Abstract

Muitos estudos têm demonstrado que o antigénio de células-tronco da próstata (PSCA) é um alvo atraente para imunoterapia com base em sua superexpressão em tecido de tumor da próstata, especialmente em alguns tecidos metastáticos. Neste estudo, avaliou-se células dendríticas (DC) -directed vector lentiviral (VEDC) que codifica PSCA murino (VEDC-PSCA) como uma nova vacina tumor de câncer de próstata em modelos do rato. Mostrámos que VEDC-PSCA pode preferencialmente entregar o gene do antigénio de PSCA para DC-SIGN-expressando células 293T e células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDCs). imunização direta com o VEDC-PSCA em camundongos machos C57BL /6 suscitou robustos PSCA-responsive CD8

+ e CD4

+ T células

in vivo

. Em uma linha de células de próstata de rato de adenocarcinoma transgénico (TRAMP-C1) modelo de tumor sinérgicas, que ainda demonstrado que ratinhos VEDC-PSCA-vacinados pode ser protegido contra desafio tumoral letal num modelo profiláctico, ao passo que o crescimento tumoral mais lenta foi observada num modelo terapêutico. Esta vacina VEDC-PSCA também mostrou eficácia na inibição de metástases de tumor usando um modelo de B16-F10 que expressam PSCA. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que VEDC é um portador de vacina potente para PSCA no fornecimento de imunidade anti-cancro da próstata

Citation:. Xiao L, Joo KI, Lim M, Wang P (2012) dendríticas Cell-Directed Vacinação com um Lentivector Encoding PSCA para câncer de próstata em ratos. PLoS ONE 7 (11): e48866. doi: 10.1371 /journal.pone.0048866

Autor: Lucia Gabriele, Istituto Superiore di Sanità, Itália |

Recebido: 15 de junho de 2012; Aceito: 02 de outubro de 2012; Publicação: 06 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Xiao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Instituto Nacional de Saúde (R01AI68978 e P01CA132681) e uma subvenção de aceleração de translação do Centro Conjunto de Translational Medicine. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em 2011, o FDA aprovou a primeira vacina contra o câncer terapêutica para o tratamento de câncer de próstata hormônio refratário assintomática ou ligeiramente sintomática [1], [2], um grande incentivo para os doentes e os cientistas de câncer de próstata trabalhando em imunoterapia do cancro . terapias imunológicas pode instruir o sistema imune para reconhecer e eliminar células tumorais, que, sob condições normais, normalmente escapam à vigilância imunitária pelo downregulating apresentação de antigénio tumoral [3] ou iniciando tolerância imunológica [4], [5]. Actualmente, vários antigénios foram identificados como potenciais candidatos para vacinas de imunoterapia do cancro da próstata. Eles incluem o antigénio específico da próstata (PSA) [6], antigénio das células estaminais da próstata (PSCA) [7] – [10], antigénio específico da próstata membrana (PSMA) [11], fosfatase ácida prostática (PAP) [2] , mucina 1 (MUC1) [12], hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) [13], e NY-ESO-1 vacina [14], entre outros. PSCA é um ácido amino-123 glicosilfosfatidilinositol (GPI) -linked proteína da superfície celular que pertence à família Ly-6 [15]. PSCA é um alvo atractivo imunoterapêutico com base na sua sobre-expressão na maioria das células de cancro da próstata, enquanto que a sua expressão nos outros tecidos somáticos é altamente limitada [16]. Embora o mecanismo subjacente específico a contribuição de PSCA para o crescimento do tumor permanece indefinido, de PSCA foi encontrada uma correlação positiva com a malignidade do tumor, grau de patologia e androgénio-independência [16], [17]. Sugeriu-se que o PSCA pode desempenhar um papel na neutralização de resposta imune natural [18]. Além disso, a expressão de PSCA foi regulado positivamente em tecidos metastáticos [16], [19]. Atualmente, anticorpo dirigido para PSCA foi testado para inibir o crescimento tumoral do câncer de próstata e suprimir formação de metástases [20], enquanto outros têm investigado receptores de antígeno quimérico (CAR) à base adotiva T células terapia alvo PSCA por seu potencial no tratamento de câncer de próstata [21 ]. Experimentos também foram realizados para testar PSCA como um antígeno da vacina, e isso foi claramente demonstrado em modelos animais que as vacinas PSCA-alvo podem retardar a progressão do câncer de próstata [22], [23].

