Abstract

overactivation da via Wnt /β-catenina em tecidos adultos tem sido implicada em muitas doenças, como o cancro colorectal. Encontrar substâncias químicas que podem impedir que este fenómeno é um problema emergente. Recentemente, vários compostos naturais têm sido descritos como inibidores de Wnt /β-catenina e podem ser agentes promissores para o controlo de carcinogénese. Aqui, descrevemos duas substâncias naturais, derricin e derricidin, pertencentes à subclasse chalcona, que mostram a inibição da transcrição potente da via /β-catenina Wnt. Ambas as chalconas são capazes de afectar a distribuição das células de β-catenina, e inibir a actividade repórter de Wnt-específica em células HCT116 e

Xenopus

embriões. Derricin e derricidin também actividade fortemente inibida canônica Wnt

in vitro

, e resgatou o fenótipo duplo eixo induzida por Wnt em

Xenopus

embriões. Como consequência da inibição /β-catenina Wnt, tratamentos derricin derricidin e reduzir a viabilidade celular e conduzir a paragem do ciclo celular em linhas celulares de cancro colorrectal. Tomados em conjunto, os nossos resultados apoiar firmemente estes chalconas como novos moduladores negativos da /via β-catenina e crescimento de células de câncer de cólon Wnt

in vitro

Citation:. Fonseca BF, PREDES D, Cerqueira DM, Reis AH, Amado NG, Cayres MCL, et al. (2015) Derricin e Derricidin Inibição de Wnt /β-catenina Sinalização e suprimir Colon Cancer Cell Crescimento

In Vitro

. PLoS ONE 10 (3): e0120919. doi: 10.1371 /journal.pone.0120919

Editor do Academic: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, United States |

Recebido: 25 de junho, 2014; Aceito: 09 de fevereiro de 2015; Publicação: 16 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Fonseca et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:. Este estudo foi financiado por agências brasileiras de financiamento Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Fundação de Amparo à pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior .

competir interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

sinalização de Wnt /β-catenina é a principal causa de muitas neoplasias diferentes, e tem. uma estreita associação com o câncer colorretal (CRC). Aproximadamente 80% de todos os CRCs têm mutações no componentes de Wnt, o que resulta em sobreactivação da via em células do cólon. As mutações mais comuns resultar em perda da função APC que são reguladores negativos desta via de sinalização; e ganho de mutações de função no β-catenina, a principal proteína efectora desta sinalização [1,2,3,4]. Estas mutações fazem com que a sobre-expressão descontrolada de vários oncogenes e genes do ciclo celular, particularmente em células derivadas das criptas intestinais [5].

CRC é uma doença maligna com prevalência elevada, e o terceiro cancro mais diagnosticado no mundo [6]. É difícil de tratar; cirurgia e adjuvantes drogas são comumente usados, mas curar apenas uma pequena porcentagem de tumores [7]. CRC é fortemente associada com desordens genéticas, que é o resultado de mutações no ciclo celular e apoptose importante genes reguladores, tais como KRAS, TP53 e [8] BRAF. Além disso, CRC também pode ser resultado de padrões nutricionais humanos. Demonstrou-se que o alto consumo de alimentos de origem vegetal está relacionada com uma redução da incidência de CRC, por causa das grandes quantidades de compostos antitumorais, tais como os flavonóides naturais e outros polifenóis [7,9].

Os flavonóides são compostos polifenólicos encontrados em muitas plantas e têm uma ampla gama de efeitos biológicos. Porque flavonóides são uma grande parte da dieta humana, têm sido intensivamente estudadas no que diz respeito aos seus efeitos benéficos em muitas doenças humanas, tais como o cancro. Eles têm efeitos anti-proliferativos, anti-invasivas e pró-apoptóticas [10,11,12]. Muitos flavonóides descritos como inibidores de Wnt ter efeitos interessantes sobre o controle CRC e também contribuir para a prevenção desta doença [13,14,15,16,17]. O EGCG flavonóides quercetina e têm sido relatados como drogas anti-câncer promissores [18,19]. Entre os efeitos desses flavonóides é a regulação de vias de sinalização que estão intimamente associados com o cancro, tais como sinalização de Wnt /β-catenina, embora nenhum deles teve sucesso como um medicamento eficaz para o tratamento do câncer.

