Sumário
globina citoglobina é uma intracelular de função desconhecida que é expresso principalmente nas células de uma linhagem de miofibroblastos. funções possíveis de citoglobina incluem buffer de oxigênio intracelular e desintoxicação de espécies reativas de oxigênio. trabalhos anteriores em nosso laboratório demonstrou que citoglobina oferece proteção contra danos ao DNA induzidos-oxidante, quando mais de expresso
in vitro
, mas a importância desta em modelos mais fisiologicamente relevantes da doença é desconhecida. Citoglobina é um candidato para o tylosis com gene esofágico do cancro, e sua expressão é fortemente regulada em biópsias esofágicas não-cancerosas de pacientes com TOC em comparação com biópsias normais. Portanto, as células esofágicas proporcionar um modelo experimental ideal para testar a hipótese de que a infra-regulação da expressão citoglobina sensibiliza células para os efeitos prejudiciais de espécies de oxigénio reactivas, particularmente danos no ADN oxidativa, e que este poderia potencialmente contribuir para o fenótipo de TOC. No presente estudo, nós testamos essa hipótese por meio da manipulação citoglobina expressão em ambas as linhas celulares de cancro normais e esofágicas, que têm fisiológico normal e sem expressão de citoglobina respectivamente. Nossos resultados mostram que, de acordo com descobertas anteriores, sobre expressão de citoglobina em linhas celulares de cancro de uma protecção do stress oxidativo induzido quimicamente, mas isso só foi observado em concentrações não fisiológicas de citoglobina. Além disso, a regulação por diminuição dos citoglobina em células normais esofágicas teve nenhum efeito sobre a sua sensibilidade ao stress oxidativo tal como avaliado por um certo número de pontos finais. Concluímos, portanto, que as concentrações fisiológicas normais do citoglobina não oferecem citoproteção de espécies reactivas de oxigénio, pelo menos no modelo experimental atual
Citation:. McRonald FE, Risco JM, Hodges NJ (2012) Protecção contra intracelular Estresse Oxidativo por citoglobina em normais e células cancerosas esofágicas. PLoS ONE 7 (2): e30587. doi: 10.1371 /journal.pone.0030587
editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 11 de novembro de 2011; Aceito: 22 de dezembro de 2011; Publicação: 16 de fevereiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 McRonald et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Cancer Research UK subvenção de projecto C7738 /A10476. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
citoglobina é um membro da família de hemoproteínas globina que incluem hemoglobina e mioglobina, bem como a neuroglobin mais recentemente identificado que é expresso principalmente nas células do SNC [1]. A estrutura cristalina de citoglobina foi resolvido e estudado em detalhe [2], [3], [4], que mostra que citoglobina tem muitas semelhanças com outras globinas, incluindo o clássico de três ao longo de três-alfa dobra globina helicoidal e um P
O2 (oxigénio afinidade) de cerca de 0,2 Torr, semelhante ao da mioglobina [p.ex. 5], [6]. A elevada afinidade para o oxigénio de citoglobina levou à sugestão de que citoglobina podem servir como um sistema de transporte de oxigénio “intracelular”. Neste cenário, é proposto citoglobina para fornecer oxigénio para a mitocôndria para sustentar a fosforilação oxidativa, de uma maneira semelhante à função de mioglobina em células musculares. Curiosamente, afinidade para o oxigénio parece ser redox-sensíveis, e regulada pela formação de uma ponte dissulfureto entre dois resíduos de cisteína (Cys externos B2 e Cys E9). A natureza sensível ao redox de afinidade citoglobina oxigênio sugere um possível papel do citoglobina como um oxigênio “pia /reserva”, em que o oxigênio é liberado somente quando as células tornam-se hipóxico. Embora estes sejam hipóteses atraentes, citoglobina expressão parece ser em grande parte limitada a células de origem fibroblástica com qualquer correlação evidente entre a actividade metabólica dos tecidos e níveis de expressão citoglobina que, em qualquer caso, é bastante baixa na maioria dos tipos de células investigadas [7] , [8]. Estas descobertas levaram à busca de função fisiológica alternativa (s) para citoglobina.
