Abstract

O carcinoma hepatocelular (HCC) é uma doença prevalente em todo o mundo, ea maioria das mortes relacionadas com o HCC ocorrer devido a invasão local e metástases à distância. cancro de células estaminais (CSCs) são uma pequena subpopulação de células cancerosas que têm sido propostos para ser responsável pela doença metastática. Recentemente, nós e outros identificaram uma população CSC a partir de linhas de células de carcinoma hepatocelular humano e tumores de xenoenxerto caracterizados pela sua expressão de CD133. No entanto, os mecanismos moleculares precisos pelos quais CD133

+ câncer de células estaminais-como medeiam HCC metástases não foram suficientemente analisados. células de carcinoma hepatocelular Aqui, temos classificados usando CD133 como uma célula-tronco do câncer marcador (CSC) por célula magnética-activado triagem (MACS) e demonstraram que a CD133

+ células HCC não só possuem maior capacidade migratória e invasivo

em vitro

mas também são dotados de capacidade metastático avançado

in vivo

e em amostras HCC humanos quando comparado com CD133

– células de carcinoma hepatocelular. análise de expressão gênica do CD133

+ e CD133

– células da linha HCC SMMC-7721 revelou que receptor acoplado à proteína G 87 (GPR87) é altamente expressa em CD133

células + HCC. Neste estudo, nós exploramos o papel de GPR87 na regulação da expressão de CD133. Nós demonstramos que a superexpressão de GPR87-regulada expressão CD133, promovido migratórias e invasivos propriedades CSC-associados

in vitro

, e aumento da iniciação do tumor

in vivo

. Por outro lado, o silenciamento de expressão GPR87 reduziu os níveis de expressão de CD133. Conclusão: GPR87 promove o crescimento e metástase de CD133

+ células-tronco cancerosas-like, e os nossos resultados podem revelar novos alvos para a prevenção ou terapia HCC

Citation:. Yan M, Li H, Zhu M, Zhao M, Zhang L, Chen T, et al. (2013) G Protein-Coupled Receptor 87 (GPR87) promove o crescimento e metástase de CD133

+ Cancer células-tronco, como em carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 8 (4): e61056. doi: 10.1371 /journal.pone.0061056

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 19 de dezembro de 2012; Aceito: 05 de março de 2013; Publicação: 10 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional Key de Pesquisa básica da China (973) (2009CB521803), a National Science Foundation Natural da China (81.272.438), o Projeto Nacional de Key Sci-tech especial da China (2013ZX10002-11), o Programa de Shanghai Assunto Chief Science (a) (09XD1403600) e levando Academic Projeto Disciplina da Comissão de Educação Municipal de Xangai (J50208). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é um dos cancros humanos mais comuns, ea maioria das mortes relacionadas com o HCC ocorrer devido a invasão local e metástases à distância [1]. Apesar dos progressos significativos, a maioria das abordagens terapêuticas não conseguem eliminar todas as células tumorais e as células cancerosas residuais muitas vezes resultam na recorrência de tumores e metástases. Evidências crescentes mostrou que as células-tronco cancerosas (CSCs) podem ser responsáveis ​​pela resistência à terapia convencional e doença metastática [2], [3], [4], [5]. No entanto, os mecanismos moleculares da metástase não são suficientemente compreendidos.

CD133, uma glicoproteína transmembranar-5, é uma importante proteína de superfície celular que foi identificado como um marcador de células estaminais do cancro em diversos tumores sólidos [6], [7], [8], incluindo o cancro do fígado [5], [9], [10]. Nosso estudo anterior identificado pela primeira vez e confirmou a existência de uma pequena subpopulação de CD133

+ células HCC dentro de linhas de células de carcinoma hepatocelular que apresentaram aumento clonogenicidade

in vitro Comprar e potente tumorigenicidade

in vivo

[11 ]. Outros grupos também têm demonstrado que a CD133

células + HCC possuem propriedades semelhantes a células-tronco cancerosas, incluindo a auto-renovação, diferenciação,

in vivo

iniciação do tumor e resistência a quimioterapia [12], [13], [ ,,,0],14], [15]. No entanto, pouco se sabe sobre o papel de CD133

+ CHC células em metástase tumoral.

receptor acoplado a proteína G 87 (GPR87), também conhecido como GPR95, é um GPR superfície celular que é sobre-expresso em diversos tipos de câncer e desempenha um papel essencial na sobrevivência de células tumorais [16], [17]. Embora muita evidência sugere que GPRs desempenham um papel importante na regulação da morfologia celular, polaridade e da migração [18], [19], [20], há poucos relatos sobre a função do GPR87. Apenas dois relatórios têm mostrado que as células cancerosas GPR87 knockdown sensibilizados para a supressão do crescimento induzido por danos no DNA através de estabilização de p53 reforçada e ativação [16], [21].