Aqui, nós investigamos o efeito de dois flavonóides pouco conhecido, derricin e derricidin, que foram extraídos de

Lonchocarpus sericeus

[20]. Derricin derricidin e são capazes de reduzir o crescimento de CRC

In vitro

, através do controlo da progressão do ciclo celular. Além disso, derricin e derricidin eixo duplo induzida Wnt8 fortemente inibida em

Xenopus

embriões, o que indica fortemente que estes flavonóides são moduladores da via /β-catenina Wnt.

Materiais e Métodos

celular, produtos químicos e reagentes

Todos os reagentes de cultura celular foram adquiridos de Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Dimetil sulfóxido (DMSO) e anti-β-catenina foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EUA). Anticorpos secundários foram adquiridos à Life Technologies (CA, EUA). As linhas celulares utilizadas foram HEK293T, L-célula, L-Wnt3a, HCT116, DLD-1 e IEC-18 (ATCC) e RKO-pBar /

Renilla

[21]. As chalconas derricin e derricidin utilizado neste estudo foram extraídas e purificadas por Nascimento e Mors (1972) [20].

Wnt-luciferase Ensaios repórter

RKO-pBar /

Renilla

células foram cultivadas em placas de 96 poços, com 1,0 x 10

4 células /poço em DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino (Gibco). Após confluência, as células foram tratadas com derricin (10, 20 ou 50? M) ou derricidin (10, 20 ou 50 uM) na presença de meio condicionado Wnt3a [22], de um adicional de 24 h. meio de células condicionado G foi utilizada como controlo negativo. DMSO foi também adicionada como controlo do veículo. Depois de 24 h de tratamento, do vaga-lume e

Renilla

actividades de luciferase foram detectados de acordo com o protocolo do fabricante (Dual Luciferase Reporter Assay System da Promega).

HEK293T e HCT116 foram cultivadas em placas de 96 poços com 1,0 x 10

4 células /poço em meio DMEM-F12 com 10% de soro fetal bovino (Gibco). Após 70% de confluência foi alcançado, cada poço foi transfectado com plasmídeos FOP-Flash 50 ng TOP-flash ou, 5 ng TK

Renilla

-luciferase, com ou sem β-catenina [23]. O reagente de transfeco foi usado Lipofectamina (Invitrogen). 15 h após a transfecção, as células foram tratadas com chalconas na presença de meio condicionado Wnt3a, durante 24 h, utilizando 10, 20 ou 30 uM de derricin ou 10, 20 ou 30 uM de derricidin. No dia seguinte, Firefly e

Renilla

actividades de luciferase foram detectados de acordo com o protocolo do fabricante (Dual Luciferase Reporter Assay Sistema, Promega). Manipulações

embrião.

Experiências

Frog foram realizadas de acordo com as diretrizes concedidas pelo Comité de animal Cuidado e Uso de Ética (Comissão de Ética no Uso de animais-CEUA) da Universidade Federal do Rio de Janeiro e foram aprovadas por esta comissão, sob o número 152/13 permissão. As rãs adultas (Nasco Inc., WI, EUA) foram estimuladas com gonadotrofina coriônica humana (Sigma, St. Louis, MO, EUA).

Xenopus

embriões foram obtidos por

in vitro

fertilização e encenado acordo com Nieuwkoop e Farber [24]. Todas as experiências foram realizadas a 22 ° C. Para xWnt8 ARNm sintético, o plasmídeo foi linearizado com NotI e transcrito com ARN-polimerase de SP6 utilizando o estojo de mMessage mMachine (Applied Biosystems). embriões de quatro células de fase foram injectadas na zona marginal ventral, a fim de induzir a formação do eixo secundário. Além disso, os embriões de quatro células de fase foram co-injectados com 10 pg /embrião de ARNm xWnt8 mais 0,4 pmol /embrião de cada chalcona ou 250 pg de Wnt /β-catenina plasmídeo repórter luciferase (S01234-Luc) e 50 TK pg –

Renilla

para executar os ensaios de embrião de luciferase. Após a injeção, os embriões foram mantidos em 0,1x Barth (NaCl 8,89 mM; KCl 0,1 mM; NaHCO 0,24 mM

3; MgSO 0,08 mM

4.7H

2O; Hepes a 1 mm; Ca 0,03 mM (NO

3)

2,4H

2O; CaCl 0,04 mM

2,2H

2O; pH 7,7), até o estágio 27, quando foram analisados ​​os fenótipos ou até gástrula (st 10) quando o actividade de luciferase foi detectada de acordo com o protocolo do fabricante (dual luciferase Reporter Assay System da Promega).

ensaio MTT.

