Abstract
Fundo
A ativação da autofagia tem sido amplamente descrito como uma estratégia de pró-sobrevivência, o que ajuda a manter as células vivas após a privação de nutrientes /factores de crescimento e de outras condições de stress celular. Em adição aos efeitos citoprotectores, autofagia pode acompanhar a morte celular. vacúolos autophagic pode ser observada antes ou durante a morte celular, mas o papel da autofagia no processo de morte é ainda controversa. A complexa interação entre autofagia e apoptose veio à luz, tendo em conta que numerosos genes, como p53 e membros da família Bcl-2, são compartilhados entre esses dois caminhos.
Metodologia /Principais Achados
neste estudo mostrou uma actividade citotóxica potente e irreversível do derivado curcumina estável
bis
-DeHydroxyCurcumin (bDHC) em células cancerígenas do cólon humano, mas não em células humanas normais. A autofagia é provocada por bDHC antes da morte de células, como demonstrado pelo aumento da formação autophagosome -measured por microscopia eletrônica, puncta LC3 fluorescente e lipidation- LC3 e fluxo autofágica -measured interferindo volume de negócios LC3-II. A acumulação de proteínas ubiquitinada-poli e ER-stress ocorrido a montante da indução de autofagia e resultou na morte celular. ciclo celular e análises de Western blot em destaque a activação de uma apoptose dependente de mitocôndrias, que envolve a caspase 7, 8, 9 e a libertação de citocromo C. Usando inibições farmacológicas e experimentos RNAi, mostramos que a ER-stress autofagia induzida tem um papel importante no desencadeamento de morte celular bDHC.
Conclusão /Significado
Nossas descobertas descrever o mecanismo através do qual bDHC promove tumor inibição selectiva da proliferação, fornecendo uma evidência inequívoca do papel da autofagia em contrastar a proliferação de células cancerígenas do cólon
Citation:. Basile V, Belluti S, Ferrari E, Gozzoli C, Ganassi S, Quaglino D, et ai. (2013) bis-de-hidroxi-curcumina Triggers Mitocondrial-Associado morte das células cancerígenas do cólon humano através ER-stress induzido autofagia. PLoS ONE 8 (1): e53664. doi: 10.1371 /journal.pone.0053664
editor: Regine Schneider-Stock, Instituto de Patologia, Alemanha |
Recebido: 12 de junho de 2012; Aceito: 03 de dezembro de 2012; Publicação: 11 de janeiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Basile et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-MFAG (número de concessão 6192 para CI) e Fondazione Cassa di Risparmio di Vignola a CI e EF. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a apoptose, também conhecida como morte celular do tipo I, o mecanismo é melhor descrito de morte celular e é caracterizada morfologicamente por encolhimento celular, formação de bolhas de membrana, a condensação nuclear e a formação de corpos apoptóticos [1]. Uma cascata dependente de energia de eventos moleculares coordena o processo de apoptose, o qual pode ser distinguida em duas vias principais: a via extrínseca de receptor de morte e a via mitocondrial intrínseca. Os dois caminhos parecem estar ligados e influenciou um ao outro e ambos desencadear a activação das caspases 3, 6 e 7, proteases alvo cem proteínas e levando a célula de demolição [2].
Além de apoptose, autofagia tem sido descrito como um processo celular alternativa auto-destrutiva. Autophagy tem sido desde há muito conhecido proporcionar sobrevivência celular seguintes nutrientes /factores de crescimento privação ou outras condições de stress, e só mais recentemente, tem sido associada à morte celular. Também conhecida como morte celular do tipo II, a activação autofagia é caracterizada pela presença de vacúolos autofágicos no citoplasma, e o alargamento do retículo endoplasmático (ER) e no aparelho de Golgi [3]. vesículas de dupla membranados autofágicos encapsular citoplasma e organelas e, após a sua fusão com lisossomos, autophagolysosomes degradar os seus conteúdos [4]. A via autofagia clássico age a jusante do mTOR (alvo da rapamicina em mamíferos) quinase. Quando esta quinase Ser /Thr está associado no complexo de proteína mTORC1, é capaz de suprimir a maquinaria autophagic. 16 proteínas relacionadas com autophagy (ATG) foram descritos para participar com a via autofagia [5], e a maioria deles desempenhar um papel no processo complexo de dupla-membranados formação de vesículas e crescimento, a jusante de mTORC1 [6]. Embora a inibição da via de mTORC1 é o mecanismo através do qual o mais conhecido autofagia é induzida, muitas outras cascatas de sinalização e eventos de transcrição pode estar envolvida na activação do processo autophagic. Em particular, várias quinases controlar diferentes etapas deste processo catabólico, tais como a AMP-activated protein quinase, Akt, proteína quinase activada por mitogénio (ERK, JNK e p38) e proteína cinase C [7].