lentivirais ( LVs) são vectores promissores para a imunoterapia do cancro [24], [25], e que estão actualmente a ser avaliada em diversos ensaios clínicos para uma ampla gama de doenças humanas [26]. Uma característica desejada do LVS é a sua capacidade para transduzir tanto células nondividing [27], incluindo DCs periféricas [28] divisória e, [29]. Como um portador da vacina, LVs pode, simultaneamente, de liberar antígenos DCs [24] e activar DCs através de receptores toll-like (TLRs) [30] – [36]. Para melhorar ainda mais LVs, muito esforço tem sido dirigido para a segmentação LVS células apresentadoras de antígenos (APCs)

In vivo

para conseguir uma melhor especificidade e segurança [37] – [40]. Nós anteriormente relatado um LV DC-dirigida (VEDC), que podem especificamente como alvo as DCs que expressam a molécula de adesão intercelular-DC específica agarrando não-integrina (DC-SIGN) e entregar genes de antigénio para eles. Direto

in vivo

vacinação utilizando VEDC codificação de ovalbumina de galinha (OVA) provocou alta frequência de OVA-específicas CD8

+ e CD4

+ respostas das células T [41] – [43].

neste relatório, nós investigamos vacinas contra o câncer VEDC mediadas em um ambiente mais clinicamente relacionados e explorou a potência deste imunização vectored para superar a tolerância imunológica ao antígeno PSCA auto-tumor e gerar imunidade protetora contra o câncer de próstata. Mostrámos que VEDC que codifica PSCA (VEDC-PSCA) poderia ter como alvo a DC-SIGN expressa linhas celulares e células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDCs). imunização directa na base da cauda evocadas respostas de células T específicas de PSCA fortes em um modelo de cancro de próstata de rato. Além disso, a vacinação pode inibir significativamente o crescimento do tumor após o desafio com células tumorais TRAMP-C1 em ratinhos. Quando esta vacina foi utilizada num contexto terapêutico, pode suprimir o crescimento de tumores estabelecidos TRAMP-C1. Nossos dados mostraram que a imunidade anti-tumor de próstata conferida por VEDC-PSCA depende da presença de ambos CD8

+ e CD4

células + T. Finalmente, foi demonstrado que a imunização com VEDC-PSCA pode inibir eficientemente a metástase de células B16-PSCA no tecido pulmonar.

Resultados

Geração de VEDC-PSCA e sua capacidade de direcionar DC-SIGN -expressing células in vitro

Foi construída uma espinha dorsal de lentivírus que codifica todo o comprimento de PSCA murino e testada a expressão de PSCA em culas 293T. células 293T foram transfectadas transitoriamente com FUW-nulo ou FUW-PSCA vetor. Dois dias após a transfecção, as células foram recolhidas para a expressão de PSCA por análise activadas por fluorescência separador de células (FACS). células 293T transfectadas com o plasmídeo FUW-PSCA mostrou expressão positiva de PSCA (22,5%), enquanto que as células transfectadas com o plasmídeo FUW-nulo tinha apenas a coloração de fundo (Figura 1A).

células 293T (A) foram transfectadas transitoriamente com plasmídeos FUW-nulo (controle simulada, linha azul) ou FUW-PSCA (linha vermelha). Dois dias mais tarde, as células foram recolhidas e coradas para expressão de PSCA analisadas por citometria de fluxo. células 293T coradas com o anticorpo de isotipo foram incluídos como um controlo (cinzento área de sombra). (B) As células 293T foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos FUW-PSCA, SVGmu, e outros plasmídeos de empacotamento necessários para produzir vectores lentivírus VEDC-PSCA. sobrenadante fresco do vírus foi utilizado para transduzir células 293T (linha azul) ou células 293T.hDC-SIGN (linha vermelha) com MOI = 10. expressão de PSCA foi analisada por citometria de fluxo 3 dias pós-transdução. (C) DCs derivadas de medula óssea foram transduzidas com um vector simulado DC-LV-nulo ou DC-LV-PSCA vector. Cinco dias mais tarde, CD11c e PSCA expressão foram avaliados através da análise de citometria de fluxo. Todos os experimentos foram repetidos três vezes e os dados representativo é mostrado. Células 293T.DC-SIGN