3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de tetrazólio 5-difenil (MTT) foi usada para ensaiar a actividade mitocondrial em células viáveis. As células foram plaqueadas a uma concentração de 1,0 x 10

4 células /poço em placas de 96 poços de cultura de tecido em DMEM meio F-12 contendo soro fetal bovino a 10% e cultivadas durante 24 h antes do tratamento com chalconas (10, 20, 30, 50, ou 100 uM) durante 0, 24, 48 ou 72 h. Adicionou-se MTT a cada poço a uma concentração final de 150 mg /ml durante 4 h antes da colheita das células. O produto da reacção de formazan foi dissolvido com DMSO e quantificado espectrofotometricamente a 570 nm (leitor de microplacas Modulus II multimodo).

imunocoloração.

células HCT116 foram fixadas em paraformaldeído a 4%, lavadas com PBS, e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100. As amostras foram depois bloqueadas durante 1 h com 5% de albumina de soro bovino. Um anti-β-catenina de coelho (1: 200) de anticorpo primário foi incubada durante a noite. anticorpos secundários específicos conjugados com fluorocromo Cy3 (1: 5000) foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente. Após lavagens com PBS, a coloração DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) (Cell Signaling) foi realizada durante 5 min, e, em seguida, as lâminas foram montadas com FluorSave (Calbiochem) e observadas em Nikon TE 2000-S microscópio invertido (Melville , Nova Iorque, EUA). As imagens foram captadas com uma CoolSnap-Pro (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA), câmera digital, com um zoom de 100x e 600x.

A proliferação celular ensaio

Para ensaio de proliferação celular, 5 , 0 X10

4 células foram plaqueadas no dia anterior e tratou-se com 30 pM ou 50 pM ou derricin derricidin durante 24 h. Click-iT EdU (Ciências da Vida) ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. DMSO foi usado como veículo para solubilizar os flavonóides e foi adicionado a controlar as condições de culturas a 0,5%.

análise do ciclo celular.

análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. As células foram enxaguadas brevemente com cálcio e PBS e isolada com tripsina, à temperatura ambiente. Após centrifugação, 1 × 10

6 células foram suspensas em solução Vindeløv 0,5 mL de gelo frio [25] contendo 0,1% de Triton X-100, 0,1% de tampão citrato, 0,1 mg /ml de RNase e 50 ug /mL de iodeto de propídio ( Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA). Após 15 minutos, as células foram analisadas quanto ao conteúdo de ADN, utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EUA). As células vivas foram analisados ​​de acordo com DNA-content. As células que apresentam ADN e possíveis dupletos fragmentados foram excluídos da análise. As células com teor de DNA diplóide (2n, fase G0-G1), a síntese de ADN ( 2n mas 4n, fase S), e duplicados de ADN (4n, fase G2 /M) foram adquiridos e analisados ​​utilizando CellQuest e WinMDI 2,9 software, respectivamente.

a análise estatística.

Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes. Os ensaios de luciferase, do ciclo celular e de MTT foram realizadas em triplicado. coloração de células quantificação foi realizada por contagem do número de DAPI e o número de células coradas β-catenina não nucleares e nucleares em campos microscópicos escolhidos aleatoriamente, e, em seguida, foi calculada a percentagem de células não-nucleares e nucleares das células totais. A análise estatística foi realizada através do teste t de Student não pareado. Nos ensaios MTT, utilizou-se ANOVA de duas vias na sequência de uma pós-teste de Bonferroni (GraphPad Prism Versão 5.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). Na

Xenopus

ensaio de repórter /β-catenina Wnt foi utilizado ANOVA one-way na sequência de um Kruskal-Wallis (GraphPad Prism versão 6.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). de significância estatística de * P 0,05, ** P 0,01 e *** P 0,001