A papel de autofagia na sobrevivência das células, em vez de morte celular é dependente do contexto celular e do tecido, bem como da natureza do estímulo de stress [8]
apoptose e morte celular autophagic são vias não se excluem mutuamente:. puderem induzir a morte celular em simultâneo e de forma cooperativa (para uma revisão veja-se [9]). morfologias autophagic de células são observados pouco antes ou durante a morte celular; embora, se a autofagia é o mecanismo pelo qual as células morrem e, na verdade, se a morte celular é executado por autofagia ou com autofagia ainda é discutido [10].
A distinção entre a morte celular por apoptose e autophagic é ainda mais complicada por dois considerações: i) das várias tensões celulares provocando vias de transdução de sinal podem provocam tanto a apoptose e autofagia e II) muitas proteínas essenciais para autofagia também estão envolvidos na morte celular apoptótica, como Atg5, o factor de p53 transcrição e os membros da família Bcl-2.
p53 é um bem conhecido oncosuppressor, activado após uma variedade de estímulos de estresse, e responsável pela regulação da transcrição de ambos os genes pró e anti-apoptóticos. Enquanto os genes pró-apoptóticos, tais como Bax, Puma e Noxa está regulado para cima, os anti-apoptóticos, como Bcl-2α, são down-regulada por p53 nuclear. Também p53 citoplasmaticamente localizada tem sido mostrado para ser importantes no controlo da resposta apoptótica, através da indução de Bax oligomerização nas mitocôndrias ou soltando os pró-apoptóticos BH3-apenas proteínas de seus parceiros anti-apoptóticos Bcl-2 /Bcl-XL [11] .
O papel da p53 na supressão do tumor também foi atribuída à sua actividade na regulação autofagia. a activação mediada por p53 da autofagia leva a morte celular por meio de transactivação da proteína indutora de DRAM autofagia e inactivação da via mTOR [12], [13]. Em oposição, a inibição farmacológica e inativação do p53 sugerem uma regulação negativa da autofagia através de mecanismos independentes de transcrição [14].
Além de p53, os membros da família Bcl-2 são jogadores comuns da apoptose e autofagia. Eles são fundamentais para a regulação da permeabilização da membrana mitocondrial externa (MMP), que é responsável pela libertação para o citoplasma de proteínas que medeiam a morte celular, tais como o citocromo C. proteínas Bcl-2 têm sido mostrados para inibir a autofagia por perturbar a Bcl -2 /complexos Bcl-XL-beclin-1 [15]. Não é clara a forma como a Bcl-2 proteínas participam na apoptose
relação
o processo autophagic, mas as duas funções diferentes poderia ser determinada por localizações de proteínas nas mitocôndrias, em vez de ER [16]. níveis relativos de proteína Bcl-2 e beclin-1 surgiu entre os vários factores celulares que controlam se autofagia contribui para a inibição do cancro ou de sobrevivência (revisto em [17]).
Vários produtos naturais e as drogas são capazes de induzir células de cancro morte por meio da ativação da autofagia ou visando as vias de autofagia [18]. Tamoxifeno, Imatinib, Resveratrol e curcumina são exemplos de moléculas que exercem a sua actividade citotóxica contra células cancerosas
via
indução de morte celular autofágica [17], [18].
A curcumina, o componente ativo encontrado no rizoma da atividade terapêutica
Curcuma longa
, tem demonstrado contra vários tumores. Pode inibir a sobrevivência de células de iniciação, progressão tumoral e [19]. Em particular, modelos de ratos e humanos ensaios clínicos demonstrou seu potencial quimiopreventivo para o cancro colorectal [19]. Em linhas celulares de carcinoma colorrectal, curcumina inibe a proliferação celular através da indução de uma fase G2 /M do ciclo celular ou prisão apoptose quando utilizado em doses elevadas [20], [21]. Além disso, a modulação de vias apoptóticas celulares por curcumina foi recentemente observada em células cancerosas de pacientes com cancro colorrectal [22].