Em seguida, utilizados previamente relatados [41] para determinar a capacidade de VEDC para expressar PSCA. Como mostrado na Figura 1B, aproximadamente 60% das células 293T.DC-SIGN exibidos expressão de PSCA pós-transdução VEDC-PSCA, enquanto que apenas 6,79% foram PSCA-positiva nas células 293T. A especificidade observada aqui é consistente com relatórios anteriores que mostram a capacidade para transduzir de VEDC preferencialmente DC-SIGN-expressando células [41], [44]. Nós investigou também se VEDC-PSCA poderia alvo e mediar expressão PSCA em DCs derivadas da medula óssea (BMDCs). Os BMDCs imaturos foram derivados a partir da cultura de medula óssea murina e confirmado por análise de citometria de fluxo de marcadores de superfície celular CD11c (Figura 1C). Quando exposto a LVS DCs foram modificados selectivamente por VEDC-PSCA para expressar PSCA (3,65% no CD11c

+ células vs 0,11% no CD11c

– células, a Figura 1C). Nossos resultados indicaram que VEDC-PSCA poderia alvo DC-expressando-SIGN células e entregar o antígeno PSCA para DCs

in vitro

.

A indução de CD8 específicas de PSCA

+ e CD4

+ respostas imunes celulares T in vivo

para determinar se este vector VEDC-PSCA recombinante poderia de forma eficiente entregar o antígeno para DCs e montagem respostas de células T específicas de antigénio

in vivo

, realizamos vacinação com VEDC-PSCA diretamente para machos C57BL /6. Por causa da variação da distribuição de DC, a imunização efectuada através de diferentes vias de administração pode resultar em diferentes números de DC a ser alvo, conduzindo a diferentes níveis de apresentação de antigénio. Como tal, a comparação da resposta imunogénica desencadeada por diferentes vias é necessário estabelecer um protocolo de imunização óptima. Portanto, sem tratamento prévio com machos C57BL /6 foram imunizados com uma única dose de VEDC-PSCA (6 × 10

7 TU) a área intradérmica (ID, na base da cauda), a área da almofada da pata (FP), área intramuscular ( im), região subcutânea (SC), ou espaço intraperitoneal (ip). Um CD8 anteriormente relatado péptido

+ epitopo para PSCA [23] foi usada para caracterizar-specific CD8 PSCA

+ respostas de células T no baço através de coloração de citocinas intracelulares IFN-γ (CCI). Como representado na Figura 2A e 2B, o I.D. e F.P. vias de administração resultou em mais fortes específicos de PSCA CD8

resposta das células T + (~ 2%) duas semanas após a imunização. Eu estou. vias de administração tinha alcançado uma resposta moderada (~1.2%), enquanto que o s.c. e i.p. injecções resultou numa resposta muito mais baixa ( 0,5%). Esta tendência resposta é consistente com os resultados de imunização com VEDC que codifica Gag de HIV-1 [45] ou de gp100 humano [44]. Com base na d.i. via de administração, o que deu o maior

+ resposta das células T CD8, foram administradas diferentes doses de VEDC-PSCA (2~80 × 10

6 TU). Tal como mostrado na Figura 2C, a CD8

resposta de células T + era dependente da dose, aumentando de 0,5% a 2%. Assim, um regime de imunização óptima da i.d. injeção de VEDC-PSCA com 80 × 10

6 TU foi utilizado para estudos posteriores. Para avaliar ainda mais a CD8 antígeno-específica

respostas de células T + provocada por i.d. imunização, foi conduzido um experimento ELISPOT medir a secreção de IFN-γ de células T, tanto baço e linfonodo inguinal. De 1 milhão de células, cerca de 800 e 300 células responderam ao CD8

+ péptido epitopo no baço e no nódulo linfático inguinal, respectivamente (Figura 2D).