No presente estudo, nós isolamos um CD133

+ subpopulação CSC-like de linhas celulares HCC humanos e demonstraram que a CD133

+ células HCC exibido propriedades migratórias e invasivos

in vitro

e possuía potencial metastático

in vivo

. Além disso, exploramos o papel de GPR87 na regulação da expressão de CD133, que por sua vez promoveu o crescimento e metástase de câncer de células-tronco, como em HCC.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

as linhas de células de carcinoma hepatocelular Hep3B, SNU475 e PLC /PRF /5 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, EUA). A linha celular SMMC-7721 foi obtido a partir do Cell Bank, do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular, Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). A linha de MHCC-97L foi fornecido pelo Instituto cancro do fígado de Zhongshan Hospital, Universidade de Fudan (Xangai, China). A linha de células HCC-LY5 foi estabelecido no nosso laboratório por isolamento a partir de uma amostra de HCC de um paciente que havia sido submetido à ressecção de câncer de fígado no Instituto cancro do fígado de Zhongshan Hospital, Universidade de Fudan (Xangai, China). Todas as linhas celulares foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Sigma-Aldrich, EUA) contendo 10% de FBS inactivado pelo calor (Biowest, França) suplementado com 100 UI /ml de penicilina G e 100 ug /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, EUA), e as células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2.

Isolamento de célula a célula magnética-Activated Triagem (MACS)

as células foram marcadas com anticorpo CD133 primário /1 (IgG1 de ratinho, Miltenyi Biotec, Alemanha), e o CD133

+ e CD133

– células foram subsequentemente magneticamente isolado utilizando o Kit de Selecção PE EasySep (StemCell Technologies, Canadá) de acordo com a as instruções do fabricante. A pureza das células separadas foi avaliada por Western blot. Azul tripano a coloração foi utilizado para avaliar a viabilidade de células classificadas, e maior do que 90% de viabilidade foi considerado aceitável para as experiências a jusante.

Lentivírus Produção e transdução celular

A sequência de GPR87 ORF foi amplificado por PCR utilizando iniciadores específicos (para a frente: 5 ‘TCGACGCGTATGGGGTTCAACTTGACGCTTG-3′, reverso: 5’-TTCCATATGGGCAAACATTACACGCAGACAA-3 ‘) e clonado no vector de expressão de lentivírus pWPXL (Addgene, MA) através da substituição do fragmento de GFP. O clone de cDNA CD133 (Myc-DDK-marcado clone ORF do Homo sapiens prominin 1 (PROM1), variante transcrição 1 como transfecção pronto DNA NM_006017.1) com comprimento total seqüência ORF foi comprado de Origene (OriGene Technologies, Inc. Rockville) , que foi clonado no vector de expressão de lentivírus pWPXL (Addgene, MA) através da substituição do fragmento de GFP. Os vectores pLVTHM-shGPR87 e pLVTHM-SHNC foram construídos através da inserção de oligonucleótidos hibridados (GPR87: 5’-CCGGUGCUUUAUCUCAUUATT-3 ‘ou 5′-GGACCUUGGUACUUCAAGUTT-3′, NC: 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘) no vector lentiviral como pLVTHM descrito no site da Addgene.

o envelope virai foi realizada em células 293T HEK após a co-transfecção do vector pWPXL-GPR87 ou pLVTHM-shGPR87 com o plasmídeo de empacotamento e o plasmídeo psPAX2 envelope pMD2.G (Addgene, MA) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Canadá). Os vírus foram colhidos 72 h após transfecção, e os títulos virais foram determinados. células-alvo (1 × 10

