Abstract

CD44 e CD147 são associados com metástase e progressão do câncer. Nosso propósito do estudo foi investigar os efeitos da sub-regulação de CD44 ou CD147 sobre a capacidade metastática do câncer de próstata (CaP) células, sua docetaxel (DTX) capacidade de resposta e potenciais mecanismos envolvidos

in vitro

e

in vivo

. CD44 e CD147 foram derrubados (KD) em células CaP PC-3M-luc usando short RNA hairpin (shRNA). A expressão de CD44, CD147, MRP2 (resistência a múltiplas drogas de proteína-2) e MCT4 (monocarboxilato tranporter-4) foi avaliada através de imunofluorescência e Western blotting. A dose-resposta DTX e proliferação foi medida por ensaios de MTT e de colónias, respectivamente. O potencial invasivo foi avaliada utilizando um ensaio de câmara de matrigel. proteínas de transdução de sinal em PI3K /Akt e MAPK /Erk foram avaliadas por transferência de Western. Um

in vivo

subcutânea (s.c.) modelo de xenoenxerto foi estabelecido para avaliar CaP tumorigenecity, metástases linfáticas e resposta DTX. Nossos resultados indicaram que KD de CD44 ou CD147 diminuiu MCT4 e expressão MRP2, a proliferação CaP reduzida e invasiva potencial e maior sensibilidade DTX; e KD de CD44 ou CD147-regulada P-Akt e Erk-P, os principais moduladores de sinal associados com o crescimento e sobrevivência celular. o crescimento do tumor

In vivo

, CD44 ou xenotransplantes CD147-KD PC-3M-luc exibido suprimida com maior capacidade de resposta DTX relação ao controle xenotransplantes. Ambos CD44 e CD147 aumentar a capacidade metastática e chemoresistance de células PAC, potencialmente mediadas por activação da via PI3K e MAPK vias. direcionamento seletivo de CD44 /CD147 sozinho ou combinado com DTX pode limitar CaP metástase e aumentar a quimio-sensibilidade, com a promessa para o tratamento da futura PAC

Citation:. Hao J, Madigan MC, Khatri A, CA Energia, Hung TT, Beretov J, et ai. (2012)

In Vitro

e

In Vivo

Prostate Cancer Metástase e chemoresistance pode ser modulada por Expressão de qualquer CD44 ou CD147. PLoS ONE 7 (8): e40716. doi: 10.1371 /journal.pone.0040716

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D. Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebidas: 1 de fevereiro de 2012; Aceito: 12 de junho de 2012; Publicação: 03 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Hao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Health Conselho de Investigação Médica (NH MRC) (YL), St George Medical Research Foundation (YL), Fundo de Investigação Urologia (PJC) e St. George Hospital Trust Fund (PHG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (CaP) é o mais comumente diagnosticado ea segunda principal causa de morte por câncer em homens nos EUA [1]. Embora inicialmente responder à terapia da privação do andrógeno (ADT), a maioria dos pacientes sofrem de recorrência do câncer após 12 meses, e CAP, nesta fase, não é curável [2]. A progressão da tampa para um estágio avançado é caracterizada pela disseminação de células cancerosas malignas e aglomerados de pequenas células através de vasos linfáticos e vasos sanguíneos. Embora várias alterações genéticas e epigenéticas são relatados na progressão PAC, os mecanismos celulares envolvidos na progressão da tampa localizada para doença metastática permanecem indefinidos.

A quimioterapia é tradicionalmente utilizado para paliação dos sintomas associados com CaP avançado. Dois docetaxel recente (DTX) à base de estudos clínicos têm, pela primeira vez mostrado os benefícios potenciais de quimioterapia para prolongar o tempo de sobrevida e qualidade de vida de pacientes com PAC [3], [4]. DTX é actualmente o fármaco quimioterapêutico mais eficaz para a PAC metastático [3] – [6]. No entanto, a natureza resistente aos medicamentos de Cap ainda desafia a eficácia dessas terapias. Claramente, resistência a múltiplas drogas e doença metastática continuam a ser as principais causas de falha do tratamento e mortalidade em pacientes com PAC. Assim, é de valor significativo para investigar os mecanismos e vias de Cap metástase e resistência às drogas, identificar alvos terapêuticos úteis para melhorar as modalidades terapêuticas actuais.