(A) ratos machos C57BL /6 camundongos foram imunizados com 6 × 10

7 TU de VEDC-PSCA através de diferentes vias de administração: espaço intraperitoneal (IP), área subcutânea (sc), área intramuscular (im), pata (fp), ou intradérmica (a base de cauda, ​​id). Um grupo de imunização foi incluído como um controlo negativo. Duas semanas após a imunização, esplenócitos dos ratinhos foram colhidos e analisados ​​quanto à presença de CD8 específicas de PSCA

+ células T por esplenócitos restimulating com um péptido de PSCA (PSCA

83-91), seguido de coloração intracelular de IFN- y e coloração de superfície para CD8. Percentagem de IFN-γ-secretores CD8

+ T células é indicado. (B) A comparação estatística de imunização provocada por administração de VEDC-PSCA entre diferentes vias de administração. (C) ratos machos C57BL /6 foram imunizados com diferentes doses de vectores VEDC-PSCA (0, 2, 10, 40 e 80 milhões TU) na base da cauda. Duas semanas após a vacinação, específicos de PSCA CD8

+ células T do baço foram analisados ​​por restimulating com o péptido de PSCA

83-91, seguido por coloração intracelular para o IFN-γ. (D) Produção de células secretoras de IFN-y-específico-PSCA de ambos baço (SP) e nó de linfa inguinais (LN), foi avaliada por re-estimulação com o PSCA

83-91 péptido, seguido por análise de ELISPOT para IFN-γ . (E) A produção de PSCA-específica de IL-2 a partir de esplenócitos (com CD8

+ células T esgotadas) foi medida pela re-estimulação com lisado de células 293T transfectadas com PSCA expresso, seguido da análise ELISPOT para a IL-2. (**:

P Art 0,01; *:

P Art 0,05; ANOVA one-way, seguido pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni barras de erro representam SD..) Todos os experimentos foram repetidos três tempos e os dados representativo é mostrado.

Considerando o papel importante de CD4

+ na imunoterapia tumor, um ensaio ELISPOT IL-2 foi empregado para examinar a CD4

+ resposta das células T desencadeada por esta estratégia de imunização. Detectamos cerca de 250 células CD4

+ células T por milhão esplenócitos capazes de segregar IL-2 em resposta a lisatos de células 293T transfectadas com o plasmídeo FUW-PSCA (Figura 2E). Nossos resultados demonstraram que VEDC-PSCA foi eficaz como um portador de vacina para estimular tanto CD8

+ e CD4

+ T respostas de células em camundongos.

Geração de imunidade anti-tumor de próstata, tanto profilática e modelos terapêuticos

à luz da CD8 específicos de PSCA

+ e CD4

resposta das células T + observado, foi necessário avaliar a eficácia antitumoral conferida por VEDC-PSCA imunização. Um modelo de tumor de ratinho transplantado com a linha de adenocarcinoma de células de ratinho transgénico da próstata (TRAMP-C1) [46] foi usado para esta avaliação. Macho C57BL /6 murganhos foram vacinados com VEDC-PSCA, VEDC-nulo, ou deixada sem tratamento. Estes ratinhos foram então desafiados 10 dias mais tarde pela via s.c. injecção de 5 × 10

5 células TRAMP-C1 (Figura 3A). protecção do tumor foi observada no grupo VEDC-PSCA-vacinados com 8 de 12 ratinhos durante 44 dias após o desafio do tumor (Figura 3B, inferior esquerdo) livres de tumor. Além disso, os outros 4 ratos em que grupo exibiu uma taxa muito mais lenta do crescimento do que no grupo de vector nulo. Notavelmente, a vacinação com VEDC-nulo não forneceu qualquer benefício de supressão de tumor mensurável em comparação com o grupo de controlo (Figura 3B, a parte superior direita superior esquerdo). Em geral, os ratinhos do grupo VEDC-PSCA mostrou uma taxa de sobrevivência significativamente melhor do que o de ratos a partir de qualquer um do grupo VEDC-nulo ou controlo. Todos os tumores do grupo VEDC-nulo e controlo excedeu o limite de tamanho dentro de 55 dias (o tamanho do tumor de 2000 mm

3 foi utilizado como um ponto final substituto de sobrevivência), enquanto que o grupo VEDC-PSCA sobreviveram mais de 70 dias (Figura 3B, inferior direito).

