoxicidade e apoptose em células de cancro [5]. O stress oxidativo, que ocorre durante a quimioterapia, no entanto, pode interferir com os efeitos citotóxicos de agentes anti-cancro, os quais dependem da rápida proliferação de células cancerosas para actividade óptima [5]. Outros estudos também têm mostrado que o estresse oxidativo moderado pode estimular a proliferação e sobrevivência de células cancerosas através de mecanismos condicionado, enquanto o reforço da ROS superprodução por prooxidants sob estresse oxidativo grave pode resultar em apoptose e morte celular [6]. Na sinalização redox, Nrf2 desempenha um papel crítico na transcrição de uma série de genes que contribuem para a Fase II /III enzimas e a defesa contra o stress oxidativo [7]. Há cada vez mais provas de mutações frequentes de Nrf2 em cancros humanos, o que resulta numa grande quantidade de translocação nuclear de Nrf2 e conduzir à expressão constitutiva de genes de desintoxicação e citoprotectores. As vantagens de crescimento e resistência à apoptose fornecidas por estes genes fornecer quimiorresistência durante a terapia de [8]. Outros relatórios também têm mostrado que o tratamento com medicamentos quimioterapêuticos activa a via Nrf2, que induz os genes citoprotectores e modula a quimiossensibilidade em células [9] do cancro do cólon. Por conseguinte, a inibição da translocação nuclear de Nrf2 pode ser presumido para suprimir a proliferação celular e intensificar a apoptose em tipos de cancro. Tomados em conjunto, estes estudos mostram que o estresse oxidativo e redox jogo regulação papéis importantes na quimioterapia.

Akt é um regulador apoptótica que é activado em muitos cancros e pode promover a resistência aos medicamentos

in vitro

[10 ]. sinais de sobrevivência induzidas por vários receptores são mediadas principalmente por Akt; Assim, a via de Akt pode promover fenótipos resistentes a [11]. A desregulamentação recorrente da sobrevivência Akt em cancros sinalização resultou em um interesse significativo entre os pesquisadores que tentam bloquear esta via para fins de tratamento [12]. Assim, a inibição da via de Akt está a ser considerado como uma nova estratégia para sensibilizar células de cancro a drogas antineoplásicas [13].

A epirrubicina é um derivado de antraciclina doxorrubicina analógico que tem um índice terapêutico melhor do que a doxorubicina [14]. Com a mesma dose, epirubicina provoca menor toxicidade hematológica e cardíaca do que a doxorrubicina [15]. O mecanismo de epirrubicina no citotoxicidade parece envolver a produção de ROS [16]. Até à data, o mecanismo anti-cancro detalhada de epirubicina em células cancerígenas do cólon GRP78 knockdown não foi elucidado. No presente estudo, nós estávamos interessados ​​em compreender o efeito anticancerígeno de epirubicina sobre o potencial apoptótica de GRP78 knockdown em células DLD-1 cancerígenas do cólon humano. Nós também estávamos interessados ​​em compreender o mecanismo de apoptose de GRP78 knockdown sobre o estresse oxidativo, a regulação redox ea via de sobrevivência Akt durante epirrubicina tratamento para que um guia pode ser desenvolvido para a terapêutica anti-neoplásicos adicionais para cancros do cólon humanos.

Materiais e métodos

linha celular, reagentes e produtos químicos

a linha de células de cancro do cólon humano DLD-1 foi obtida a partir da Colecção Bioresource e Research Center (Hsinchu, Taiwan). RPMI-1640 e soro bovino fetal a forma (FBS) foram obtidos a partir de Hyclone (Sul Logan, UT) e Gibco Inc. (Freehold, NJ), respectivamente. Na paragem do agente de transfecção foi obtida a partir de Abrir Biosystems Inc. (Huntsville, AL). O siARN Nrf2, mexidos ARNsi, os anticorpos primários contra a P-Akt (Thr308), Akt, Nrf-2, GSK-3β, β-catenina, SP-1 e GAPDH foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA ). O kit de ensaio de cinase Akt foi adquirida a partir de Cell Signaling Technology (Boston, MA). O reagente de ensaio de proteína Bio-Rad foi adquirido a Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). O kit de ensaio de fosfatase Ser /Tre foi comprado de Millipore Corporation (Billerica, MA). Gaiato de propilo (GP), ditiotreitol (DTT), iodeto de propídio (PI), 2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA), ARNase A isenta de ADNase, sulfóxido de dimetilo (DMSO), azul de tripano, primário anti-actina anticorpo e outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

cultura celular e tratamento

células DLD-1 foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS . A solução estoque de epirubicina foi dissolvido em DMSO, e a concentração tratada (500 ng /ml) foi preparada em meio RPMI-1640.