CD44 é uma proteína multifuncional envolvida na adesão celular, migração, resistência à droga , a transmissão de sinal, a migração e a apoptose [7], [8]. O gene de CD44 contém 20 exões de splicing alternativo para dar muitas isoformas ou variantes (CD44v), algumas das quais formam o domínio extracelular de CD44 padrão invariável (CD44s). CD44 é um receptor principal para o hialuronano (HA), um componente principal da matriz extracelular (ECM) e crítica para interacções de sinalização célula e célula-ECM no cancro. CD44-HA ligação estimula efeitos a jusante sobre as proteínas do citoesqueleto envolvidas na migração de células tumorais, bem como estimular protein1 multirresistência (

MDR1

) expressão e resistência aos medicamentos [9]. CD44s está presente na membrana da maior parte das células de vertebrados [7]. A expressão de certas variantes de CD44 é relatado para ser estreitamente associada com a progressão do tumor, e esta varia dependendo do tipo de tumor estudado [10]. estudos intrigantes têm implicado interações HA /CD44 em epitelial mesenquimal-transição (EMT), “stemness” e câncer [11], [12]. A interacção entre o HA e CD44 foi mostrado para provocar vias relacionadas com o crescimento de tumores e sobrevivência [13], [14]. No entanto, o papel de CD44s e CD44v no desenvolvimento e progressão de CaP é diferente, com estudos mostrando ambos os efeitos promotores de tumor (CD44s) e de inibição de tumor (CD44v) [15] – [17]. O envolvimento de CD44 e suas variantes em Cap progressão e metástases mandados de investigação adicional.

CD147 (metaloproteinase matriz extracelular indutor proteína-EMMPRIN) é uma glicoproteína multifuncional que pode modificar microambiente do tumor através da ativação proteinases, induzindo fatores angiogênicos em ambos tumor e células do estroma, e regulando o crescimento e sobrevivência de células de tumor independente de ancoragem (micrometástases), bem como resistência a múltiplas drogas [18]. análise de transcriptoma e hibridização genômica comparativa de células tumorais individuais isoladas de medula óssea de pacientes com PAC mostrou que CD147 é a proteína mais frequentemente expressa em tumores primários e micrometástases [19]. Além disso, o aumento da expressão CD147 está associada a um aumento dos riscos, incluindo antígeno específico da próstata (PSA) falha, metástase, e reduziu a sobrevida global em Cap humana [20]. Recentemente, mostrou que os elevados níveis de expressão de CD147 correlacionada com a progressão tampão e estão associados com a expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) em tumores, assim como as células estromais [21]. Estes resultados sugerem que a CD147 pode ser um alvo terapêutico útil para a terapia de PAC. No entanto, o papel de CD147 em Cap metástase e resistência aos medicamentos ainda não está claro.

No estudo atual, a hipótese de que (1) CD44 e expressão CD147 correlacionam-se com a capacidade metastática e chemoresistance da PAC e podem cooperar para influenciar a progressão PAC e (2) a regulação negativa de CD44 ou expressão CD147 poderia ter um potencial terapêutico na limitação CaP metástase e aumentar CaP sensibilidade quimioterápico. Nós demonstramos nas seções seguintes que CD44 e CD147 conferem propriedades significativas para Cap metástase e chemoresistance

in vitro

e

in vivo

, e são alvos terapêuticos úteis para a terapia futura PAC.

Materiais e Métodos

Os anticorpos

Os anticorpos foram obtidos a partir de diferentes fontes. As informações detalhadas e condições para todos os anticorpos estão listadas na Tabela 1.

linha celular e cultura de células

O andrógeno-não-responsivos PC-3M-luc-C6 (PC- luc 3M-) CaP linha celular foi obtida a partir de Xenogen Corp, EUA. Todos os reagentes de cultura de tecidos foram fornecidos pela Invitrogen Australia Pty Ltd (Melbourne, VIC, Austrália), salvo indicação em contrário. As células PC-3M-luc foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% (vol /vol) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 50 U /mL de penicilina, e 50 U /mL de estreptomicina. PC-3M-luc-SCR (mexidos shRNA controle), PC-3M-luc-CD44-knockdown (KD), as células PC-3M-luc-CD147-KD foram cultivadas no mesmo meio suplementado com 1 ug /mL de puromicina adicional para o rastreio. Todas as linhas celulares foram mantidas num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO

2.