5), incluindo SMMC-7721, HCC-LY5, MHCC-97L, PLC /PRF /5 e Hep3B células, foram infectados com 1 × 10

6 unidades de transdução de lentivírus recombinantes em a presença de 6 ug /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, EUA).

imuno-histoquímica (IHC) coloração de tecidos Humanos HCC

dois e trinta e seis amostras de tecido de carcinoma hepatocelular humano foram obtidos a partir de pacientes que foram submetidos a tratamento cirúrgico no Instituto Guangxi Câncer (Nanning, China), o Qidong Liver Cancer Institute (Qidong, China) ou a primeira Hospital Afiliado da Universidade de Zhejiang (Hangzhou, China). Os 236 pacientes HCC incluiu 190 homens e 46 mulheres (idade média: 50,9 anos, variando de 21 a 83 anos). Todos os procedimentos foram realizados sob acordos de consenso e de acordo com o Comitê de Revisão Ética da China. Todas as amostras de tecido foram fixadas em 4% de formalina neutra tamponada com fosfato durante pelo menos 72 h e rotineiramente incluídos em parafina. Os microarrays de tecido foram construídos como descrito previamente [22].

secções embebidas em parafina de tecido da matriz foram preparadas (5 um de espessura), e os imunoconjugados foram detectados por imunofluorescência de acordo com os processos descritos anteriormente [11]. Para as diluições de anticorpos óptimas, foram empregues as concentrações recomendadas pelo fabricante. Os resultados foram visualizados e fotografados utilizando um microscópio Axioskop 2 (Carl Zeiss, Alemanha) com um sistema de CCD DP70 (Olympus, Japão).

em tempo real Transcrição Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase

total o ARN foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Canadá) e transcrito de forma inversa utilizando o Kit ™ PrimeScript RT reagente (perfeito Tempo real) (Takara Biotecnologia, Japão). A reacção em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) foi subsequentemente efectuada tal como descrito anteriormente [22]. Os níveis de expressão foram normalizados contra os do gene de referência interno da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH).

Western Blot

A lise celular, a preparação das amostras, a separação por SDS-PAGE e a electrotransferation membranas de nitrocelulose foram realizadas utilizando protocolos padrão. A imunotransferência foi realizada utilizando ratinho anti-CD133 /1 de IgG1 (Miltenyi Biotec) e visualizada utilizando SuperSignal Oeste Femto sensibilidade máxima de substrato (Pierce). β-actina foi sondado como um controle de carga.

In Vivo

análise do crescimento de tumores e metástases

Todos os protocolos experimentais em animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Shanghai Medical Comissão animal Care experimental em Shanghai Jiaotong University (ID aprovação. ShCI-12-023). De seis a oito semanas de idade congenitamente imunológico deficiente /imuno-deficiência não obesos diabéticos grave combinada (NOD /SCID) ratos machos foram divididos aleatoriamente em grupos e mantidos em condições normais, de acordo com as diretrizes da instituição.

Para inoculação ortotópico, uma incisão transversal de 8 mm foi feita na parte superior do abdómen, sob anestesia. Dez mil CD133

+ ou CD133

– células separadas a partir de células SMMC-7721 foram suspensos em 50 ul de DMEM isento de soro /Matrigel (01:01) e injectado no lóbulo hepático esquerdo dos ratos utilizando uma micro-seringa. a formação de tumores foi monitorizado a começar uma semana após a inoculação. O

in vivo

sinal de luciferase foi visualizado e medido utilizando um

in vivo

sistema de imagem (LB983 NC320, Berthold Technologies GmbH . Co KG, Alemanha). Após 12 semanas, todos os ratinhos foram sacrificados, e as massas de tumor e inoculadas amostras de tecido do fígado de murino foram dissecados e examinados microscopicamente.

Para estabelecer um modelo animal com homing do tumor, NOD /SCID foram lavados primeiro com 20 mg /kg 2-acetaminofluorene (2-AAF) ou DMSO a 0,2% durante uma semana. Em seguida, 2/3 do lóbulo hepático esquerdo foi cirurgicamente ressecado, e CD133 10000

+ ou células CD133

– células que foram recentemente isoladas a partir da linha celular SMMC-7721 por MACS foram injectados no baço. O baço foi ressecado 5 minutos após a injeção, e lavados com 2-AAF ou DMSO continuou até 9 semanas. No final da nona semana, todos os ratos foram sacrificados, a formação de tumor xenoenxerto foram observadas e metástases e os tecidos do fígado e de pulmão foram dissecados e submetidos a exame microscópico [23], [24], [25].