A geração de células DLD-1 knockdown GRP78

A expressão de GRP78 foi derrubado em células DLD-1 com siRNA. Resumidamente, a sequência alvo para o ARNm GRP78 humana foi 5′-AAGGTTACCCATGCAGTTGTT-3 ‘. A sequência de siRNA mexidos foi 5’-AAGGTGGTTGTTTTGTTCACT-3 ‘. O siARN GRP78 e mexidos siRNA foram inseridos no vector de pSUPERIOR e transfectado para células DLD-1. As células que foram transfectadas com sucesso e foram seleccionadas por resistência a antibióticos tal como anteriormente descrito [17] – [19]. No presente estudo, as células DLD-1 transfectadas com GRP78 siRNA foram nomeados células GRP78 knockdown, e as células DLD-1 transfectadas com siRNA mexidos foram nomeados células controle mexidos. A expressão de GRP78 nas células de controlo mexidos e as células GRP78 knockdown foi avaliada por Western blotting.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. As células (1 x 10

6) foram cultivadas em placas de cultura de tecido de 60 mm durante 24 h. O meio de cultura foi substituído com meio novo, e as células foram expostas a epirrubicina durante 48 h. Após o tratamento, a mistura foi feita com 1 parte de 0,4% de azul de tripano e uma suspensão de células parte. A mistura foi então incubada durante aproximadamente 3 minutos à temperatura ambiente, uma gota da mistura azul /célula de tripano foi aplicado a um hemacitómetro e a não corado (viável) e coradas células (não viáveis) foram contadas separadamente no hemacitómetro.

danos no ADN e análise do ciclo celular

danos no ADN e o ciclo celular foi avaliado por coloração com PI e citometria de fluxo. As células (1 x 10

6) foram cultivadas em pratos de 60 mm de cultura de tecidos durante a noite. O meio de cultura foi substituído com meio fresco, e as células foram tratadas com epirrubicina durante 48 h. Após o tratamento, as células foram recolhidas, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), fixadas em PBS-metanol solução (01:02, volume /volume), e mantida a 4 ° C durante pelo menos 18 h. Após uma lavagem com PBS, as peletes de células foram coradas com uma solução de PI (PBS, 40? G /PI ml, e 40 ug /ml de ARNase A isenta de ADNase) durante 30 min à temperatura ambiente, no escuro e analisadas por um Becton-Dickinson citómetro de fluxo FACScan (Franklin Lakes, NJ). Pelo menos 10.000 células foram contadas por amostra, e os histogramas de ADN foram ainda avaliados utilizando o software Modfit sobre uma estação de trabalho PC para calcular a percentagem de células nas várias fases do ciclo celular e para quantificar as células com danos no DNA (subg

1 fase).

intracelular ROS medição

A produção de ROS intracelular foi detectada por citometria de fluxo utilizando DCFH-dA. Após o tratamento, as células foram lavadas uma vez com PBS, tratadas com 20? M DCFH-DA, durante 30 minutos no escuro, lavadas novamente com PBS, recolhidas por centrifugação e suspensas em PBS. níveis intracelular ROS, que foram indicados pela fluorescência da diclorofluoresceína (DCF), foram medidos através de um filtro de barreira 530/22-nm usando um Becton-Dickinson FACScan citômetro de fluxo.