Microarray estudos mostraram que a apoptose induzida por curcumina é regulada por várias vias de sinalização [23], [24]. A curcumina up-regula as proteínas pró-apoptóticos (Bax, Bim, Bak, Puma e Noxa) e para baixo-regula os anti-apoptóticos (Bcl-2 e Bcl-XL) em células de câncer diferentes, desencadeando a liberação de citocromo C e a activação de caspase 3 [24]. No melanoma humana, HL-60 leucemia e células gástricas, curcumina activa a apoptose através do receptor de Fas /caspase 8 via de [25], [26], [27]. Além da actividade apoptótica, curcumina induz ER stress em várias células tumorais humanas, dentre as quais as células lipossarcoma [28], as células não pequenas do cancro do pulmão de células [29] e células de leucemia [30].
O processo de autofagia participa das atividades anti-proliferativa e apoptóticos de curcumina, ambos
in vitro
e
in vivo
: em células cancerosas e em um rato modelo de xenotransplante, curcumina e do seu metabolito tetra-hidrocurcumina inibir o crescimento de células malignas através da activação de morte celular autofágica
via
sinalização Akt /mTOR /p70S6K e ERK1 /2 vias [31], [32], [33]. Em células de glioma início, os resultados da administração curcumina na supressão do tumor por causa dos eventos de diferenciação induzida por autofagia [34].
Apesar de inibição curcumina de vias moleculares fundamentais da tumorigênese, ensaios clínicos revelou uma baixa biodisponibilidade, distribuição tecidual limitado e metabolismo rápido [35]. 90% de curcumina se decompõe rapidamente em condições neutras e básicas através da oxidação, redução, glucuronidação e sulfatação [28], [29]. Para superar estas limitações, os análogos naturais e sintéticos têm sido sintetizados, entre os quais
bis
-DeHydroxyCurcumin (bDHC) (Fig. 1A, painel esquerdo). Células de administração bDHC durante 72 horas a concentrações IC50 resultou numa ligeira diminuição da actividade anti-proliferativa em comparação com Curcumina em linhas celulares de cancro de próstata independente e dependentes de androgénio e em linhas celulares de cancro da mama independentes de dependentes de estrogénio e [36], [37].
A. Painel esquerdo: Estrutura do bDHC. Painel da direita: efeito dose-resposta de bDHC na viabilidade celular após 24 horas de tratamento, comparado com o controlo e as células tratadas com DMSO. B. Análise de PI /FACS da progressão do ciclo celular após DMSO, curcumina (10 uM) e bDHC (30 uM) para tratamentos de 16 e 24 horas (esquerda e direita do painel, respectivamente). Os eventos indicados são médias de dez experiências independentes (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). C. PI /BrdU análise bivariada FACS de 16 e 24 horas tratamentos com DMSO, curcumina e bDHC. A análise foi fechado para excluir população SubG1. Painel esquerdo D.: A percentagem de células positivas para anexina V mediante tratamento de 24 horas com bDHC é comparado com DMSO e células tratadas com curcumina. Os dados são médias de três experiências independentes – /+ SD. painel médio: PI /análise do ciclo celular monoparametric de células tratadas com bDHC
contra
bDHC células liberadas por 24 horas em meio fresco. Os eventos são indicados como meio de três experiências independentes (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). Painel da direita: os níveis de expressão γ-H2AX
contra
actina em células tratadas com bDHC por 24 horas
Neste relatório, foi investigada a eficácia inibitória tumor-seletiva de bDHC na. proliferação de células de cancro colorrectal humano. Em comparação com a curcumina, bDHC é mais activo na indução de um efeito citotóxico irreversível em HCT116 e células LOVO, mas não nas células humanas normais.