Resultados

Derricin e derricidin inibir a proliferação de linhas de células CRCs

Muitos compostos naturais, incluindo os flavonóides, são capazes de afectar a proliferação celular e a apoptose e, assim, são importantes candidatos para o controlo do cancro. Foi realizado um ensaio de baixa taxa de transferência repórter específica Wnt para rastrear compostos naturais extraídos de plantas diferentes brasileiras (dados não mostrados). Entre os inibidores, encontramos uma actividade de inibição de Wnt /β-catenina detectável exibida por as chalconas derricin e derricidin (Fig. 1). Aqui, usamos duas linhas celulares de CRC, HCT116 e DLD-1, e investigou se derricin e derricidin poderia afetar o crescimento de células do cólon. Nós também investigou o efeito calconas em IEC-18, uma linha não transformada celular derivada de epitélio intestinal de ratos. Em primeiro lugar, estas células tratadas com diferentes concentrações (10-100 uM) destes chalconas para diferentes períodos de tratamento (0-72 h), e analisada a viabilidade das células, através do ensaio de MTT. Em HCT116, observou-se um decréscimo significativo na viabilidade das células em 100 ^ M de derricin nas primeiras 24 horas de tratamento. Após 48 h de tratamento, 20 uM de derricin foi capaz de reduzir a absorvência de MTT (Fig. 2A). Derricidin tiveram efeitos semelhantes na HCT116 e viabilidade celular também reduziu de maneira concentração-e tempo-dependente (Fig. 2B). Além disso, o tratamento com derricin derricidin e diminuiu o número de células HCT116, atingir cerca de 58% e 65% de redução de núcleos corados com DAPI-50 uM de derricin e derricidin, respectivamente (Fig. 2C). Em DLD-1, derricin poderia reduzir a viabilidade das células na concentração de 100 uM com um efeito mais suave em 18 h e uma redução intensa após 48 horas de tratamento (FIG. 2D). Derricidin, por outro lado, teve um efeito mais forte em DLD-1, como 50 uM de chalcona este foi suficiente para diminuir fortemente a viabilidade celular após 18 horas de tratamento (FIG. 2e). Estes chalconas foram também capazes de diminuir o número de células DLD-1 em cultura, atingindo aproximadamente 50% e 70% de redução com 50 uM de derricin e derricidin, respectivamente (Fig. 2F). Quando analisamos o efeito de derricin e derricidin na viabilidade celular de IEC-18 células, pudemos observar que ambos os flavonóides diminuir MTT absorção, a partir das 18 h de tratamento com 100 uM. Interessantemente, nenhum efeito na viabilidade celular foram detectados em concentrações mais baixas (Fig. 2G, H). Além disso, 50 uM de derricin e derricidin tratamento resultou numa redução máxima de 32% e 38% de IEC-18, o número de células (fig. 2i).

(A, B, D, E, G, H) Os gráficos mostram os níveis de absorção de MTT em HCT116, linhas DLD-1 e IEC-18 celulares, após o tratamento até 72 h com 10-100 � de derricin ou derricidin. (A) Em células HCT116, observa-se uma redução significativa na viabilidade das células após 100 uM de derricin durante 24 h e 20 uM de derricin durante 48 h (B) Depois de derricidin tratamento, a redução da viabilidade das células ocorreu a 100 uM de derricidin após 24 h e em 30 mM após 72 h. (D) Em células DLD-1, observa-se um efeito mais suave a 100 uM, após 18 horas de tratamento. Caso contrário, uma intensa redução de MTT absorvância é detectada após tratamento com 100 uM 48h de derricin. tratamento (E) Derricidin reduz significativamente a viabilidade das células DLD-1 18h após o tratamento com 50 uM de flavonóides e em 20 uM após 72h. (G) em células IEC-18, a redução de viabilidade é observado com 100 uM de derricin, começando às 18 horas de tratamento. (H) Um perfil semelhante é observada após tratamento derricidin. (C, F, I) núcleos corados com DAPI foram contadas após 24 h de tratamento com derricin e derricidin. (C) 30 e 50 uM de derricin reduzida em aproximadamente 30% e 58% do número de núcleos HCT116, respectivamente; enquanto derricidin reduzida em aproximadamente 39% e 65%, respectivamente. (F) DLD-1 núcleos foram diminuiu cerca de 44% e 50% após tratamento derricin em 30 e 50 uM de concentrações, respectivamente. Derricidin tratamento diminuiu cerca de 50% e 70%, respectivamente. (I) IEC-18 núcleos também foram reduzidos, com valores de 25% e 32% de redução com 30 e 50 uM de derricin, respectivamente, e 40% e 38%, com 30 e 50 uM de derricidin, respectivamente. * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001