Nrf2 siRNA transfecção

para interromper a expressão do gene de Nrf2, três conjuntos de oligonucleótidos foram concebidos de ARNsi: (1) 5′-GCAUGCUACGUGAUGAAGAtt-3 ‘(sentido) e 5′-UCUUCAUCACGUAGCAUGCtt-3′ (anti-sentido); e (2) 5’-CUCCUACUGUGAUGUGAAAtt-3 ‘(sentido) e 5′-UUUCACAUCACAGUAGGAGtt-3′ (anti-sentido); e (3) 5’-GUGUCAGUAUGUUGAAUCAtt-3 ‘(sentido) e 5′-UGAUUCAACAUACUGACACtt-3’ (anti-sentido). As células (4 × 10

5) foram cultivadas em placas de 60-mm em 5 ml de meio RPMI-1640 complementado por 10% de FBS e foram transfectadas, a 40% de confluência, adicionando Detenção-in agente de transfecção (Huntsville, AL) e Nrf2 siRNA. As células de controlo foram tratados com a prisão-in agente de transfecção e o siRNA mexidos [5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘(sentido) e 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’ (anti-sentido)], que não levam à degradação específica de quaisquer mensagens celulares . As células foram lavadas com meio, após 25 min de incubação e, em seguida, mantido em cultura durante um adicional de 24 h. A expressão Nrf2 nuclear foi avaliado por Western blotting.

Akt actividade de quinase de ensaio

a actividade de quinase Akt foi detectada utilizando o kit de ensaio de cinase Akt não radioactiva. Resumidamente, células cultivadas em pratos de 60-mm foram tratados com 500 ng /ml de epirubicina ou veículo como controlo. Depois de epirrubicina tratamento, as células foram lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo e colhidas com um tampão de lise celular [Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton, pirofosfato de sódio 2,5 mM , 1 mM de β-glicerofosfato, 1 mM de Na

3VO

4, e 1 ug /mL de leupeptina]. O teor de proteínas foi medida utilizando um reagente de ensaio de proteína Bio-Rad. Akt quinase foi imunoprecipitada a partir do extracto celular (300 ug de proteína) utilizando um anticorpo monoclonal de coelho conjugado talão-fosfo-Akt (Ser473) e incubadas com agitação suave durante a noite a 4 ° C. Os sedimentos foram lavados duas vezes com um tampão de lise celular e, em seguida, lavada duas vezes com 500 de tamp de quinase μ1. Os peletes foram suspensos em 50 ul de tampão de quinase suplementado com 1 ul de ATP 10 mM e uma quantidade apropriada de substrato da quinase (proteína de fusão de GSK-3) durante 30 min a 30 ° C. A reacção foi terminada com 25 ul de 3 × tampão de amostra de SDS. A fosforilação da proteína de fusão GSK-3 foi detectado por western blot com antiphospho-GSK-3α /β (Ser21 /9) anticorpo monoclonal de coelho.

A proteína fosfatase 2A (PP2A) atividade ensaio

PP2A a actividade foi ensaiada utilizando o kit de ensaio de fosfatase Ser /Thr. Resumidamente, as células foram lisadas com tampão de lise, tal como sugerido pelo protocolo incluído no estojo. Uma alíquota correspondente a 50 ug de proteína foi utilizada para avaliar a actividade de PP2A, utilizando o protocolo do fabricante. A absorvância da solução de reacção foi medida em placas de 96 poços a 405 nm num leitor de microplacas (Bio-Rad, Richmond, CA).

análise de transferência de Western

Após o tratamento, as células foram lavadas com PBS, ressuspensas num tampão de extracção de proteína durante 10 minutos, e centrifugou-se a 12000 × g durante 10 min a 4 ° C para se obter as proteínas extraídas (sobrenadante). As concentrações de proteína foram medidas com um reagente de ensaio de proteína Bio-Rad. As proteínas celulares extraídas foram fervidas em tampão de carregamento, e uma alíquota correspondente a 50-100 ug de proteína foi separada num gel de SDS-poliacrilamida a 12%. Após a electroforese, as proteínas foram electrotransferidas para uma membrana de polivinilideno de transferência de fluoreto. Após a secagem, as membranas foram incubadas com vários anticorpos primários durante a noite e, em seguida, lavada com uma solução de PBST (Tween 20 a 0,05% em PBS). Após lavagem, adicionou-se o anticorpo secundário, o qual foi marcado com peroxidase de rábano, para a membrana durante 1 h e, em seguida, lavou-se com uma solução de PBST (Tween 20 a 0,05% em PBS). Os complexos antigénio-anticorpo foram detectados por quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) com um analisador de quimioluminescência.