A acumulação de proteínas ubiquitinadas-poli e a indução do stress ER são sinais a montante de autofagia, o que desencadeia a apoptose dependente da mitocôndria. A inibição farmacológica e RNAi mediada por ER-stress e autofagia destaca que autofagia potencia o efeito anti-proliferativo de bDHC. Os nossos estudos demonstram que bDHC age como um fármaco citotóxico pró-autofágica, revelando seu potencial terapêutico no combate seletivamente o desenvolvimento do tumor.
cultura celular Materiais e Métodos Comprar e drogas
Humano colorectal carcinoma HCT116, HCT116 /E6 e HCT116 Bax – /- foram generosamente fornecidos por Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). As células foram cultivadas em meio de Iscove Modified de Dulbecco (IMDM), suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (FCS). fibroblastos humanos primários (HF) foram cultivadas em DMEM 10% de FCS, com glutamina (2 mM) e gentamicina (55 mg /L). células epiteliais WRL68 hepáticas fetais humanos e células LOVO adenocarcinoma de cólon foram mantidas em meio DMEM suplementado com FCS a 10%. tempo de duplicação foi estimado em 16 horas para HCT116 e células tumorais LOVO, e 24 horas para HF e WRL68 células normais.
Curcumina [1,7-bis [3-metoxi-4-hidroxi-fenil] hepta-1,6-dieno-3,5-diona] e bDHC [1,7-bis [3-metoxi-fenil] hepta-1,6-dieno-3,5-diona] foram sintetizados como descrito anteriormente [20 ]. A pureza dos compostos sintetizados, determinadas por técnicas de RMN e análise de combustão, foi 98%. A curcumina e bDHC foram adicionados a meio de aquecer a 10 uM e 30 uM de concentrações, respectivamente. C3-bDHC foi administrada às células a 3 uM de concentração. As células HCT116 foram incubadas com adriamicina (1,3 uM) durante 48 horas. Para inibições farmacológicas, as células foram pré-tratados durante 1 hora e depois co-incubadas com bDHC por mais 16 ou 24 horas com 25 mM zVAD-fmk (Enzo Life Sciences), 5 mM LEVD-fmk (Enzo Life Sciences), 3? M A wortmanina (Enzo Life Science), 2 uM ciclo-heximida (Sigma Aldrich), cloroquina 20 uM (Sigma Aldrich), 50 | iM Salubrinal (Santa Cruz). Tapsigargina (Sigma Aldrich) foi administrado às células durante 36 horas com uma concentração de 1 uM.
análise de citometria (FACS)
análise do ciclo celular de citometria de fluxo foi realizada como previamente descrito [20]. coloração por fluorescência indireta foi realizada utilizando anti-fosfo-histona H3 (Ser10) (Cell Signaling # 9706) e mouse anticorpos anti-FITC (Dako # F0313). As células foram recolhidas depois de tratamentos com drogas, lavadas duas vezes com PBS 1 ×, fixadas em formaldeído a 1% durante 10 min a 37 ° C, e pós-fixadas com 90% de metanol, o.n. a -20 ° C. Depois de permeabilização com 0,25% de Triton X-100 em PBS 1 × durante 5 minutos, as células foram coradas com o anticorpo primário (01:25) o.n. a 4 ° C, e o anticorpo secundário (01:50) durante 2 horas adicionais a 4 ° C. As células foram então tratadas com ARNase A durante 40 min, incubadas com iodeto de propídio (30 ug /uL) durante 30 minutos adicionais a 4 ° C no escuro e analisadas com citometria.
As células apoptóticas foram identificadas por FACS usando Anexina V-FITC conjugado (Bender MedSystems) seguindo o protocolo do fabricante.
estudos de captação celular
bDHC foi extraído de células e meio de cultura como relatado anteriormente [20].
Violeta cristal ensaio
a inibição da proliferação foi medida por coloração com violeta de cristal e a concentração em que o crescimento celular é inibida em 50% (IC50) foi determinada após 24 horas de tratamento com bDHC. Após a remoção do meio de cultura celular, a monocamada de célula foi fixada com metanol e coradas com 0,05% de solução de violeta cristal em 20% de metanol durante 30 min. Depois de lavagens, as células foram deixadas a secar. O corante incorporado foi solubilizado em isopropanol acidificado (HCl 1: 2-propanol, 1:10) e determinada espectrofotometricamente a 540 nm de comprimento de onda. O corante extraído foi proporcional ao número de células. Percentagem de citotoxicidade foi calculada comparando a absorção de tratados com células não tratadas.