As nossas primeiras análises revelaram que derricin derricidin e foram capazes de diminuir a viabilidade celular, o que sugere que ambos os flavonóides afectar o crescimento de células de cancro . Para testar se derricin e derricidin poderia inibir a proliferação de linhas de células de CRCs, foi realizado ensaio edu-incorporação. Notou-se que ambas as chalconas foram capazes de reduzir o número de células em proliferação, em 30 e 50 uM, em todas as linhas celulares (Fig. 3 A-O ‘). Depois de quantificação, foi possível observar que 30? M de ambos os chalconas inibir cerca de 40% da proliferação celular em HCT116 e cerca de 50% em DLD-1 (Fig. 3 P, Q). Curiosamente, 30 uM de ambos os flavonóides foram capazes de inibir apenas cerca de 20% da proliferação celular em IEC-18, que indica uma diferença na regulação da divisão celular de linhas de células tumorais e não tumorais (Fig. 3R).

Edu incorporação em células do cólon após o tratamento com 30 e 50 uM de derricin e derricidin por 24h. (A, A ‘, B, B’, C ‘, C’) Em condições de controlo, observa-se um número considerável de células edu-positivos. (D, D ‘, E, E’, F, F ‘, G, G’, H, H ‘, I, I’) Após tratamento com derricin, observa-se um número menor de células edu-positivos. (J, J ‘, K, K’, L, L ‘, M, M’, N, N ‘, O, O’) Derricidin tratamento também reduz células edu-positivos. (P, Q, R) A quantificação de células positivas em edu-HCT116, DLD-1 e IEC-18. Barra de escala 50 mm, ** p 0,01, *** p . 0.001

A seguir, perguntou se estes efeitos podem estar relacionados a paragem do ciclo celular. Para fazer isto, nós tratamos, DLD-1 e IEC-18 células HCT116 com cada um dos flavonóides durante 96 h e quantificadas a percentagem de células em diferentes fases do ciclo celular (Fig. 4). As células HCT116 foram tratadas com DMSO principalmente em G1 /G0 do ciclo celular de fase (Fig. 4A, na região M1). tratamento Derricin induzida uma perturbação significativa nestas células diplóides, o que diminuiu a contagem de células na fase G1 /G0 para 67,6% e 54% quando tratado com 30 e 50 uM deste flavonóide, respectivamente (Fig. 4A, na região M1). Derricin afectado o ciclo celular de uma forma dependente da dose, tendo em conta que 30 uM prendeu o ciclo celular na fase S e 50 uM prendeu o ciclo celular na fase G2 /M (Fig. 4A, D). Derricidin também foi avaliado quanto à sua capacidade de controlar o ciclo celular. O tratamento com 30 uM e 50 uM de derricidin reduziu a percentagem de células diplóides de 53,8% e 35,5%, respectivamente, e induziu uma paragem do ciclo celular significativa na /fase G2 M em ambas as concentrações (Fig. 4E). A frequência de células DLD-1, que contém o conteúdo de ADN duplicado foi de aproximadamente 50% em células de controlo e aumentou para 30,3% e 59,3% de células após o tratamento com 30 uM e 50 uM de derricidin. Por outro lado, vivendo DLD-1 em células de adenocarcinoma acumulados fase G0 /G1 do ciclo celular após 30 uM e 50 uM de derricin (Fig. 4B, na região M1). 31,6% das células estavam em fase G0 /G1 em condições não tratados ou tratados com DMSO. Este número atinge 66,9% e 65,7% de células em 30 uM e 50 uM, respectivamente, de derricin. Estes resultados também indicam uma resposta à dose não dependente de tratamento derricin (Fig. 4F). Efeitos similares foram observados quando tratados estes a linha celular com derricidin em ambas as concentrações (Fig. 4B, na região M1, 4G). Curiosamente, IEC-18 apresentaram uma modulação de fase do ciclo celular fracos em ambos os derricin e derricidin tratamentos, excepto para um efeito mais suave a 50 uM de derricin (Fig. 4C, H, I). Tomados em conjunto, estes dados mostram um efeito anti-proliferativo de derricin e derricidin, que actuado por prender o ciclo celular em HCT116 e DLD-1 linhas de células de tumor.