A análise estatística

Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão de pelo menos três experiências independentes e foram analisados ​​utilizando

t

testes de Student. A

valor P

inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo [20].

Resultados

knockdown GRP78 aumentou a morte celular e apoptose induzida por epirrubicina tratamento

a Figura 1A mostra a expressão de GRP78 nas células de controlo scrambled DLD-1 e as células DLD-1 knockdown GRP78. As células DLD-1 GRP78 knockdown mostrou uma menor expressão de GRP78 do que as células de controlo mexidos DLD-1. Nós ainda avaliada a viabilidade celular e apoptose após epirrubicina tratamento no knockdown GRP78 e mexidos células controle DLD-1. A Figura 1B mostra que a viabilidade celular foi significativamente diminuída nas células GRP78 knockdown em comparação com as células de controlo mexidos após 48 h de 500 ng tratamento epirrubicina /ml. Além disso, a percentagem de apoptose das células GRP78 knockdown (83,17%) foi muito mais elevada do que a percentagem que se verifica nas células de controlo scrambled (35,12%) 48 h após o tratamento epirubicina (Figura 1C). Estes resultados sugerem que GRP78 é uma proteína alvo para a morte celular induzida por epirubicina e apoptose em DLD-1 do cancro do cólon.

(A) Análise de expressão GRP78 nas células DLD-1 mexidos e GRP78 knockdown por Western blotting . Análise de (B) a viabilidade celular e a apoptose (C) após o tratamento com veículo (controle) e epirrubicina (epi). Mexidos controlo e as células DLD-1 knockdown GRP78 foram tratados com epirubicina (500 ng /ml) durante 48 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. As percentagens de células que estavam no subg

1 fase (indicado por danos no DNA) foram determinadas conforme descrito no

Materiais e Métodos

. Os valores são representados como a média ± desvio padrão (n = 5-8) das experiências individuais. diferenças significativas para o grupo controle eo grupo controle mexidos são

P Art 0,05 (*) e

P Art 0,05 (#), respectivamente. Estas experiências foram realizadas pelo menos 3 vezes, e uma experiência representativa é apresentado.

GRP78 knockdown reduzida intracelular induzida por epirubicina ROS

Para avaliar o estresse oxidativo intracelular, intracelular ROS foram avaliados por coloração DCFH-DA nas células de controle mexidos e as células GRP78 knockdown. A Figura 2A mostra que as células GRP78 knockdown exibiu 7 a 10 vezes de maior DCF fluorescência que as células controle mexidos após 24-48 h de cultura, que indicou que o estresse oxidativo significativa existia nas células GRP78 knockdown. O tratamento das células de controlo mexidos com epirrubicina resultou em aumentos de ROS 1.3- e 1,5 vezes a 24 e 48 horas em comparação com as células de controlo sem mexidos epirubicina (Figura 2B). Em contraste, intracelular ROS foram diminuiu 0.65- e 0,81 vezes nas células tratadas com GRP78 knockdown epirrubicina a 24 e 48 horas em comparação com as células GRP78 knockdown sem epirubicina (Figura 2B). A dose de epirrubicina mais de 500 ng /ml não aumentou o ROS na GRP78 knockdown células DLD-1. Epirrubicina inibiu a ROS de uma maneira dependente da dose nas células DLD-1 knockdown GRP78 (Figura 2C). Estes resultados sugerem que a redução intracelular ROS pode intensificar a apoptose em células de controlo tratadas com epirrubicina mexidos. Quando o PG e DTT antioxidantes, que são usados ​​para diminuir intracelular ROS, foram adicionadas às células de controlo tratadas com mexidos epirubicina, a apoptose foi aumentado de 35.12% a 53.18% e 83.06%, respectivamente (Figura 2D). Curiosamente, nem o PG DTT sozinho, nem poderia induzir a apoptose nas células de controlo codificados.

controlo mexidos e células DLD-1 knockdown GRP78 foram (A) cultivadas durante 24 a 48 h, ou (B) tratou-se com epirubicina (500 ng /ml) durante 24 ou 48 h. (C) As células DLD-1 GRP78 knockdown foram tratados com epirubicina (500, 750, 1000 ng /ml) durante 48 h. Intracelular ROS foram avaliados por coloração DCFH-DA e citometria de fluxo, conforme descrito no