A análise estatística

O pacote estatístico de software Ciências Sociais (versão 18.0) (SPSS) foi usado para análise estatística. O teste t de Student independente ou ANOVA foi utilizado para comparar as variáveis ​​contínuas entre os grupos, enquanto que a análise χ2 foi aplicada para comparações de variáveis ​​dicotômicas.

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Asteriscos foram usados ​​para representar significância estatística de

P valores

em alguns números, por exemplo, * P ≤ 0,05, ** p≤0.01.

Resultados

CD133

+ Células HCC display de alta invasivo e metastático Potencial

In Vitro

CSCs são conhecidos por apresentar potencial migratório e invasivo reforçada. Para investigar ainda mais o potencial metastático de CD133

+ células HCC

in vitro

, resolvemos SMMC-7721, SNU475, PLC /PRF /5 e humanos células primárias de HCC-LY5 HCC com base na expressão CD133 por MACS . A expressão de CD133 de as células separadas foi confirmada por Western blot (Figura 1A), e as características relacionadas com o CSC de as células isoladas foram analisadas. Curiosamente, embora o CD133

+ e CD133

– células classificadas a partir das linhas de células SMMC-7721 e HCC-LY5 não apresentaram diferenças significativas no crescimento (Figura 1B), o CD133

+ células migraram e invadiu a em maior medida do que o CD133

– células em

in vitro

transpoço ensaios de migração e invasão de matrigel (Figura 1C, D), indicando que CD133

+ células são altamente migratória e invasiva. Para testar o seu potencial proliferativo, comparamos as suas capacidades de formação de colónias por proliferação e ensaios de formação de colónias em agar mole. Os resultados demonstraram que a CD133

+ células foram capazes de iniciar colónias maiores e mais numerosos do que os correspondentes CD133

– células (Figura S1, S2), indicando que a CD133

+ células exibem maior crescimento

in vitro

. Além de que, também testou a capacidade de auto-renovação das células CD133 classificadas por ensaio de formação esferóide. Na primeira geração, o CD133

+ células foram capazes de gerar maiores e mais esferóides do que o CD133 correspondente

– células

in vitro

. Na segunda geração, o CD133

+ células tinham mantido seu caráter primário (Figura S3). Os resultados demonstraram que a CD133

+ células mostrar capacidade de auto-renovação ativa

in vitro

em culturas primárias e de passagem.

(A) Isolamento de CD133

+ células HCC classificadas por MACS e detecção da expressão CD133 em SMMC-7721, HCC-LY5, SNU475 e PLC /PRF /5 células por Western blot. curvas (B) crescimento da CD133 ordenada

+ e CD133

– células CHC-LY5 SMMC-7721 e foram obtidos pelo ensaio CCK-8. ensaio de migração (C) Transwell de CD133

+ e CD133

– células separadas do SMMC-7721 e linhas celulares HCC-LY5. (D) Ensaio Transwell matrigel invasão de CD133

+ e CD133

-. Células classificadas a partir das linhas de células SMMC-7721 e HCC-LY5

CD133

+ Células HCC Manifest Características altamente metastáticas

In Vivo

O nosso estudo anterior demonstrou que as células + HCC

CD133 eram nitidamente tumorigénico em um modelo de xenotransplante [11]. Para avaliar ainda mais o potencial metastático do CD133

+ células de carcinoma hepatocelular, estabelecemos um modelo de transplante ortotópico animais. Os resultados mostraram que 10.000 células CD133

+ SMMC-7721 foram suficientes para induzir a formação de tumores em 5/5 (100%) e metástases intra-hepático em 05/02 (40%) de NOD /SCID após 3 meses, enquanto que um equivalente número de CD133

– apenas as células induzidas a formação de tumores em 3/5 (60%) e ratinhos não induzem metástases de tumores (Figura 2A, B, C). Hematoxilina-eosina (HE) revelou características histológicas semelhantes nos transplantes de tumor ortotópicos (Figura 2D). Além disso, para avaliar a