(A, B) Masculino camundongos C57BL /6 foram imunizados com 8 × 10

7 TU de VEDC-PSCA, simulada vector DC-LV-Null, ou controlo de PBS na base da cauda. Dez dias após a imunização, estes ratos foram desafiados por via subcutânea com 5 × 10

5 de células tumorais TRAMP-C1. curvas de crescimento do tumor foram monitorizados com um compasso de calibre fino, e o volume do tumor foi calculado com base nos maiores diâmetros perpendiculares (mm

3), de acordo com a fórmula

V = ab

2π /6

, onde

a

e

b Quais são os maiores diâmetros perpendiculares. curva de sobrevivência representante Kaplan Meyer para o desafio tumor profilática (n = 12). (C, D) ratos machos C57BL /6 machos foram implantados com 5 × 10

5 TRAMP-C1 células tumorais via subcutânea, e 18 dias mais tarde, estes ratinhos portadores de tumores foram tratados com 8 × 10

7 TU de VEDC -PSCA (n = 12) ou VEDC-nulo (n = 12) na base da cauda. O volume do tumor foi monitorizada e calculada tal como descrito anteriormente. curva de sobrevivência representante Kaplan Meyer para o desafio tumor terapêutica. (***:

P Art 0,001; Log-rank (Mantel-Cox) teste de barras de erro representam SEM..) Todos os experimentos foram repetidos duas vezes e os dados representativo é mostrado

.

ainda investigado se VEDC-PSCA pode ser potentes para inibir o crescimento do tumor num modelo terapêutico TRAMP-C1, em que um tumor já tinha sido estabelecida (Figura 3C). Tumor-rolamento ratinhos terapeuticamente vacinados com VEDC-PSCA mostrou o crescimento do tumor significativamente mais lento (Figura 3D, superior e médio), ea sobrevida média foi ampliado de 49,5 dias para 64 dias após a imunização VEDC-PSCA (Figura 3D, inferior).

Dependência da imunidade antitumoral provocada pela vacina em CD8 infiltrado

+ e /ou

células CD4 + T

em um esforço para entender melhor os papéis de CD8

+ e CD4

+ células T na imunidade anti-tumor, amostras de tecido de tumor a partir de VEDC-nulo-ou ratinhos VEDC-PSCA-imunizados foram recolhidos, parafina-encaixado, e submetido a coloração do núcleo e marcadores de superfície. Como mostrado na Figura 4A, a imunização resultou na infiltração de mais células T (tal como identificado por coloração de CD3), incluindo tanto CD4

+ e CD8

+ células T em tecidos tumorais colhidas a partir de ratinhos VEDC-PSCA-imunizados, do que a de ratos tratados com VEDC-nulo. Isto indica que tanto os linfócitos T citotóxicos e auxiliares pode infiltrar-se o tecido do tumor local, em resposta à imunização. Para determinar a dependência do efeito antitumoral sobre estas células T infiltrados, um

in vivo

T experimento depleção de células foi realizada. Quatro grupos de ratinhos foram inoculados com os tumores TRAMP-C1, em que três grupos foram então imunizados com VEDC-PSCA 14 dias pós-provocação do tumor, enquanto o grupo restante foi imunizado com VEDC-nulo. Para os grupos VEDC-PSCA-imunizados, um grupo foi tratado com um anticorpo capaz de esgotar células T CD4 +, e um outro grupo foi tratado com um anticorpo capaz de esgotar células CD8

+ células T (figura 4B). Como mostrado anteriormente, VEDC-PSCA imunização poderia retardar significativamente o crescimento global tumor. Em contraste, tumores nos grupos com depleção de CD8 quer

+ ou CD4

+ células T desenvolveu uma taxa mais rápida do crescimento do tumor, apesar de algum efeito protector tumor permaneceu. Notavelmente, grupo depleção de células T CD8

+ T tinham tumores marcadamente maior do que a do grupo de CD4-depleção de células

+ T (Figura 4C). Os nossos dados indicam ainda que as células T são responsáveis ​​pela observada imunidade antitumoral induzida por vacina e que CD8

+ células T desempenham o papel mais indispensável no controle do crescimento tumoral.

(A) a infiltração de células T em tecidos tumorais. tumores TRAMP-C1 a partir de ratos portadores de tumores foram excisados ​​3 semanas após a imunização, parafina-encaixados, e coradas para imunofluorescência conjugado com CD3, CD4 e CD8 (cor verde, tal como indicado pelas setas brancas) juntamente com coloração nuclear (cor vermelha) . Imagens representativas que mostram CD4

+ e CD8

+ T infiltraram aos tecidos de tumor de ratinhos VEDC-PSCA-imunizados, em comparação com os de ratinhos VEDC-Null-imunizados. (B) Quatro grupos de ratos machos C57BL /6 murganhos (n = 8 para cada grupo) foram transplantadas com 5 × 10