Materiais e Métodos

. (D) mexidos células DLD-1 de controlo foram tratados com 500 ng /ml de epirrubicina (epi) sozinha, 25 uM galato de propilo (PG) sozinho, ditiotreitol 1 mM (DTT) sozinho ou combinado com PG epirubicina ou DTT, durante 48 h. As percentagens de células que estavam no subg

1 fase (indicado por danos no DNA) foram determinadas conforme descrito no

Materiais e Métodos

. Os valores são representados como a média ± desvio padrão (n = 5-8) das experiências individuais. Uma diferença significativa entre o grupo controle foi fixado em

P

. 0,05 (*)

Nrf2 está envolvido no mecanismo de defesa nas células GRP78 knockdown

Nrf2 é um factor de transcrição que responde a estimulação intracelular ROS e transloca-se para o núcleo através da ligação ao elemento de resposta antioxidante e transcrição de enzimas de fase II. Estudamos translocação nuclear Nrf2 nas células de controle mexidos e as células GRP78 knockdown. A Figura 3A mostra que a translocação nuclear de Nrf2 aumentou aproximadamente 1,6 vezes nas células GRP78 knockdown em comparação com as células de controlo codificados. Nós também avaliamos se Nrf2 translocação nuclear desempenhou um papel defensivo contra a apoptose induzida por epirubicina nas células GRP78 knockdown. As células GRP78 knockdown foram tratados com Nrf2 ARNsi durante 24 h para inibir a expressão de Nrf2 antes da incubação com epirrubicina durante 48 h. Após a incubação de epirubicina, a apoptose foi avaliada por citometria de fluxo. A Figura 3B mostra que, expressão Nrf2 foi marcadamente inibida por Nrf2 ARNsi nas células GRP78 knockdown, e a Figura 3C mostra que a apoptose foi significativamente aumentada por tratamento Nrf2 ARNsi nas células GRP78 knockdown tratados com epirrubicina, o que indica que Nrf2 fornecido um importante mecanismo de defesa quando GRP78 foi derrubado em células dos DLD-1.

(a) Scrambled células DLD-1 de controlo e GRP78 knockdown foram cultivadas por 48 h, e expressão Nrf2 nuclear foi avaliada por western blot. (B) O GRP78 knockdown células DLD-1 foram pré-tratadas com siRNA mexidos (sc) ou siARN Nrf2 durante 24 h, e expressão Nrf2 nuclear foi avaliado por Western blotting. (C) O GRP78 células DLD-1 knockdown foram pré-tratadas com siRNA mexidos (mistura) ou siARN Nrf2 durante 24 h e tratou-se com 500 ng /ml de epirrubicina (epi) por mais 48 h. Após o tratamento, a percentagem de células que estavam no

1 fase subg indicado por dano ao DNA foi determinada conforme descrito no

Materiais e Métodos

. Estas experiências foram realizadas pelo menos 3 vezes, e uma experiência representativa é apresentado.