In vivo

homing capacidade de células tumorais, o que é considerado uma característica metastático de CSCs, um modelo animal de homing de células de tumor foi estabelecido em ratinhos NOD /SCID. Os resultados mostraram que 09/09 NOD /SCID inoculados com 10000 CD133

+ CHC células de tumores e metástases desenvolvidos, ao passo que menos tumores foram encontrados nos fígados de ratinhos NOD /SCID tratados com um número equivalente de CD133

– células. Curiosamente, os tumores gerados pela CD133

+ células cresceram e formaram a massa do tumor no local do lóbulo do fígado ressecado, indicando que a CD133

células + HCC são altamente móveis e exibem uma capacidade de tumor-homing (Figura 2E , F), que foi confirmado pelo exame histopatológico (Figura 2G, H). Os resultados apresentados acima firmemente indicou que CD133

+ células possuíam uma alta capacidade de metástase de tumor

in vivo

no HCC.

(A) Representante

in vivo

bioluminescência imagens de metástases tumorais em NOD /SCID após o transplante ortotópico com o CD133 isolado

+ ou CD133

– células SMMC-7721 (imagem mostrada é representante do grupo ortotopicamente transplantado com 10.000 células) (n = 5 cada grupo ). (B) Os exemplos representativos de ratinhos NOD /SCID transplantados ortotopicamente com CD133

+ ou CD133

– células isoladas a partir da linha celular de carcinoma hepatocelular SMMC-7721. (C) Número de murganhos manifestando tumorigenicidade e metástases do fígado de CD133

+ células SMMC-7721 nos ensaios de transplante ortotópico são mostrados na tabela. (D) HE coloração dos tumores colhidos confirmou um fenótipo HCC primário. (E) Representante

in vivo

imagem de bioluminescência de metástase do tumor no NOD /SCID em um modelo animal com homing tumor transplantado com CD133

+ ou CD133

– células isoladas do SMMC-7721 A linha de células (n = 9 em cada grupo). (F) Os exemplos representativos da formação de tumor e metástases do fígado no modelo animal 2-AAF /PHx transplantado com CD133

+ ou CD133

– células isoladas a partir da linha celular de carcinoma hepatocelular SMMC-7721. (G) HE coloração de secções de tecido do fígado, uma massa tumoral de CD133

+ células de carcinoma hepatocelular em 2-AAF modelo animal /PHx foi mostrado. (H) Números de ratos manifestando metástases hepáticas de CD133

+ ou CD133

-. Células SMMC-7721 no modelo animal-homing tumor são mostrados na gragh bar

+ células HCC Mostrar gene Expression Único perfis

Para estudar o mecanismo molecular subjacente a metástase do carcinoma hepatocelular humano, foram comparados os perfis de expressão gênica global do CD133

+ células de carcinoma hepatocelular e sua CD133

– homólogos isolados a partir de células SMMC-7721 usando a matriz Affymetrix GeneChip® Genoma Humano U133 Além disso 2.0. Foram identificados genes expressos diferencialmente 454 comuns que exibiam uma mudança vezes maior do que 1,5. Destes 454 genes, 312 foram regulados positivamente e 142 foram regulados negativamente. Os genes identificados foram ainda submetidos a análise bioinformática. As funções dos genes diferencialmente expressos foram associadas com a adesão celular, a migração, o citoesqueleto, o movimento quimiotáctica e metástases (Tabela S1, S2). Entre os genes que foram diferencialmente expressos entre o CD133

+ e CD133

– populações, GPR87 foi encontrado para ser regulado para cima em cerca de 8 vezes no CD133

+ células em comparação com o CD133

– células. Para esclarecer o papel do GPR87 no crescimento do tumor e metástases de CD133

+ células de carcinoma hepatocelular, primeiro analisou a expressão de GPR87 em linhas de células de carcinoma hepatocelular ordenados e células de carcinoma hepatocelular primário humanos por qRT-PCR e Western blot. Nós descobrimos que os níveis de expressão de GPR87 no CD133

+ linhas de células de carcinoma hepatocelular foram maiores do que nos seus CD133