(A, D, E) Em HCT116, não tratada células mostraram cerca de 75% de células na fase G1 /G0, enquanto que 30 e 50 uM de derricin reduzida para essa proporção de 67,6% e 54%, respectivamente, resultando na paragem do ciclo celular em S e G2 /M fases, respectivamente. Derricidin reduziu essa proporção para 53,8% e 35,5%, a parada do ciclo celular induzida respectivamente, e também na fase G2 /M. (B, F, G) Por outro lado, as células DLD-1 acumulados na fase G0 /G1 do ciclo de fase de células depois de 30 uM e 50 uM de derricin ou derricidin. (C, H, I) e Derricin derricidin tratamento teve efeitos mais suaves na progressão do ciclo celular de células IEC-18, excepto para uma prender ligeiramente em G2 /M e 50 uM de derricin. Os gráficos de barras representam a percentagem de células de acordo com o tratamento e os dados foram significativas representado na figura. Barras pretas: G0 /G1 fase; As barras brancas: fase S; e as barras cinza:. G2 /M fases

Derricin e derricidin como inibidores potentes de Wnt /β-catenina sinalização

A desregulamentação na sinalização Wnt canônica está intimamente relacionado com células cancerígenas do cólon [ ,,,0],1,3]. Por exemplo, as células HCT116 tem uma mutação em um gene que codifica a proteína CTNNB1 β-catenina, e, portanto, têm uma elevada actividade da via Wnt /β-catenina [2]. Pedimos se os efeitos de viabilidade celular e ciclo de detenção celular de derricin e derricidin em células HCT116 foram devido a modulação da sinalização de Wnt /β-catenina. Em primeiro lugar, a análise da distribuição celular de β-catenina. Em células não tratadas ou tratadas com DMSO, proteína β-catenina foi encontrada em núcleos de cerca de 50% das células (FIG. 5A, B, C, J). No entanto, quando as células tratadas com derricin, apenas 25% das células mostraram uma coloração nuclear com β-catenina (Fig. 5D, E, F, J). No caso de derricidin, 26% das células mostraram β-catenina nuclear, que também era uma redução significativa na coloração nuclear (Fig. 5G, H, I, J). Porque estes resultados suportam uma possível inibição de Wnt /β-catenina, que abordou o estado de ativação da via Wnt mais diretamente, através da realização de ensaios de repórter específicos Wnt /β-catenina em HCT116 transfectadas com plasmídeo TOPFlash. Consistentemente com os dados anteriores, derricin e derricidin atividade repórter Wnt especificamente inibida (Fig. 5K). Estes resultados mostram que derricin derricidin e foram capazes de inibir a via /β-catenina Wnt na linha celular tumoral HCT116.

(IA) imunocoloração β-catenina de células HCT116 tratados com 30 uM de cada chalcona para 24 h. (A-C) Em condições de controlo, a maioria das células apresentam coloração β-catenina de núcleo. (D-F) Após tratamento com derricin, esta coloração é perdido e a maioria das células mostram β-catenina em citoplasma e membrana. tratamento (G-I) Derricidin também reduz coloração nuclear de β-catenina. (J) Quantificação da imunocoloração demonstrou que ambas as chalconas reduzir nuclear β-catenina. (K) Wnt /β-catenina ensaio de repórter específico de TOPFlash /

Renilla

transfectadas células HCT116. Ambas as chalconas reduzir a actividade repórter de Wnt após tratamento de 30 e 50 uM, durante 24 h. Barra de escala:. 50? M, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

Nossos experimentos usando HCT116 sugerem fortemente que derricin e derricidin são potentes inibidores da sinalização de Wnt canônica . Para fazer face a este efeito, mais especificamente, realizamos experimentos clássicos para analisar regulação via Wnt, isto é, luciferase ensaios de repórter de genes em RKO-pBar /