GRP78 knockdown reforçada a inibição mediada por epirubicina da Akt

Há cada vez mais evidências de que a Akt via fornece uma ligação entre os sinais extracelulares de sobrevivência e os factores que induzem eventos apoptóticos no interior das células [21]. Para investigar se a Akt está envolvido em apoptose mediada por epirubicina, examinou-se o estado de fosforilação de Akt em células de controlo e mexidos a GRP78 células knockdown após tratamento epirrubicina. Os lisados ​​celulares foram preparados, e o nível de fosforilação de Akt foram analisados ​​por transferência de Western com o anticorpo anti-fosfo-Akt (Thr308). Akt fosforilação foi diminuída para um maior grau nas células GRP78 knockdown em comparação com as células de controlo mexidos após 24 e 48 h de tratamento epirubicina (Figura 4A). Nós também investigou os efeitos da epirrubicina sobre a atividade Akt quinase usando imunoprecipitação e técnicas de transferência de Western. Epirrubicina inibiu o nível de fosforilação de GSK-3α /3β, (como se viu com a actividade de Akt quinase) em ambas as células de controlo mexidos e as células GRP78 knockdown, e a diminuição da actividade de Akt quinase parece ser reforçada no knockdown GRP78 células às 48 h (Figura 4B). Uma vez descobertas recentes sugeriram que a proteína GSK-3β, que tem um papel chave na apoptose de stress-responsivo, é um dos substratos de proteínas a jusante de Akt quinase [22], a supressão induzida por epirrubicina de fosforilação de Akt pode inibir dependente de Akt fosforilação de GSK-3β. Para testar esta possibilidade, os lisados ​​de proteína total preparado a partir de células de controlo tratadas mexidos-epirubicina e células GRP78 knockdown foram sujeitos a imunotransf erência com um anticorpo fosfo-GSK-3β que reconhece especificamente a GSK-3β fosforilada em Ser-9. Mexidos células de controlo e células GRP78 knockdown exibiram reduções significativas na fosforilação por GSK-3β, e o nível mais elevado de inibição ocorreu nas células incubadas com GRP78 knockdown epirubicina durante 48 h (Figura 4C). Estes resultados sugerem que a inibição da cascata de sinalização de Akt estava aumentado por o knockdown GRP78 em células tratadas com epirrubicina.

controlo mexidos e células DLD-1 knockdown GRP78 foram tratados com epirubicina (500 ng /mL) para o vezes indicado. A fosforilação de (A) e Akt (C) GSK 3β foi avaliada por Western blotting. (B) A atividade Akt foi determinada conforme descrito no

Materiais e Métodos

. A proteína na membrana de PVDF corada com azul de Coomassie brilhante é mostrado como um controlo interno. Estas experiências foram realizadas pelo menos 3 vezes, e uma experiência representativa é apresentado.

GRP78 knockdown melhorou a infra-regulação mediada por epirubicina dos alvos a jusante da via Akt

Nós investigamos se inibição da via de sinalização de Akt tinha um efeito sobre alvos a jusante em células de controlo e células mexidos GRP78 knockdown tratados com epirrubicina. β-catenina é um alvo de GSK-3β que está implicada na resistência à apoptose e sobrevivência de sinalização [23], e aumento da expressão de β-catenina foi correlacionada com a sobrevivência aumentada no cancro [23]. Um exame de expressão β-catenina revelou que não foi significativamente alterada nas células de controle mexidos depois de 24 ou 48 h de tratamento epirubicina. Uma redução na expressão β-catenina, no entanto, foi observada após 48 h de tratamento, as células em epirubicina GRP78 knockdown (Figura 5).

controlo mexidos e células DLD-1 knockdown GRP78 foram tratados com epirubicina (500 ng /mL) durante os tempos indicados, e a expressão de β-catenina foi avaliada por western blotting. Estas experiências foram realizadas pelo menos 3 vezes, e uma experiência representativa é apresentado.

GRP78 knockdown atividade da fosfatase 2A reforçada proteína com tratamento epirubicina

Vários estudos têm demonstrado ligações entre o Akt e fosfatases. Por exemplo, a PP2A foi mostrado ser uma fosfatase Akt chave que pode desfosforilar Akt em ambos os resíduos de Thr e Ser 308 493 e bloquear a via de Akt [21]. Nós ainda determinar se a expressão e actividade de PP2A estava envolvido na apoptose induzida por epirubicina nas células de controle mexidos e GRP78 células knockdown. A Figura 6A mostra que a expressão de PP2A diminuiu nas células de controlo tratadas com epirrubicina mexidos após 48 h de tratamento. Por outro lado, a expressão de PP2A foi aumentada às 24 horas e não diminuiu em 48 h nas células tratadas com GRP78 knockdown epirubicina. A actividade de PP2A foi ligeiramente diminuída em 24 h, e diminuiu significativamente em 48 h nas células de controlo tratadas com epirrubicina mexidos. Em contraste, a actividade de PP2A aumentou significativamente cerca de 2 vezes em 24 horas nas células tratadas com GRP78 knockdown epirubicina (Figura 6B). PP2A actividade não diminuiu significativamente em 48 h nas células tratadas com GRP78 knockdown epirubicina. Estas experiências demonstraram uma relação clara entre o aumento da actividade de PP2A e a indução da apoptose por meio da inibição da via de Akt nas células GRP78 knockdown durante epirrubicina tratamento. Este destacou a importância de GRP78 knockdown para a inibição da DLD-1 a proliferação das células.

controle mexidos e células DLD-1 knockdown GRP78 foram tratados com epirubicina (500 ng /ml) durante os tempos indicados. (A) A expressão de PP2A foi avaliada por transferência de Western, e (B) a actividade de PP2A foi determinada tal como foi apresentado no

Materiais e Métodos

. Estas experiências foram realizadas pelo menos 3 vezes, e uma experiência representativa é apresentado.