Acridina Laranja coloração
células HCT116 foram tratadas com DMSO e bDHC para 8 e 16 horas. Após isto, as células foram incubadas com laranja de acridina (1 ug /ml) durante 15 min a 37 ° C, seguida de visualização com um Zeiss Axioskop 40 microscópio de fluorescência (Carl Zeiss, Alemanha).
conteúdo intracelular de ATP
Determinação do teor intracelular de ATP foi realizada usando ATP CLSII kit de ensaio de bioluminescência (Roche), seguindo o protocolo do fabricante.
membrana mitocondrial potencial
potencial de membrana mitocondrial foi medido por meio da avaliação a ligação de 3,3-Dihexyloxacarbocyanineiodide (DiOC6), um corante catiónico que se liga a mitocôndria com potencial de membrana intacta. As células foram marcadas depois de DMSO ou bDHC incubação durante 16 e 24 horas com DiOC6 (4 nM) durante 40 min a 37 ° C. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS 1x e a intensidade da fluorescência foi analisada usando o citómetro Coulter Beckman.
imunotransferência
As células foram lisadas em tampão de amostra de Laemmli 1 × para o total de extractos celulares. extractos citoplasma /núcleo foram preparados como descrito no Exemplo de Ref. [38]. A análise por Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [20]. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-p53, DO-1 (Santa Cruz # SC-126), anti-phospo-H3 (Ser10) (Millipore # 05-817), anti-ácido H2A-remendo (Activo Motif), anti -p21 (Upstate), anti-actina (Santa Cruz-), anti-PARP1 (Santa Cruz # SC-8007), anti-γH2AX (Millipore, # 05-636), anti-GADD153 (F168) (Santa Cruz # SC -575), anti-tubulina (Sigma-Aldrich), anti-clivada caspases 3, 7, 8, 9 (Cell Signaling), anti-caspase 4 4B9 (Enzo Life Sciences), anti-Bax (N-20) (Santa Cruz # SC-493), anti-Bcl-2 (Santa Cruz # SC-509), anti-Bcl-XL (Santa Cruz # SC-8392), anti-LC3B (Sigma Aldrich # L7543), anti-Ub (Santa Cruz # SC-8017), anti-ATG7 (Sigma Aldrich # A2856), anti-beclin 1 (Sigma Aldrich # B6061) e anti-H3 (C16) (Santa Cruz # SC-8654). reagente de detecção quimioluminescente foi comprado de Millipore (Luminata Classico e Forte ocidental HRP).
O isolamento da fração citosólica pelo método de lise digitonina
2.000.000 células HCT116 foram lavadas duas vezes em PBS 1 × e em seguida, ressuspensas em tampão de lise com digitonina (NaCl 75 mM, NaH 1 mM de
2 PO?
4, na 8 mM
2HPO
4, 250 mM de sacarose, 190 mg /ml de digitonina, inibidores da protease). Cada amostra foi incubada em gelo durante 5 minutos e em seguida centrifugou-se a 15.000 x g a 4 ° C durante 30 minutos. Os sobrenadantes foram recolhidos e utilizados para a transferência de Western utilizando anticorpo anti-citocromo C (Santa Cruz # SC-13560).
Imunofluorescência
Análise por imunofluorescência foi realizada como descrito anteriormente [20], [ ,,,0],39], utilizando anti-p53 DO-1 (Santa Cruz # SC-126) e anticorpos anti-LC3B (Sigma Aldrich # L7543) diluído 1:100 em PBS + BSA a 1%. p53 localização celular foi examinada com Zeiss Axioskop microscópio de fluorescência 40 (Carl Zeiss, Jena, Alemanha), as imagens recolhidas com uma câmera AxioCam HRc e pacote de software AxioVision versão 3.1. Coloração de LC3B endógena foi analisada por microscopia confocal (Leica DM IRE2).