Renilla

e células HEK293T. Estas células foram tratadas com 10, 20 ou 50 uM de derricin na presença de meio condicionado Wnt3a. Derricin diminuiu a actividade repórter de Wnt de uma maneira dependente da concentração em ambas as linhas celulares (Fig. 6A, C). Derricidin tratamento também foi capaz de diminuir a actividade repórter de Wnt, embora a maior inibição foi apenas obtida quando as células foram tratadas com 50 uM (Fig. 6B, D). Observou-se uma ligeira redução da actividade repórter Wnt após o tratamento com derricidin 20? M. Para saber se derricin e derricidin ato montante ou a jusante da proteína efetora β-catenina, ativamos a sinalização Wnt por transfecção de células HEK293T com β-catenina e avaliou os efeitos de inibição chalconas. Derricin foi capaz de inibir a activação β-catenina de Wnt via, ao passo que não foi derricidin, sugerindo que actua a jusante de derricin β-catenina enquanto derricidin actua a montante (Fig. 6E). Estes dados mostram que derricin e derricidin se comportam como inibidores da via de sinalização /β-catenina Wnt, mas em diferentes concentrações e em diferentes níveis deste sinalização.

(A, C) Derricin inibe a actividade de Wnt-repórter de partida em 10 mM em ensaios de luciferase de RKO-pBar /

Renilla

e HEK293T. (B, D) Derricidin inibe ligeiramente atividade Wnt-repórter em 20 mM em RKO-pBar /

Renilla Comprar e HEK293T. Em RKO-pBar /

Renilla

, maior inibição é conseguida a 50? M de derricidin (B). (A, B) de 10, 20, 50 uM de cada chalcona. (C, D) 10, 20, 30 uM de cada chalcona. (E) HEK293T activação de sinalização Wnt através de transfecção de β-catenina é suprimida mediante tratamento derricin, mas não derricidin. * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0.001

Derricin e derricidin inibir a formação de eixo duplo em

Xenopus

embriões e suprimir Wnt /β-catenina atividade de repórter luciferase

in vivo

a formação eixo secundário induzido por Wnt em

Xenopus

está relacionada com overactivation de sinalização de Wnt /β-catenina durante o desenvolvimento do

Xenopus

embriões, e portanto, moduladores negativos desta via são capazes de reverter ou reduzir o fenótipo duplo eixo [26,27]. Como os nossos dados indicam fortemente que estes flavonóides são inibidores da sinalização de Wnt canônica, decidimos analisar a capacidade de derricin e derricidin para afetar induzida por Wnt formação do eixo duplo em

Xenopus

embriões. Nós embriões com co-injetados

x

mRNA Wnt8 e derricin ou derricidin nos blastômeros ventrais de 4 células em estágio

Xenopus

embriões. Observou-se que cerca de 73% dos embriões apresentaram um eixo secundário após

X

Wnt8 injecção (Fig. 7B, E, F). No entanto, a co-injecção de

X

Wnt8 com derricin ou derricidin reduzida a indução de eixo ectópica (Fig. 7C, D). A co-injecção com derricin foi capaz de reduzir o eixo duplo de 43%, enquanto derricidin reduziu-a em 41% (Fig. 7E, F). Além disso, foram realizados experimentos de luciferase por injecção do plasmídeo S01234-Luc no lado ventral do

Xenopus

embriões. Este

siamois

-reporter é capaz de responder à activação de sinalização de Wnt induzida pela co-injecção de ARNm xWnt8. Nós injectadas concomitantemente 0,4 pmol /embrião de derricin e derricidin para testar se eles podem inibir a activação repórter. Como resultado, ambas as chalconas reduziu a actividade repórter significativamente (Fig. 7G). Estes dados indicam que derricin e derricidin também pode inibir a via Wnt /β-catenina

in vivo

no

Xenopus laevis

embrião modelo.