– homólogos (Figura 3A, C). Em seguida, testamos a capacidade das diferentes linhas de células de carcinoma hepatocelular e culas primias humanas para expressar GPR87. GPR87 foi detectada nas linhas celulares de carcinoma hepatocelular e células de carcinoma hepatocelular primário humanos por análise de Western blot, embora em quantidades diferentes (Figura 3B). Para entender melhor a função do GPR87 no HCC metástases, que primeiro estabeleceu duas linhas de células estáveis ​​que expressam ectopicamente GPR87, SMMC-7721-lenti-GPR87 e HCC-LY5-lenti-GPR87, usando um vetor lentivírus. Em seguida, examinaram a expressão CD133 e as propriedades relacionadas com a CSC nestas linhas celulares estáveis. Verificou-se que a sobre-expressão de GPR87 em células CHC-LY5 SMMC-7721 e resultaram em um aumento no ARNm e os níveis proteicos de CD133 (Figura 3D, E). Para entender melhor a correlação entre CD133 e expressão GPR87 em tecidos de carcinoma hepatocelular, foi realizada coloração imuno-histoquímica. CD133 e GPR87 expressão foi detectada em espécimes de tumor, a expressão de CD133 foi correlacionada com a expressão de GPR87 em tecidos de carcinoma hepatocelular (r = 0,168, P 0,05) (Figura 3F; Tabela S3).

(A) níveis de expressão de mRNA relativas de GPR87 e CD133 foram determinados por reação em cadeia da polimerase quantitativa na CD133

+ e CD133

– populações classificadas do SMMC-7721, HCC-LY5 e linhas celulares MHCC-97L. (B) Western Blot de GPR87 nas linhas celulares de carcinoma hepatocelular e as células humanas primárias. (C) Western blot de GPR87 no CD133

+ e CD133

– populações classificadas do SMMC-7721, HCC-LY5, SNU475 e PLC /RFP /5 células. (D) Os níveis de expressão de proteína de GPR87 e CD133 foram determinados por análise de Western blot na SMMC-7721-Lenti-GPR87 células e HCC-LY5-lenti-GPR87. (E) A expressão do mRNA relativo de GPR87 e CD133 foram determinados por reação em cadeia da polimerase quantitativa na SMMC-7721-lenti-GPR87 e células HCC-LY5-lenti-GPR87. (F) A tabela mostrou a correlação entre CD133 e expressão GPR87 em tecidos de carcinoma hepatocelular.

superexpressão do GPR87 Up-regula CD133 Expressão e afins-CSC Imóveis em

Para determinar o efeito da GPR87 sobre a proliferação celular, analisou-se o papel de GPR87 na formação de colónias. Como representado na Figura 4A, a sobre-expressão de GPR87 em células CHC-LY5 SMMC-7721 e o aumento da capacidade de formação de colónias em comparação com as células correspondentes vazios infectados por vectores (P 0,05). Para examinar se a superexpressão de GPR87 também pode promover o crescimento de tumores e metástases

in vivo

, nós ortotopicamente inoculado 2 × 10 células

6 SMMC-7721-lenti-GPR87 ou SMMC-7721-lenti-controle em o lobo hepático esquerdo da NOD /SCID com uma micro-seringa. O exame macroscópico revelou que 6/6 ratos ortotopicamente inoculados com células SMMC-7721-lenti-GPR87 desenvolveram tumores após 6 semanas, ao passo que o desenvolvimento do tumor foi detectado apenas em 3/6 ratos tratados com um número equivalente de células SMMC-7721-lenti-controle (Figura 4B). Além disso, o tamanho médio do tumor nos ratinhos inoculados com células SMMC-7721-lenti-GPR87 foi 1,6 vezes maior do que em ratinhos inoculados com células-lenti-pWPXL SMMC-7721.