5 células TRAMP-C1 por via subcutânea no dia 0. Catorze dias mais tarde, 3 grupos foram imunizados com VEDC-PSCA , enquanto que o outro grupo foi imunizado com vector simulado VEDC-nulo. Dois grupos de ratinhos dos grupos VEDC-PSCA-imunizados foram submetidos a CD4

+ ou CD8

+ depleção de células T através da injecção de anticorpos CD4 ou CD8-depleção intraperitonealmente. (C) O volume do tumor para cada grupo de ratinhos foi monitorizado. As barras de erro representam SEM. Todas as experiências foram repetidas duas vezes e os dados representativo é mostrado.

A protecção contra a metástase pulmonar de células B16-PSCA

A sobre-expressão de PSCA foi identificado como sendo associado com a metástase de tumor da próstata em muitos estudos, o que o torna um alvo ideal para imunoterapia. A fim de facilitar o estudo da capacidade de VEDC-PSCA imunização para inibir a formação de metástases de tumor, as células B16-F10 de tipo selvagem que expressam estavelmente PSCA foi construído (designado como B16-PSCA). Macho C57BL /6 murganhos foram vacinados com o primeiro VEDC-PSCA ou VEDC-nulo como um controlo negativo. Dez dias mais tarde, as células tumorais B16-PSCA singeneicos foram injectados por via intravenosa aos animais. Depois de mais de 14 dias, os animais foram abatidos, e os depósitos metastáticos do pulmão foram quantificados macroscopicamente. Em comparação com VEDC-nulo, VEDC-PSCA imunização marcadamente reduzido o número de formação de metástases do pulmão de superfície ( 75%, Figura 5A e 5C). amostras de tecido pulmonar histológicos dos dois grupos acima também foram examinadas microscopicamente para depósitos de metástase, e um achado semelhante foi observado (Figura 5B). Em contraste, a imunidade protectora de VEDC-PSCA era limitado apenas às células de melanoma que expressam PSCA, tal como não foi observada nenhuma diferença significativa quando as células tumorais B16-F10 foram transplantadas (Figura 5C). Estes resultados confirmaram a imunidade anti-tumoral específico-PSCA conferida por VEDC-PSCA imunização e sua capacidade para suprimir a formação de metástases.

(A) masculino C57BL /6 foram imunizados com VEDC-PSCA ou VEDC-Null como um controlo simulado . Dez dias mais tarde, os ratinhos foram provocados com 0,2 milhões de células B10-F10-PSCA por injecção intravenosa através da veia da cauda. Duas semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados, e pontos de vista macroscópico dos pulmões foram mostradas. (B) microscópica H E de coloração (20 ×) de amostras de tecido de pulmão de ratinhos imunizados com VEDC-PSCA ou VEDC-nulo. (C) quantificação estatística de metástases pulmonares de melanoma (número de nódulos pretas nos pulmões) de ratos imunizados; imunização semelhante, mas com as metástases de melanoma B16-F10 originais incluída como um controlo. (**:

P

0,01 e N /S:. Não estatisticamente significativo; As barras de erro One-way ANOVA seguido por teste de comparação múltipla de Bonferroni representam DP, n = 4). Todos os experimentos foram repetidos duas vezes e os dados representativo é mostrado.

Discussão

tratamentos baseados em DC têm mostrado resultados promissores para a imunoterapia do cancro [47], [48]. LVs DC-dirigidas são vectores de vacina eficazes. Eles são capazes de transduzir e activar DCs

In vivo

e mediar a expressão do transgene durável, que pode ser subsequentemente processadas por DCs e apresentados às células T como antigénios [49]. Além disso, estes vectores são concebidos para ser não-replicável, com o mínimo de proteínas virais a ser expresso, e, por conseguinte, menos imunidade anti-vector foi encontrado [44]. Além disso, por causa da transdução específica do DC, menos segurança e fora do alvo preocupações surgem quando DCs são aplicados como veículos de vacinas

in vivo

[41]. Nos nossos estudos anteriores, nós demonstramos que a DC-dirigida LVs (DCLVs) pode provocar fortes respostas imunitárias contra OVA [50], o HIV-gag [45], e hgp100 [44] antigénios. Neste estudo, foram avaliados os DCLVs transportando PSCA, um antígeno de auto-tumor verdadeiro para o câncer de próstata, como uma vacina para tumor de próstata singênica transplantado

in vivo

. Tanto quanto é do nosso conhecimento, esta representa o primeiro estudo a usar DCLVs como uma modalidade de vacina contra um antigénio auto-tumoral em modelos animais. Mostrámos que VEDC-PSCA vacinação poderia ultrapassar a tolerância para auto-antigénio de PSCA e gerar respostas de células T específicas de antigénio duráveis ​​

In vivo

. Esta imunização monta uma resposta imunológica que é capaz de suprimir o estabelecimento de tumores da próstata TRAMP-C1 e abrandar o crescimento do tumor num modelo terapêutico.