Plasmídeos e transfecção transiente
HCT116 foram transientemente transfectadas com Bcl-2, Bcl-XL ou plasmídeos portadora com FuGENE (Promega ). vectores de expressão de Bcl-2 humana e Bcl-XL foram gentilmente cedidas por M. Priault (CNRS UMR IBGC 5095, Bordeaux, França) [40]. As células foram recuperados 48 horas após a transfecção de Western blot e análise do ciclo celular.
pequeno RNA de interferência (siRNA)
células HCT116 foram transfectadas (Lipofectamine 2000, Invitrogen) com 200 nM de ATG7 emparelhado, BCN1 e não segmentação de controlo pequenos ARN interferentes (Sigma Aldrich), como descrito por Hoyer-Hansen et ai. [41]. CHOP siRNA (HSC.RNAI.N004083.10.2 de IDT) foi um presente tipo de A. Pietrangelo (Universidade de Modena e Reggio Emilia, Modena, Itália). Os extractos totais e as amostras foram preparadas de FACS depois de 72 h após a transfecção siRNA.
análise de RT-PCR
extracção de RNA, PCR semiquantitativa retrotranscrição e foram realizados como previamente descrito [42], [43]. Actina e LC3B foram amplificadas com os seguintes oligonucleótidos: Actina
Para: 5′-GAGGCCCAGAGCAAGCGT-3 ‘; Actina
Rev: 5′-GCTCGAAGTCCAGGGCGACG-3 ‘; LC3B
Para: 5′-CCTGGAGAAAGAGTGGCATTT-3 ‘; LC3B
Rev: 5′-GAAGGCAGAAGGGAGTGTGT-3 ‘
microscopia eletrônica de varredura (SEM)
As células cultivadas em monocamada em lamelas foram fixadas em 1,25% de glutaraldeído em PBS 1 × para 30. min RT e lavada em PBS 1 x por três vezes. Após desidratação em soluções de etanol graduadas, as amostras eram de ponto crítico seca com CO
2 usando um Ponto Crítico de Secador de 010 Balzer, montadas em bases de alumínio e revestida por borrifamento com 10 nm de ouro-paládio numa unidade de revestimento E 500 ( polaron). As observações foram realizadas pela Philips XL-30 microscópio electrónico de varrimento.
análise de Microscopia Electrónica de Transmissão
Células, raspadas dos pratos de Petri, foram centrifugadas a 12000 × g durante 5 ‘a 10 ° C. As peletes resultantes foram fixados durante a noite com 2,5% de glutaraldeído (Agar Scientific, Stensted, UK) em tampão de Tyrode, pós-fixadas durante 2 horas em 1% de tetróxido de ósmio (Agar Scientific), desidratados e embebidos em resina TLV (TAAB, Aldermaston, Reino Unido ). secções de cortes semifinos obtidos através de toda a espessura de peletes foram coradas com azul de toluidina e observadas com um microscópio Zeiss Axiophot luz (Oberkochen, Alemanha). Secções ultrafinas foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo e observadas com um Jeol 1200 EXII microscópio eletrônico (Jeol, Tóquio, Japão).
Cromatina imunoprecipitação (CHIP)
chips foram realizadas com cromatina de DMSO e bDHC células tratadas durante 24 horas como descrito no Martens
et ai.
[44]. oligonucleotídeos PCR foram relatado anteriormente [43].
A análise estatística
Os resultados são apresentados como meio de pelo menos três experiências independentes +/- SD. A análise estatística foi feita utilizando-se ANOVA, seguido pelo teste LSD para determinar se houve diferenças entre os grupos específicos.
Resultados
Efeitos de bDHC na viabilidade e no ciclo celular progressão das células HCT116
experiências de dose-resposta completa foram realizados em células HCT116 para identificar a capacidade de bDHC para suprimir o crescimento celular. bDHC citotoxicidade foi ensaiada através de Violeta Cristal método de coloração vital e a concentração inibitória de 50% para o crescimento celular (IC50) foi calculado igual a 30 uM, após 24 horas de tratamento (Fig. 1A, painel da direita)
.
A efeito de bDHC na progressão do ciclo celular foi analisada por separação de células activadas fluorescentes (FACS) (Fig. 1B). As células HCT116 foram tratadas durante 16 e 24 horas com bDHC e a distribuição em fases do ciclo celular foi comparado com o DMSO e curcumina células tratadas. Como foi mostrado anteriormente [20], a curcumina células preso em fase G2 /M e metade da população em G0 /G1 e fase S dentro de 16 horas; foi detectado nenhum aumento significativo de eventos SubG1. Diferentemente, bDHC células acumuladas não só em G2 /M (de cerca de 23% das células de controlo para 37% das células tratadas) mas também na fase SubG1 (desde 2,5% a 10%). Com uma exposição prolongada, eventos SubG1 ligeiramente levantada em cima Curcumina (de 4% a 8,6%), enquanto que um aumento evidente foi detectável com bDHC (de 4% a 33%).