ARN gancho de cabelo curto (shRNA) transfecção para CD44 /CD147

PC-3M-luc células com KD shRNA mediada por CD44 (s e v) /CD147 ou uma sequência de controlo scrambled para efeitos fora do alvo (PC-3M-luc-SCR) foram gerados utilizando um método previamente publicado com modificação [22]. Cinco MISSION® lentiviral partículas de transdução de codificação para shRNAs contra CD44 ou CD147 e MISSION® não-alvo shRNA partículas de transdução de controle foram utilizados (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Austrália) (Tabela S1). Resumidamente, 2 × 10

4 células PC-3M-luc foram cultivadas em placas de 24 poços e transduzidas com todos os cinco clones de partículas de lentivírus ou a mesma quantidade de partículas de transdução de shRNA controle não-alvo seguindo o protocolo do fabricante (multiplicidade de infecção = 2, unidades transdutoras virais /célula). Os clones transduzidas foram seleccionados em meio de cultura celular contendo puromicina (0,5 ug /mL) (Invitrogen Austrália Pty Ltd., Melbourne, VIC, Austrália), propagados e finalmente transferidos para as 25 cm

frascos de cultura 2 de células e mantidas em meio de contendo 1,0 ug /mL de puromicina para as experiências seguintes.

imunofluorescência confocal análise de microscopia de PC-3M-luc e PC-3M-luc-KD linhas celulares

imunofluorescência foi realizada como previamente descrito [23]. Resumidamente, células cultivadas em lamelas de vidro foram fixadas, lavadas e incubadas com vários anticorpos primários durante a noite (o /n) a 4 ° C: anticorpo monoclonal de ratinho de CD44 anti-humano (MAB) (1:200 diluição), anticorpo policlonal de CD147 (PAB ) (1:100 diluição), MRP2 mAb (diluição 1:50), de coelho anti-humano MCT1 Pab (1:200 diluição) ou MCT4 Pab (1:400 diluição). Após lavagem em TBS, as células foram incubadas durante 45 minutos em 488 Alexa Fluor-cabra anti-rato ou Alexa Fluor 488-IgG de cabra anti-coelho (1:1000 diluições) à temperatura ambiente (RT). iodeto de propídio (PI) (0,2 mg /L) foi utilizado para corar os núcleos. Os controlos negativos foram tratados de forma idêntica, mas incubadas com o mouse ou o controlo de isotipo coelho. Imunofluorescência foi visualizada utilizando um FV300 /FV500 Olympus varrimento a laser microscópio confocal (Olympus, Tóquio, Japão).

análise de transferência de Western

os níveis de expressão de proteína foram determinadas por análise de transferência de Western, como descrito [24] . Em resumo, os lisados ​​celulares totais foram separados por NuPAGE 4-12% Novex electroforese em gel de Bis-Tris e, em seguida, transferidos para membrana de difluoreto de polivinilideno. Após bloqueamento dos sítios não específicos com leite desnatado a 5%, a membrana foi incubada com os anticorpos específicos para as concentrações adequadas (Tabela 1), seguido de incubação com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários (anti-ratinho de cabra ou anti-cabra apropriada coelho para as espécies hospedeiras de anticorpo primário) (1:5000 diluição). bandas imunorreactivas foram detectadas utilizando quimioluminescência aumentada (ECL) substrato (Pierce Chemical Co., Rockford, EUA), e visualizada usando o sistema ImageQuant LAS4000 (GE cuidados de saúde, EUA). Para confirmar o carregamento igual de lisados ​​de proteína, membranas foram despojados (Restaurar Western Blot Stripping Tampão, Pierce) e re-sondado utilizando anti-rato

β

tubulina MAb (1:10000 diluição), e depois processada como acima. As imagens foram processadas no Adobe Photoshop.