Discussão

Uma característica comum de muitos cânceres é seus níveis aumentados de ROS. A fonte principal destes ROS é o aumento da actividade metabólica [21]. ROS níveis elevados e a translocação nuclear de Nrf2 nas células GRP78 knockdown indicou que GRP78 desempenha um papel homeostático redox em células DLD-1. Na presença de GRP78, apenas a epirubicina induziu um baixo nível de ROS ( 2 vezes) em células DLD-1, e um baixo nível de ROS pode resultar na activação de sistemas antioxidantes específicos nas células cancerosas que podem induzir resistência a quimioterapia. Curiosamente, os antioxidantes DTT e PG tanto aumentou o efeito apoptótico de epirubicina nas células de controlo codificados. A redução de ROS por epirrubicina nas células GRP78 knockdown destaque a possibilidade de que o aumento dos níveis de ROS nas células DLD-1 pode ter um efeito directo sobre os percursos de sobrevivência celular.

GRP78 é um acompanhante que existe no ER. Em células átonas, as proteínas ER transmembrana (PERK e IRE1) são mantidos em um estado inativo através da fixação de GRP78 em seus domínios ER-luminal [24]. Em geral, os domínios do lúmen do formas inactivas de PERK e IRE1 são compostos de 1:1 complexos com GRP78 [25]. Uma vez que o stress ER ocorre, disjoins GRP78 e liga-se com as proteínas não dobradas ou deformadas, que permite a homo-oligomerização de PERK, IRE1 ou ambos, e resulta na autofosforilação destas enzimas e a activação dos seus substratos [24]. Nrf2 é um substrato directo de PERK e um efector de sobrevivência celular PERK-dependente [26], o que explica que o knockdown GRP78 DLD-1 células expressaram uma grande quantidade de Nrf2 nuclear.

Nrf2 actua como um sensor para o stress oxidativo e regula a activação de genes de defesa, o que leva a protecção das células contra os efeitos adversos do stresse oxidativo e promove a sobrevivência de células [27]. Em muitas células cancerosas, Nrf2 mostra características pró-tumorais que são semelhantes aos dos genes idênticos citoprotectores que pode aumentar a resistência de células de cancro a drogas quimioterapêuticas [8]. Por exemplo, Fluorouracilo estimula a via Nrf2, que modula a quimiossensibilidade e induz os genes citoprotectores em células HT-29 do cancro do cólon [9]. Nrf2 é um factor de transcrição essencial que controla uma resposta protectora contra insultos tóxicos a partir de uma vasta gama de substâncias químicas [25]. Nos últimos anos, estudos têm demonstrado o papel de Nrf2 na protecção contra ambos os novos e actuais fármacos quimioterapêuticos em cancros do sangue [8]. superexpressão Nrf2 também foi observada no cancro pancreático [7]. Além disso, um estudo mostrou que a sobre-expressão estável de Nrf2 em células cancerosas induz um nível mais elevado de resistência aos agentes quimioterapêuticos, incluindo doxorrubicina, etoposido e cisplatina [25]. Outros relatos sugeriram que a estratégia de utilização de inibidores de Nrf2 para aumentar a eficácia de agentes quimioterapêuticos, não é restrita a fármacos anti-cancerígenos ou de certos tipos de cancro. Na verdade, os inibidores Nrf2 pode ser utilizado durante a quimioterapia para tratar vários tipos de câncer [25]. O presente estudo revelou que a apoptose foi reforçado por tratamento epirubicina nas células GRP78 knockdown tratados com siRNA Nrf2, o que sugere que Nrf2 desempenha um papel defensivo importante nas células GRP78 knockdown.

Um estudo recente revelou que o silenciamento de Lin et ai.