Um perfil do ciclo celular foi, então, criada por realizando PI análise biparametric /BrdU e usando gating selectivo excluindo população SubG1 (Fig. 1C). Como esperado, a curcumina população metade da fase S e dobrou células G2 /M. Assim como células curcumina, bDHC-tratadas mostraram uma clara diminuição da população S cedo (a partir de cerca de 33% para 5,9% e 4,8% ao fim de 16 e 24 horas, respectivamente) e uma acumulação de G2 eventos /m (entre cerca de 25% a cerca de 42% e 50%, após 16 e 24 horas), enquanto não há mudanças significativas na porcentagem G0 /G1 foram detectados.
Para discriminar entre G2 e populações mitóticas, as células foram sondados dupla com PI e uma específica anticorpo contra os H3Ser10 fosfo-histona marcador mitótico utilizando citometria de fluxo (Fig. S1A). Enquanto que cerca de 90% das células foram positivas para 4n H3Ser10 fosfo-histona após o tratamento curcumina, apenas cerca de 2% foram detectados como população mitótica após administração bDHC.
A comparação entre as análises monoparametric e biparametric (Fig. 1B e a Fig . 1C) destacou que o principal efeito do tratamento bDHC é um bloco G2 após 16 horas e morte celular após 24 horas.
a atividade citotóxica de bDHC foi examinado por análise de SEM (Fig. S1B). alterações morfológicas profundas da superfície, tais como perda de microvilosidades ou alargada, de membrana “bolhas” e corpos apoptóticos estavam presentes em células tratadas bDHC. Além disso, um forte aumento das células positivas para anexina V foi detectada após 24 horas de administração bDHC (61%) em comparação com DMSO (7%) e Curcumina (24%) de células tratadas (Fig. 1D, painel esquerdo), sugerindo que a activação de uma morte celular apoptótica.
para analisar a reversibilidade de prisão bDHC-crescimento, as células HCT116 tratadas durante 24 horas com bDHC foram então lavadas para remover as células mortas e libertado durante 24 horas em meio fresco. Observou-se um efeito irreversível sobre a viabilidade celular, com uma clara acumulação de eventos SubG1 (38%) e nenhum aumento em qualquer outra fase do ciclo celular (Fig. 1D, painel do meio)
.
De modo semelhante ao HCT116, células LOVO de adenocarcinoma do cólon humano apresentaram um aumento evidente de eventos SubG1 bDHC após a administração durante 24 horas (de 2,6% em DMSO a 27,7% em células tratadas bDHC) (Fig S1C).
de forma consistente com o aparecimento de células com conteúdo hipodiploidia SubG1 ADN, bDHC desencadeou a fosforilação da H2AX variante histona (γ-H2AX), cuja função está associada a fragmentação do ADN durante a apoptose [45], tanto em HCT116 e células LOVO (Fig. 1D, painel da direita e a Fig. S1C , painel da direita).
bDHC induz a morte celular nas células HCT116 mas não em células humanas normais
a seguir, se perguntou se bDHC teve uma atividade tumor-seletiva. fibroblastos humanos não transformadas (HF) e células humanas fetais hepáticas epiteliais normais (WRL68), cujo tempo de duplicação é de 24 horas, foram tratados durante 24 e 48 horas com bDHC 30 uM e actividade supressora de crescimento foi então investigados por FACS (Fig. 2A e B painéis de média, à esquerda e). Em células HF, bDHC induziu uma acumulação progressiva de S (de 19,8% para 21,9% e de 11,4% para 17% no prazo de 24 horas e 48 horas, respectivamente) e G2 /eventos M (de 16,8% para 24,7% em 24 horas, a partir de 8,5% a 34,5% dentro de 48 horas). administração bDHC para WRL68 resultou em um aumento de S e eventos G2 /M, bem como, mas de modo diferente a partir de células de HF, os efeitos máximos foram detectados após 24 horas (de 14% para 20,6% na fase S, e de 19,1% para 33,7% na fase G2 /M). Curiosamente, nem o IC nem WRL68 células foram comprometidos com a morte celular por apoptose e, de forma coerente, não se observou qualquer aumento de expressão γ-H2AX quando do tratamento bDHC (Fig. S1D).