Co-imunoprecipitação (IP) ensaio

lisado celular contendo 200 ug lisados ​​de células inteiras de células PC-3M-luc, foi incubado com 2 mg de anti- CD44 ou anticorpos anti-CD147 (ABS) ou soro normal (Ig de controlo) o /n a 4 ° C. Os complexos imunitários foram isolados por precipitação por meio de proteína A /G PLUS-agarose (Santa Cruz Biotechnology, Inc, EUA) durante 8 h a 4 ° C. As esferas foram lavadas 4 vezes em 1000

g

e foram suspensos em 20

μ

L de tampão de amostra NuPAGE LDS (Invitrogen Austrália Pty Ltd, Austrália), em seguida, aquecida a 100 ° C durante 5 minutos . Os extractos foram, em seguida, coradas imunologicamente com anticorpos primários CD44 e CD147, seguido por incubação com anticorpos secundários conjugados com HRP e detectados com substrato ECL. A análise das imagens foi como descrito acima (Western blotting).

ensaio MTT para a resposta DTX

ensaios MTT foram realizados como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com uma gama de concentrações (0,001-1000 nM) de DTX diluídos em etanol a 100%, e um controlo de veículo. Após 72 h de incubação, o meio foi substituído com meio fresco contendo 0,5 mg /mL de MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio]. Após 4 h, os sobrenadantes foram removidos e o MTT resultante formazano solubilizado em DMSO e medido espectrofotometricamente a 562 nm num BIO-TEK leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Os resultados representam a razão OD de DTX-tratadas e células tratadas com o veículo. A curva de inibição de crescimento foi gerado utilizando o programa GraphPad Prism 4 (GraphPad, San Diego, CA, EUA). IC absoluta

50 valores foram calculados usando a interseção da droga resposta normalizada de 50% e as curvas de inibição do crescimento para cada linha celular, para encontrar os valores do eixo x para IC

50 concentração DTX (nM).

Colony formando ensaios

células PC-3M-luc-KD PC-3M-luc e foram usados ​​para formação de colónia por ensaios, como descrito anteriormente com pequenas alterações [25]. Resumidamente, 1500 células /prato foram semeadas em placas de 10 cm durante 48 h a 37 ° C, 5% de CO

2 e, em seguida, tratados com uma dose fixa de DTX a 3,5 nM concentração final (meia dose do menor IC

50 a partir do ensaio de MTT em quatro linhas celulares de CaP) ou o mesmo volume de veículo de controlo (100% de etanol). Após o tratamento de 3 dias, o meio contendo DTX foi substituído com meio fresco e todas as culturas foram incubadas durante mais 7 dias até as colónias fossem suficientemente grandes para ser claramente discernida. As colónias, definidos como grupos de 50 células, foram contadas manualmente com o auxílio de um Olympus INT-2 microscópio invertido (Tóquio, Japão). O número médio de colónias foram plotados (Média ± SD, n = 3).

Matrigel ensaio de invasão

capacidade invasiva de linhas celulares PAC foi determinada utilizando matrigel comercial e controlar transpo� câmaras (BD Bioscience , NSW, Austrália). Resumidamente, 2 × 10

4 PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, as células PC-3M-luc-CD44-KD e PC-3M-luc-CD147-KD PAC em 500 mL de soro-livre meio foram adicionados a cada transwell inserir e 750 uL forma completa foi adicionada ao poço externo para fornecer quimioatractor e evitar a desidratação. As células foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 24 h e depois coradas com um kit de coloração Diff-Quik (fidelidade Healthcare Corp., McGraw Park, Illinois, EUA). O excesso de corante foi removido por lavagem com água da torneira e o número de células coradas que invadiram o matrigel ou através de controlo inserções foi contado em cinco campos de alta potência (HPF) por microscopia de luz (microscópio Leica, Nussloch, Alemanha). potencial invasivo foi calculado da seguinte forma:% Invasão = [(média células invasoras através de matrigel inserir membrana) /(células que migram através da membrana inserção de controle média)] × 100%. taxas celular invasão foram plotados, com média e SD (n = 3).

subcutâneas (sc) de modelo animal xenoenxerto

Male, 6-8 semanas /ratos de idade Balb c nu (Recursos Animais Centre, Austrália Ocidental) foram alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos em instalações aprovadas pela Universidade de Nova Gales do Sul (UNSW) animal Care e do Comitê de Ética (ACEC) e manipulações foram realizadas em cabines de fluxo laminar. A ACEC aprovado especificamente neste estudo (ID de aprovação é 10 /121A). Os ratinhos foram mantidos, pelo menos, 1 semana antes da manipulação experimental. Todos os ratos permaneceram saudáveis ​​e ativas durante o experimento. Conforme descrito anteriormente [26], culta PC-3M-luc, PC-3M-luc-SCR, PC-3M-luc-CD44-KD ou PC-3M-luc-CD147-KD CaP células (1,5 x 10