Imagens representativas de embriões co- injectados com ARNm xWnt8 mais DMSO (B) ou mRNA xWnt8 mais derricin derricidin ou (C, D). Observar a formação de eixo duplo incompleta ou ablação eixo secundário em embriões injectados com chalconas. (E-F) Os gráficos mostram percentagens de fenótipos de embriões. Observa-se que a co-injecção de ARNm com chalconas xWnt8 reduziu a percentagem de embriões com eixo duplo, e aumentaram a percentagem de embriões normais, com um eixo. (G)

Xenopus

embriões injectados com S01234 repórter +

Renilla

, xwnt8 (10 pg) com DMSO ou os chalcones (0,4 pmol /embriões). A activação do repórter foi impedido por injecção chalcona. Pontas de seta: glândula de cimento; seta: eixo duplo incompleta; A-P: ântero-posterior eixo

Discussão

consumo de flavonóides tem sido associada à prevenção, controle e tratamento de vários cancros humanos [28].. Em relação ao cancro colo-rectal, muitos flavonóides têm sido associados com o controle e prevenção desta doença [9,16-18]. As calconas, por exemplo, podem oferecer vantagens como agentes anti-tumorais, em comparação com outros flavonóides, porque eles têm pouca interacção com o ADN e, portanto, um baixo risco de mutagénese [29]. Neste estudo, mostraram que os flavonóides dois (Fig. 1), a partir da subclasse calcona, têm efeitos anti-proliferativos potentes em linhas de células de tumor colo-rectal, HCT116 e DLD-1. Derricin e derricidin tanto contagem total de células e inibiu fortemente a viabilidade destas células in

in vitro

(Fig. 2) e também reduziu a proliferação celular HCT116 e DLD-1 em níveis semelhantes após 24 h (Fig. 3). Foram também analisadas derricin e derricidin efeitos em IEC-18, uma linha de células epiteliais não transformadas. A viabilidade celular foi diminuída apenas em concentrações mais elevadas, de forma diferente do que ocorre em células HCT116 e DLD-1. Além disso, 30 uM de ambos os chalconas teve um efeito ligeiramente na proliferação de células IEC-18, enquanto que uma redução de aproximadamente 50% foi observada em células HCT116 e DLD-1. Estes resultados sugerem um possível efeito mais restrita a células de CRC.

e Derricin derricidin efeitos estão relacionados com a modulação da progressão do ciclo celular, principalmente alterando a percentagem de células nas fases G2 /M e S do ciclo celular em HCT116 e G0 /G1 em DLD-1 (Fig. 4). Curiosamente, derricin derricidin e paragem do ciclo celular ocorre em diferentes fases do ciclo celular em cada linha celular. Estes efeitos podem estar relacionados com um efeito específico de flavonóides em modulação de várias proteínas reguladoras do ciclo celular, e diferenças no fundo de genes mutantes em cada linha de células pode explicar estes efeitos distintos [30]. Além disso, derricin derricidin e não tiveram efeitos significativos na IEC-18, uma linha celular não tumoral. Estes resultados podem ser correlacionados com outros relatos de importantes efeitos citotóxicos destes flavonóides [31,32]. Outros chalcones possuem efeitos apoptóticos e antiproliferativa [33,34,35].

Estudos recentes têm uma melhor compreensão dos mecanismos de ação dos flavonóides. Por exemplo, muitos flavonóides são moduladores de diferentes vias de sinalização, tais como Wnt /β-catenina, que está frequentemente associado a tumor colorrectal progressão [1,2,3,5,36]. Neste estudo observamos que os efeitos antitumorais do derricin e derricidin pode estar relacionado com a modulação via Wnt porque reduziu significativamente a localização nuclear de β-catenina e reduziu a activação de Wnt-repórter em células HCT-116 (Fig. 5). Para entender melhor o efeito sobre a sinalização de Wnt nestes chalconas, foram realizados ensaios de gene repórter na RKO-pBar /

Renilla Comprar e linhas de células HEK293T, que são classicamente usados ​​para investigar este caminho [21,26]. Derricin inibiu fortemente a sinalização Wnt a uma concentração de 10 uM, enquanto derricidin atingiu níveis inibitórios similares apenas com 50 pM em ambas as linhas celulares (Fig. 6A, C). Além disso, derricin e derricidin inibir a sinalização Wnt através de diferentes mecanismos, desde derricin é capaz de neutralizar β-catenina sinalização Wnt activação, enquanto derricidin não é (Fig. 6E). Esta diferença nos efeitos relacionados com a concentração dos dois chalconas pode estar relacionado com as suas estruturas químicas e /ou para a forma que interagem com componentes Wnt ou compartimentos de células, que têm efeitos profundos sobre a sua potência e selectividade.