In vitro

Transwell migração e invasão de matrigel ensaios mostraram que as células CHC-LY5-lenti-GPR87 SMMC-7721-lenti-GPR87 e migrado e invadido a uma maior extensão do que as células infectadas com o vector vazio (P 0,05 ) (Figura 4C, D). Estes resultados indicam que GPR87 pode up-regular a expressão CD133 e promover metástases

in vitro

e crescimento

in vivo

. Embora os níveis de proteína CD133 em fragmentos de CCH sem metástase intra-hepática não foram correlacionados com a expressão GPR87 (R = 0,120, P 0,05) (Tabela S4, S5), os níveis de proteína CD133 em tecidos de carcinoma hepatocelular com metástase intra-hepática positivamente correlacionada com a expressão GPR87 (R = 0,267, P 0,05) (Figura 4E, F;. Quadro 1), sugerindo que a CD133 pode ser regulada para cima pela expressão de GPR87 em HCC metastático

(a) Exemplos representativos de ensaios de proliferação de examinar o efeito de GPR87 sobre-expressão em SMMC-7721 e nas células CHC-LY5. (B) As características brutas do NOD portador de tumor /SCID ortotopicamente transplantados com 2 × 10

6 células pWPXL SMMC-7721-lenti- SMMC-7721-lenti-GPR87 e após 6 semanas (n = 6 cada grupo ). (C) Transwell ensaio de migração em células HCC-LY5 com superexpressão GPR87 SMMC-7721 e. (D) Transwell ensaio de invasão de matrigel em células HCC-LY5 com superexpressão GPR87 SMMC-7721 e. (E) imuno-coloração de GPR87 e CD133 em tecidos de carcinoma hepatocelular com metástase intra-hepática. (F) A tabela mostrou a correlação entre CD133 e expressão GPR87 em tecidos de carcinoma hepatocelular com metástase intra-hepática.

O silenciamento de GPR87 Inibe CD133 Expressão e propriedades relacionadas a CSC

Para investigar o papel funcional do GPR87 em CD133

+ células de carcinoma hepatocelular, que inibiu a expressão de GPR87 no PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 e células Huh-7 usando siRNA transfecção. A análise de citometria de fluxo revelaram que o silenciamento de GPR87 reduziu os níveis de CD133 expressão

+ células de 31,4% para 24,1% e 26,7% nas células PLC /PRF /5, a partir de 51,3% para 13,4% e 18,5% nas células Hep3B, de 2,2% para 1,5% e 1,0% em SNU475 células, mas nenhuma alteração foi detectada nas células Huh-7 (Figura 5).

In vitro

, o silenciamento de GPR87 em células PLC /PRF /5 Hep3B e resultou numa diminuição no ARNm e a expressão de proteínas de CD133 (Figura S4). Além disso, GPR87 shRNA resultou na redução do crescimento de células (P 0,05) (Figura S5). Nós também testamos a capacidade das células de invasão, migração capacidade seguinte GPR87 knockdown.

In vitro

Transwell migração e invasão de matrigel ensaios mostraram que houve uma diminuição no /PRF /5-shGPR87 PLC células do que as células infectadas com o vector vazio (P 0,05) (Figura S6). Estes dados sugerem que GPR87 desempenha um papel importante na regulação da expressão CD133.

citometria de fluxo e os níveis de expressão de CD133 em células tratadas com siRNA GPR87, incluindo o PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 e Huh- 7 linhas celulares.

GPR87 medeia a expressão de CD133 em linhas de células de carcinoma hepatocelular

Como experimentos mostrado acima, que tinha provado que knockdown de GPR87 poderia inibir a expressão de CD133 e

in vitro

espalhamento, enquanto a sobre-expressão de GPR87 pode promover a expressão de CD133 e aumentar a metástase tumoral no carcinoma hepatocelular. Para explorar ainda mais a correlação de expressão GPR87 e CD133, estabelecemos com superexpressão linhas celulares CD133 estáveis, SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 e MHCC-97L-lenti-CD133, usando um vetor lentivírus, em seguida, examinou expressão GPR87. Os resultados mostraram claramente que a sobreexpressão de CD133 não foram capazes de regular positivamente a expressão de GPR87 por qRT-PCR (Figura 6A, B) e Western blot (Figura 6C).

(A), a expressão de ARNm de Relativa CD133 em SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 e MHCC-97L-lenti-CD133. (B) a expressão do mRNA relativa do GPR87 em SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 e as células MHCC-CD133-97L lenti. (C) Western blot de GPR87 e CD133 no SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 e as células MHCC-97L-lenti-CD133.