6 /injecção) em 100 mL de DPBS, foram implantados subcutaneamente na região do flanco traseiro direito de ratinhos (n = 10 ratinhos /por grupo). a progressão do tumor foi documentada por semana por medições usando compassos de calibre, e os volumes tumorais foram calculados como se segue: comprimento x largura x altura x 0,52 (em milímetros) [27] para um máximo de 8 semanas. No momento do sacrifício, os tumores primários e linfonodos regionais locais foram removidos para exame histológico.

resposta DTX em Cap s.c. modelo animal

Depois de estabelecer s.c. modelos com linhas celulares PAC, quando o tamanho médio do tumor atingiu 30 ± 10 cm

3 em cada subgrupo (n = 10 /subgrupo), 5 ratinhos (n = 5) foram tratados com 25 mg /kg DTX continuamente durante 3 semanas por ip injecção, e 5 murganhos (n = 5) foram tratados com o controlo de veículo (solução salina). O crescimento do tumor foi calculado por medições usando pinças conforme publicado [27].

Mouse tecidos e histologia

Todos os tecidos ou foram fixadas em formalina ou congelado rapidamente. Hematoxilina e eosina (H E) -stained seções foram revisados ​​para avaliar a estrutura do tumor. xenoenxertos de tumor e os nódulos linfáticos regionais e locais foram recolhidos no final das experiências e processado para histologia, imuno-histoquímica e ensaio de TUNEL. Cinco micron secções congeladas de amostras de tumor frescas foram usadas para CD31 e CD44 imunocoloração.

A imuno-histoquímica

imunoperoxidase procedimentos padrão foram usados ​​para visualizar CD147, Ki-67, e caspase-3 (activo) como publicado anteriormente [28]. Resumidamente, secções de parafina foram desparafinados e re-hidratadas, depois incubadas com anticorpos primários (ABS) anti-CD147 (1:200), Ki-67 (diluição 1:1000) e caspase-3 (activo) (1:100 diluição), respectivamente o /n a 4 ° C. As lâminas foram então incubadas com anti-cabra suína, de rato, de coelho biotinilado segundo anticorpo IgG (1:150 diluição) durante 45 minutos à temperatura ambiente e com uma solução de estreptavidina /HRP (1:300 diluição) durante 30 minutos à TA. As secções foram finalmente desenvolvido com 3,3-diaminobenzidina (DAB) de solução de substrato (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Austrália), então contrastadas com hematoxilina; células positivas apareceu castanho. As lâminas de controlo foram tratados de forma idêntica, e usando isotipo ABS ou omitindo o anticorpo primário como um controlo negativo.

CD44 e CD31 imunocoloração em secções congeladas foram realizados como previamente publicado (28). As secções foram incubadas com o rato CD44 anti-humano (diluição 1:200) ou de rato anti-CD31 mAb (diluição 1:100) o /n a 4 ° C. As secções foram incubadas com anticorpo de coelho anti-rato /IgG biotinilado de rato (diluição 1:200) durante 45 minutos à RT, e depois com estreptavidina conjugada com HRP (1:200 diluição) por mais 30 minutos /. As secções foram desenvolvidas com a solução de DAB (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Austrália) e contrastadas com hematoxilina. Para controlos negativos, as secções foram coradas com o MAb isotipo ou com omissão de anticorpos primários.

TUNEL para as células em apoptose

in vivo

A apoptose foi avaliada em tecidos de xenotransplante tumoral utilizando o método TUNEL com o TdT-fragEL no kit de detecção de apoptose in situ (Calbiochem, San Diego, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A especificidade da reactividade TUNEL foi confirmada com negativa apropriada (TdT omitido da mistura de marcação) e positiva (tratados HL-60 lâminas fornecido pela empresa) controles. As lâminas foram examinadas usando um microscópio óptico Leica (Nussloch, Alemanha).

Avaliação da imunocoloração

intensidade de coloração (0-3) foi avaliada através de microscopia de luz (Leica, Alemanha) e um objectivo x40 . Os critérios utilizados para avaliação foram conforme relatado anteriormente [29], onde: 0 (negativo, 25%); 1+ (fraca, 25-50%); 2+ (moderada, 50-70%); 3+ (forte, 75%) das células de tumor coradas. Avaliação da coloração de tecido foi feito, de forma independente, por três observadores experientes (JH, e JB il). Todas as amostras foram pontuadas cego e uma média de notas foi feita.