A proteína de envelope pseudotipo usadas para SVL é uma forma modificada de glicoproteína do vírus de Sindbis (SVGmu). O tipo selvagem da glicoproteína tem a afinidade de ligação tanto para o sulfato de heparina e a DC-SIGN; DC-SIGN é uma proteína de superfície que é predominantemente expresso em macrófagos e certos subconjuntos de DC [51]. Obtivemos segmentação de DCs, desactivando a ligação de sulfato de heparina e reter a ligação da glicoproteína do vírus de Sindbis DC-SIGN. Demonstrou-se que a ligação de SVGmu para DC-SIGN está dependente da estrutura de manose elevada em DC-SIGN. Portanto, a glicoproteína virai podem ser ainda modificadas para exibir uma estrutura de manose superior para aumentar a eficiência de transdução [52]. Em primeiro lugar, confirmou que VEDC-PSCA pode ser eficientemente produzido e transdução seletivamente-DC-SIGN expressando células. O

in vitro

ensaio de transdução BMDC corrobora a observação de que VEDC-PSCA pode direcionar a entrega do antígeno PSCA em DCs.

Foi previamente mostrado que os DCs derivadas de pele são o principal alvo para a vacinação à base de LV [49]. No entanto, a distribuição e a acessibilidade das DCs em diferentes partes do corpo pode variar, de modo a imunização através de vias diferentes pode desencadear diferentes níveis de respostas imunes. Nós relatado anteriormente que o F.P. rota teve uma resposta relativamente mais elevado em relação a outras vias de administração para algumas entregas de antigénio [44], [45]. Neste estudo, foram directamente comparadas as respostas imunitárias induzida através de várias vias de vacinação (d.i., F.P., i.m., s.c. e i.p.). Curiosamente, descobrimos que i.d. e injeções PF gerou respostas muito mais elevados do que os do i.m. e via s.c, enquanto que i.p. administração resultou na resposta menor. Imunização gerado através da i.d. rota exibida uma resposta ligeiramente maior do que o F.P. rota. Para ter em conta este resultado, especula-se que VEDC-PSCA tem uma melhor chance de DCs encontrando quando administrado através de qualquer i.d. ou F.P. rota.

Uma única dose de VEDC-PSCA foi capaz de proteger estes ratos de desafio tumor da próstata e melhorou sua taxa de sobrevivência. Este resultado é consistente com um estudo anterior, utilizando uma estratégia de prime /boost para gerar resposta imunitária específica para o PSCA num modelo profiláctico [22], [23], embora VEDC-PSCA eliciou uma magnitude maior CD8 resposta de células

+ T. Num modelo terapêutico TRAMP-C1, a vacina em vector acentuadamente retardado o crescimento do tumor e a sobrevivência prolongada do rato, ao passo que o método anterior da vacina prime /boost mal gerado protecção tumoral satisfatória [22]. Este resultado pode ser explicado por o intervalo de tempo entre a inoculação do tumor e do tumor palpável, um período de cerca de 20~25 dias. Além disso, é preciso um significativamente mais tempo para implementar o prime /boost imunização, o que provavelmente resulta em perder o momento mais oportuno para retardar a progressão do câncer. Assim, uma vantagem potencial de DCLVs é a sua capacidade para superar a tolerância imunológica e estabelecer uma resposta imune antitumoral eficaz dentro de 2 semanas.