Discussão

O cancro é uma doença sistêmica, e metástase é responsável por mais de 90% de letalidade em pacientes com câncer [26]. Em HCC, metástase é um dos fatores prognósticos mais valiosos e afeta significativamente os resultados dos pacientes [27]. Recentemente, cancro de células estaminais (CSCs) foram identificadas como uma subpopulação de células cancerosas que são responsáveis ​​para a tumorigénese, a resistência à terapêutica, recorrência e metástase [28], [29], [30], [31]. No entanto, o mecanismo molecular de CSC metástase permanece obscura. Além disso explorar este mecanismo pode não só fornecer uma nova visão em HCC mas também identificar um alvo molecular úteis para o tratamento eficiente HCC.

Recentemente, nós e outros identificaram uma população CSC no carcinoma hepatocelular caracterizado por a expressão do CD133. Contudo, as características pormenorizadas de células metastáticas de carcinoma hepatocelular que expressam CD133 permanecem obscuros. Neste estudo, nós mostramos que o CD133

+ células HCC possuem alta invasivo e potencial metastático

in vitro

. Ao contrário de seus CD133

– homólogos, as células 10.000 CD133

+ SMMC-7721 foram suficientes para induzir a formação de tumores ortotópicos e metástase intra-hepático em NOD /SCID após 3 meses. Além disso, nós demonstramos que 10.000 CD133

+ células foram suficientes para induzir metástase experimental após inoculação do baço em um modelo animal com homing tumor, indicando que CD133

+ células têm capacidade de tumor-homing

In vivo

.

recentemente, o aumento da expressão de CD133 foi observada nas células estaminais do cancro de uma variedade de cancros humanos e de ratinho. A evidência emergente tem demonstrado que a expressão de CD133 pode ser regulada por vários factores, incluindo o factor de crescimento transformante beta-1 [32], BMP4 [33], microARN-150 [2] e o interferon-alfa [4]. No entanto, não ligando natural para CD133 foi ainda identificada, e pouco se sabe sobre sua função. No presente estudo, foram comparados os perfis de expressão gênica global de CD133

+ HCC CSCs e sua CD133

– homólogos isolados a partir de células SMMC-7721 utilizando a análise GeneChip e descobriram que a expressão de GPR87 em CD133

+ linhas de células de carcinoma hepatocelular foi aumentada comparada com a de seus CD133

– homólogos. Esta descoberta indica que pode haver uma ligação entre o GPR87 e CD133 no processo de metástase em HCC. No entanto, há evidências confirmou a correlação entre GPR87 e CD133. Aqui, demonstramos pela primeira vez que o silenciamento de GPR87 diminuiu os níveis de expressão de CD133. A superexpressão de GPR87 aumentou significativamente a migração e invasão de células de carcinoma hepatocelular, o aumento da sua capacidade de formação de colónia

in vitro

e promoveu a formação de tumores e crescimento

in vivo

. Estes resultados sugerem que GPR87 desempenha um papel crítico na modulação da expressão de CD133 e contribui para o crescimento e metástases de células CHC.

A metástase mecanismo molecular subjacente em HCC CSCs requer um estudo mais aprofundado. Nosso trabalho futuro vai se concentrar em elucidar o mecanismo subjacente a regulação mediada por GPR87 de CD133 em CSCs HCC e definição de alvos terapêuticos moleculares em HCC CSCs.

Informações de Apoio

Figura S1.

Colony ensaio de formação de CD133

+/- células de carcinoma hepatocelular em cultura 2D. Exemplos representativos de ensaios de proliferação de CD133

+ e CD133

– células isoladas a partir de células SMMC-7721 e HCC-LY5

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061056.s001

(TIF)

Figura S2.

Colony ensaio de formação de CD133

+/- células de carcinoma hepatocelular em agar mole. Exemplos representativos de ensaios de proliferação de CD133

+ e CD133

– células isoladas a partir de células SMMC-7721 e HCC-LY5

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061056.s002

(TIF)

Figura S3.

Spheroid ensaio de formação de CD133

+/- células HCC

in vitro

. Exemplos representativos de ensaios de formação de esferóides de CD133

+ e CD133

– células isoladas a partir de células SMMC-7721 e HCC-LY5

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061056.s003

(TIF)

Figura S4.