A análise estatística

Todos os dados numéricos foram expressos como a média dos valores obtidos, e o desvio padrão (SD) foi calculado. Dados de diferentes grupos foram comparadas pelo teste t de Student bicaudal. Todos os

P valores

eram de 2 lados. A análise estatística da intensidade da imunocoloração em xenoenxertos de animais foi efectuada tal como descrito em uma publicação recente [28]. ANOVA de uma via, seguido por teste post-hoc de Dunnett foi realizado para determinar a significância das diferenças entre as curvas de crescimento em s.c modelo para as mudanças de volume de tumor.

P Art 0,05 foi considerado significativo. Todas as análises estatísticas numéricas foram realizadas utilizando o pacote de 4,00 GraphPad Prism (GraphPad, San Diego CA).

Resultados

A expressão de CD44, CD147, MCT4 e MRP2 em CD44 ou CD147-KD e controle linhas celulares

PC-3M-luc e linhas celulares PC-3M-luc-scr CaP apresentou forte coloração positiva para CD44, CD147, MCT4 e MRP2 (Fig. 1A). Seguindo CD44 knock down, a redução na expressão de CD44, também foi associado com uma redução concomitante nos níveis de expressão de CD147, MCT4 e MRP2 (Fig. 1A). De igual modo, depois de derrubar CD147, os níveis de expressão de CD147 foram reduzida e uma redução concomitante nos níveis de expressão de CD44, MCT4 e MRP2 foi também observada (Fig. 1A). Nenhuma coloração detectável foi observada em células incubadas com os controlos de isotipo (dados não mostrados). Os resultados da coloração de imunofluorescência em diferentes linhas celulares de CaP estão resumidos na Tabela 2. Os resultados de imunofluorescência para a expressão de CD44, CD147, MCT4 e MRP2 em linhas celulares PAC foram ainda confirmada por Western blot (Fig. 1B). Os lisados ​​de células PC-3M-luc também foram imunoprecipitados com anticorpo anti-CD44, anticorpo anti-CD147 ou soro normal (Ig), e imunotransferidas com CD44 e CD147 Abs (Fig. 1C). Tanto CD44 (90 kDa) e CD147 (-50 kDa) foram detectadas bandas no anti-CD44 e anti-CD147 lisados ​​IP anticorpo, respectivamente, mas não no precipitado lisado de Ig.

imagens confocais representativos de CD44, CD147 , MCT4 e MRP2 imunofluorescência (verde) depois de derrubar CD44 ou CD147 (A). Os núcleos são coradas com PI (vermelho). Ampliação: todas as imagens × 400. Western blot representativo é mostrado para confirmar a imunofluorescência (B). β-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. scr: mexidos shRNA controle. Os lisados ​​de células PC-3M-luc imunoprecipitados com anticorpo anti-CD44, anticorpo anti-CD147, e soro normal (Ig) seguido por imunotransf erência com anticorpos tanto CD147 CD44 ou (C). IB: imunotransferência; IP:. Immunoprecipitation

Derrube de CD44 ou CD147 sensibiliza células monocamada tampa para DTX tratamento

in vitro

KD (PC-3M-luc -kd-CD44 e PC-3M-luc-KD-CD147) e controle (PC-3M-luc e PC-3M-luc-scr) linhas celulares de boné e com diferentes níveis de expressão de CD44 e CD147 respondeu de forma diferente para DTX tratamento. A IC

50 valores (a dose para obtenção de morte celular de 50%) fortemente correlacionado com os níveis de expressão de CD44 e CD147 (Fig. 2A). Por conseguinte, as células de controlo PC-3M-luc e PC-3M-luc-SCR (níveis elevados de CD44 e CD147) foram as menos sensíveis (IC

50: 118 e 104 nM, respectivamente), enquanto PC-3M-luc -CD44-Kd e células PC-3M-luc-CD147-kD (baixos níveis de CD44 e CD147) foram muito sensíveis ao tratamento DTX (IC

50: 7 e 19 nM, respectivamente). Diferenças significativas (

P

0,05) no IC

50 foi observada entre o PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD e células PC-3M-luc células /PC-3M-luc-RCS.

PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD e PC-3M-luc-CD147-KD CaP células tratadas com DTX (0.001-1000 nM) apresentaram resposta variável. Sensibilidade de células CD44 /CD147-KD, para diferentes concentrações de DTX comparação com os controlos foi obviamente aumentada por ensaio MTT (A) (

P

0,01). Quatro linhas celulares PAC foram semeadas em placas de 10 cm e tratou-se com uma dose DTX fixa (3,5 nM) durante 3 d. Após o tratamento, as células foram cultivadas em meio de crescimento durante 7 d. Os resultados são apresentados como o número de colónias formadas. imagens típicas estão mostradas para o crescimento das colónias em linhas celulares PAC tratados com VC ou DTX (B). Os resultados típicos de sensibilidade DTX em colónias de linhas de células são mostradas CaP (C): “▴” indica que não há diferença significativa no número médio de colónias entre as células tratadas e DTX VC em células tratadas com PC-3M-luc /PC-3M- linhas celulares luc SCR (

P

≥0.05); “○” indica diferença significativa no número médio de colónias entre as células DTX tratada e VC células de PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD linhas celulares (tratado

P

0,05); linhas celulares “Δ” indica diferença significativa no número médio de colónias entre células DTX tratada em PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD e VC células tratadas em PC-3M-luc /PC linhas celulares -3m-luc-SCR (

P Art 0,05). ensaio de invasão de Matrigel foi usado para estudar a mudança na capacidade de invasão em PC-3M-luc, PC-3M-luc-SCR e células PC-3M-luc-CD44 /CD147-KD. potencial invasivo foi significativamente reduzida para 25% e 50% em PC-3M-luc-CD44-KD e PC-3M-luc-CD147-KD, respectivamente, em comparação com 69% e 64% em PC-3M-luc e PC-3M -Luc-scr, respectivamente (

P Art 0,01) (D). Imagens representativas de microscopia de luz para a invasão de células CaP (E). Quatro moléculas de transdução de sinal (P-Akt, Akt-T, P-Erk e t-Erk) foram avaliados para investigar a relação entre CD44, CD147 e vias de sinalização celular. Os níveis de P-Akt e Erk-P foram reduzidos em linhas celulares de KD em comparação com o tipo selvagem e os controlos de SCR. Os resultados representativos são mostrados (F). Todos os resultados foram de três experiências independentes (média ± DP, n = 3). DTX: docetaxel; KD: derrubar; P-Akt: fosforilada-Akt; p-Erk: fosforilada-Erk; scr: mexidos shRNA controle; t-Akt: Total de Akt; t-Erk: Total de Erk; VC: controle do veículo; * Indica 0,01

P Art 0,05; ** Indica 0,001

P Art 0,01; *** Indica

P Art 0,001

Derrube de CD44 ou CD147 reduz a capacidade clonogênica e sensibiliza colônias tampa para DTX tratamento

Para investigar se KD. de CD44 e CD147 afetar a clonogenicidade de sozinho ou combinado com o tratamento DTX, avaliou KD e as células controle PAC em cultura. O número de colónias foi significativamente diminuído, quer com controlo de veículo ou com tratamento DTX no PC-3M-luc-CD44 ou de células CD147-KD em comparação com o PC-3M-luc ou de células PC-3M-luc-SCR, enquanto não houve significativa diferença (

P

≥0.05) entre o número de colónias geradas a partir de células PC-3M-luc-scr PC-3M-luc e. Diferenças significativas (

P

0,05) no número médio de colónias foi observada 1) entre DTX células tratadas e as células CV em PC-3M-luc-CD44-KD /CD147-KD linhas de células tratadas; 2) entre DTX tratada 3M luc-CD44 PC-kd /células CD147-KD e VC trataram células PC-3M-luc /PC-3M-luc scr. Imagens representativas são mostrados na Fig. 2B. A resposta DTX em linhas celulares CD147-KD PC-3M-luc-CD44 ou foi maior do que para PC-3M-luc e linhas celulares de PC-3M-luc-SCR (Fig. 2C). O clonogenicidade (média de colónias tratadas-DTX /veículo média colônias tratados de controle%) foi de 89%, 84%, 56% e 74% para PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc- CD44-KD e PC-3M-luc-CD147-KD linhas celulares, respectivamente.