. PI análise /FACS da progressão do ciclo celular HF após tratamentos DMSO e bDHC durante 24 e 48 horas (esquerdo e médio do painel, respectivamente). PI análise do ciclo celular /monoparametric de células tratadas com bDHC
relação
células bDHC-divulgados (painel da direita) (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). B. Painel esquerdo e médio: Análise da progressão do ciclo celular de células WRL68 após 24 e 48 horas de tratamento com DMSO ou bDHC. Painel da direita: análise monoparametric PI /FACS de células tratadas com WRL68 bDHC durante 48 horas e, em seguida, libertado em meio fresco durante mais 24 horas (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). C. Avaliação quantitativa da concentração bDHC por espectroscopia de UV-VIS. painel superior esquerdo: bDHC recuperado a partir de lisados celulares de HCT116 (•) e HF (▴) células após 24 horas de tratamento em diferentes concentrações (10, 20 e 30 uM). bDHC recuperado de pelotas celulares (ng) foi referidas proteínas celulares totais (mg), determinada pelo método de Bradford. Superior direito do painel: Comparação da absorção celular (20 e 30 uM concentrações) em HCT116 (histogramas a negro) e células de HF (histogramas a cinzento). painel inferior: bDHC recuperado do meio de cultura após incubação de HCT116 (•) e HF (▴) células com bDHC aos 10, 20 e 30 concentração? M. Todos os dados foram normalizados no controle (DMSO). quantidade de fármaco foi determinada por leitura de absorvância a λ
max = 393 nm. Os valores apresentados são a média de três experiências independentes -. /+ SD
Para investigar a estabilidade do bloco do ciclo celular induzida em células normais, as células foram tratadas com HF bDHC durante 48 horas, depois lavou-se e lançado em meio isento de drogas durante 24 horas. Ao contrário HCT116, as células IC passaram de G2 /M para a fase G1 (de 48% para 56,3% após o lançamento), e nenhum aumento de SubG1 foi detectada (Fig. 2A, painel da direita). Os efeitos reversíveis de bDHC sobre as células normais foram ainda mais evidente em WRL68 células, cujas células ciclo de distribuição após 48 horas e após a introdução em meio fresco perfeitamente sobrepostas das células de controlo (Fig. 2B, médio e painéis da direita).
Estes dados sugerem que bDHC reversivelmente bloqueia a progressão do ciclo celular de células não malignas, sem indução de apoptose.
Com o objectivo de desvendar a natureza do bDHC selectividade em relação a células de cancro do cólon, em vez do que as células normais, foi realizada mais estudos para estimar a variação da absorção celular como uma função da concentração de tratamento em linhas de células HCT-116 e HF. Os dados foram normalizados e apresentados em ng /mg de proteínas totais (Fig. 2C, painéis superiores) e de cultura de quantidades residuais médias (ug) (Fig. 2C, painel inferior). absorção de droga aumentou de uma forma dependente da dose em ambas as linhas celulares, mas HCT116 revelou uma absorção significativamente maior em comparação com a linha de células de HF a 30 ^ M: 4575 ± 40
relação
2979 ± 21 ng de proteína total /mg ( Fig. 2C, painel superior direito).
células HCT116 morte celular induzida por bDHC é um dependente de caspase processo
Para explorar a contribuição de caspases na execução de apoptose, nós pré-incubadas com o zVAD inibidor de caspase de largo antes de tratar as células com bDHC durante 24 horas (Fig. 3A, painel esquerdo). A queda dramática dos eventos SubG1 foi observada concomitantemente a uma acumulação progressiva de células em S e G2 /fases M (a partir de 11,7% a 24,5% em fase S e de 16% para 40% em G2 /M, em cima do zVAD pré-tratamento) . A inibição de apoptose por zVAD determinada uma diminuição evidente de H2AX fosforilada (Fig. 3A, painel da direita e a Fig. S2A). Actina foi utilizado como controlo de carga. Actina foi utilizado como controlo de carga. Actina foi utilizado como controlo de carga. Actina foi utilizado como controlo de carga.