Ambos CD8

+ e CD4 células

+ T infiltrado em tecidos tumorais locais seguinte VEDC-PSCA imunização. Embora as células CD8

+ e CD4

+ T são ambos necessários para a protecção tumoral, a experiência indica que a depleção de anticorpos células CD8

+ T desempenham um papel mais importante no controle do crescimento tumoral. Tem sido bem estabelecido que as células citotóxicas CD8

+ T podem matar directamente células tumorais [53] – [55]. Quanto ao CD4

+ células T, várias razões possíveis explicar a sua necessidade de protecção tumor. Primeiro, as células CD8

+ T são dependentes de CD4

+ células T [56], [57] para eliciar respostas imunitárias robustas. Anteriormente, observamos uma

+ resposta das células T dependente de CD4 CD8 que foi provocada por DCLVs [58]. Em segundo lugar, pelo menos parte do efeito antitumoral é mediado pela resposta Th1, que se baseia em CD4

+ células T [59].

Actualmente, nenhum tratamento fiável existe para curar o cancro da próstata metastático avançado. PSCA é altamente expresso em tecido metastático de cancro da próstata e é, portanto, um bom alvo para a imunoterapia do cancro. Mostrámos no presente estudo que VEDC-PSCA pode gerar imunidade capaz de suprimir a metástase pulmonar no modelo B16-PSCA. Curiosamente, quando o mesmo número de células B16-F10 ou B16-PSCA foi injectado por via intravenosa, as células B16-PSCA foram capazes de gerar mais do que a formação de metástases pulmonares das células B16-F10 (Figura 5C). Presentemente, a relação entre a metástase tumoral e expressão de PSCA não foi exaustivamente investigado, embora alguns estudos sugerem que o PSCA pode desempenhar um papel na limitação da migração tumoral e metástase [60]. No entanto, mais estudos são necessários para entender melhor como a expressão de PSCA contribui para a metástase do câncer de próstata, e B16-PSCA pode ser um modelo adequado para tais estudos.

Em conjunto, temos relatado um novo sistema de vector VEDC que pode fornecer auto-antigénio tumoral de PSCA para células apresentadoras de antigénios e montar respostas imunitárias específicas a vacinas. Este VEDC-PSCA pode ultrapassar a tolerância imunológica a PSCA, gerar imunidade de células T que pode proteger os ratinhos em modelos de tumor de próstata TRAMP-C1, e inibir significativamente B16-PSCA formação de metástases do pulmão. Esses resultados oferecem evidências para apoiar o uso de DCLVs para entregar vacinas contra o câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Ratos e linhas celulares

Homem camundongos C57BL /6 (6-8 semanas de idade) foram adquiridos a partir de Charles River Laboratories (Wilmington, MA, EUA). Todos os ratos foram mantidos no biotério da Universidade do Sul da Califórnia (USC) sob temperatura controlada e um 12 h ciclo claro /escuro, com livre acesso a água e comida padrão de laboratório. procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996) eo protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da USC (2010-11450) . O tamanho do tumor de 2000 mm

3 foi utilizado como um ponto final substituto de sobrevivência, e ratos serão sacrificados por inalação a partir de uma fonte de reservatório e uma deslocação cervical de seguimento de CO2. células TRAMP-C1 foram obtidas de ATCC (Manassas, VA, EUA) e cultivadas em DMEM de alto teor de glucose (Cellgro, Manassas, VA, EUA) com L-glutamina, suplementado com 5% de FBS, 5% Nu Soro IV (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA), a insulina pâncreas bovino 5 mg /ml (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e 10 nM dehydroisoandrosterone (ChromaDex, Irvine, CA, EUA). células B16-F10 foram adquiridas a partir da ATCC (Manassas, VA, EUA) e cultivadas em DMEM de alto teor de glucose (Cellgro, Manassas, VA, EUA) com L-glutamina, suplementado com 10% de FBS. células B16-F10 que expressam estavelmente PSCA foram geradas por transdução de células B16-F10 com lentivírus (FUW-PSCA) pseudotipado com glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVG), e foram seleccionadas células clonais.

Construção e produção de vectores lentivirais

o lentiviral plasmídeo de esqueleto FUW-PSCA foi construído por inserção do ADNc de PSCA murino a jusante do promotor de ubiquitina em FUW. FUW é um plasmídeo de lentivírus HIV-1 derivado de composto por um promotor de ubiquitina humana interna-C para conduzir a expressão do transgene e da marmota elemento de resposta para aumentar a estabilidade do transcrito de ARN [61]. Foi empregado o procedimento anteriormente relatado de transfecção transitória de células 293T para produzir o vector VEDC-PSCA [41].