Derrube de CD44 ou CD147 reduz a invasão de células CaP

Depois de derrubar CD44 ou CD147, invasão celular foi significativamente reduzida para PC-3M-luc-CD44-KD (

P

0,001) e células PC-3M-luc-CD147-kD (

P

0,01) comparado com células de controlo PC-3M-luc-SCR (Fig. 2D) PC-3M-luc e. A relativamente maior redução da capacidade de invasão foi encontrado em células PC-3M-luc-CD44-Kd do que em células PC-3M-luc-CD147-kD (Fig. 2D). A invasão percentagem para PC-3M-luc, PC-3M-luc-SCR, PC-3M-luc-CD44-KD e células PC-3M-luc-CD147-Kd foi de 70%, 62%, 22%, e 47 %, respectivamente (Fig. 2D). Imagens representativas para cada linha celular estão apresentados na Fig. 2E.

PI3K /Akt e MAPK /Erk vias de sinalização estão relacionados com a expressão de CD44 e CD147 em células CaP

Depois de derrubar CD44 ou CD147, descobrimos que a expressão de p- Akt e Erk-P foram ambos regulados negativamente em células PC-3M-luc-CD44 ou CD147-KD em comparação com células de controlo PC-3M-luc-scr PC-3M-luc e, com redução mais significativa no PC-3M-luc- células CD44-KD; não houve nenhuma mudança óbvia em t-Akt e de expressão t-Erk em todas as linhas de células CaP (Fig. 2F).

Derrube de CD44 ou CD147 afeta tumorigenicidade, metástases linfáticas e sensibilidade DTX em um s.c. modelo de xenoenxerto

Como se mostra nos gráficos de crescimento do tumor na Fig. 3A, em comparação com o controlo SCR, as medições semanais de CD44 e CD147 KD xenoenxertos, tratados quer com o controlo de veículo (VC) ou DTX (25 mg /kg), mostrou uma taxa de crescimento de tumores significativamente reduzido em ambos VC (

P

0,05) e os grupos tratados com DTX (

P

0,05) (à esquerda e painéis de meio). Não houve diferenças significativas na taxa de crescimento do tumor de PC-3M-luc do tipo selvagem e PC-3M-luc-scr xenoenxertos em qualquer VC ou DTX grupos tratados (

P Art 0,05). Em xenoenxertos tratados com VC, uma regressão ligeiramente mais forte do crescimento do tumor foi observado em xenotransplantes CD44 KD comparação com xenotransplantes CD147 KD, enquanto nenhuma diferença óbvia foi encontrada entre o crescimento do CD44 KD e CD147 KD tumores (

P Art 0,05). Nos xenoenxertos tratados com DTX, os xenoenxertos de tumor a partir das quatro linhas celulares de CaP tinham volumes tumorais menores em relação ao correspondente xenoenxertos tratados com VC em todos os pontos de tempo (

P

0,05). Um pouco mais a regressão do tumor é visto em tratados DTX xenotransplantes CD44-KD mas nenhuma diferença significativa é encontrada entre as curvas de crescimento CD147-KD CD44-KD e (

P Art 0,05). Além disso, comparou-se a relação de volumes de tumor entre DTX e VC xenoenxertos tratados (DTX /VC) (Fig. 3A, painel da direita). A razão entre os volumes dos tumores CD147-CD44-KD KD e (DTX /VC) diminuíram mais rapidamente em resposta a tratamento DTX ou VC, o que sugere que a Kd quer de CD44 ou CD147 pode induzir a supressão de desenvolvimento de tumor, em comparação com o SCR e wild- digite xenotransplantes.

curvas de crescimento do tumor para PC-3M-luc, PC-3M-luc-SCR, PC-3M-luc -CD44-KD e PC-3M-luc-CD147-KD xenotransplantes são mostrados tanto com VC (a trama à esquerda) ou com tratamentos DTX (a trama no meio). A proporção de DTX tratado versus VC tratados volumes de tumor (DTX /Vc) foi traçada desde o início do tratamento para o fim da experiência (mostrado no gráfico à direita) (A). No final das experiências, o peso do tumor de PC-3M-CD44-KD e PC-3M-luc-CD147-KD ratinhos grupo foi claramente reduzido em comparação com a de PC-3M-luc e PC 3M-luc-scr os murganhos do Grupo com VC e tratamentos DTX (

P Art 0,05) (B). Imagens representativas para os tamanhos do tumor e metástases dos nódulos linfáticos a partir de diferentes grupos e os tratamentos são mostradas (C). DTX: docetaxel; KD: derrubar;