citoglobina foi identificado pela primeira vez em 2001 [9] durante uma tela proteômica das células estreladas hepáticas isoladas de tecido do fígado de ratos fibrótica e de fato era originalmente chamado proteína associação de ativação de células estreladas (STAP), em reconhecimento do facto [9]. Os trabalhos posteriores – tanto
in vitro
e
in vivo
[10] – [13], mais recentemente utilizando animais transgénicos sobre-expressar citoglobina [14], [15] parecem confirmar que citoglobina desempenha um papel na resposta fibrótica num certo número de órgãos, incluindo o fígado e rim. Embora o papel preciso dos citoglobina na fibrose ainda não foi estabelecida, perturbação da homeostasia redox é uma característica bem caracterizado de fibrose e há boas evidências (particularmente no que diz respeito pulmão e rim) que a progressão de lesões fibróticas envolve ciclos de lesão de reperfusão oxidativa subsequente de hipóxia tecidual. Além disso, tem sido demonstrado que a expressão pode ser regulada positivamente citoglobina por hipoxia [16] – [19]. Portanto, parece provável que citoglobina está envolvido na resposta adaptativa associado a esta lesão.
relacionadas com os resultados na doença fibrótica, há também um conjunto emergente de evidências mecanicista para sugerir que citoglobina pode proporcionar proteção contra celular oxidativo lesão em outras circunstâncias, possivelmente como resultado da sua capacidade de sequestrar as espécies de oxigénio reactivas [20] – [23]. Na verdade, o trabalho em nosso próprio laboratório mostrou que a superexpressão de citoglobina reduz os níveis de espécies reativas de oxigênio quimicamente induzidos (ROS) e oferece proteção contra a lesão induzida pró-oxidante (peroxidação lipídica e rupturas dos filamentos de DNA oxidativo) [24]. Em mais apoio para um papel na desintoxicação de ROS, tem sido relatado que possui actividade de peroxidase citoglobina [9]. Curiosamente, mais recentemente, tem sido relatado que citoglobina férrico tem actividade pseudo-peroxidase contra lipidos, sugerindo que, em condições de stress oxidativo, o volume de moléculas sinalizadoras de células à base de lipidos podem também ser parte de uma resposta anti-oxidante dependente da citoglobina [25]. Além disso, um outro vertebrado globina, globina X, foi encontrada para ser associada à membrana e, possivelmente, envolvidas na protecção de lípidos da oxidação [26].
Curiosamente, para além dos possíveis funções discutidas acima, o gene citoglobina (
CYGB
) também é um gene supressor de tumor candidato [27], [28], [29] e nós identificamos
CYGB
como um tylosis candidato com cancro esofágico (
TOC
) gene [30] – [33]. Embora
CYGB
não está mutado em indivíduos tilótico [31] ou em uma série de carcinomas esofágicas células escamosas esporádicas [34], temos mostrado que a sua expressão está fortemente reprimidos em biópsias esofágicas não-cancerosas de pacientes com TOC em comparação com biópsias normais [33].
CYGB
também está metilado e reprimidos em esporádica esofágico, pulmão e cabeça e pescoço cancros [27], [28], [33]. Recentemente, a regulação negativa de citoglobina também foi mostrado para promover a carcinogénese induzida quimicamente em roedor fígado [35].
Há provas convincentes de que os danos oxidativos ao ADN (por exemplo, desoxiguanosina 8-oxo), se não for reparado, contribui para a formação de mutações que se sabe serem importantes na etiologia da carcinogénese humana [36], [37]. Por conseguinte, a hipótese de que a perda de expressão citoglobina tornaria as células esofágicas mais susceptíveis aos efeitos danosos de ROS, e que isso contribui para o fenótipo observado de
TOC. No presente estudo nós testamos essa hipótese por meio da manipulação citoglobina expressão tanto em células normais esofágicas epiteliais e células de carcinoma espinocelular do esôfago, que têm normal, fisiológico e nenhuma expressão endógena de citoglobina, respectivamente.
Resultados
Manipulação de expressão citoglobina
em tempo real de RT-PCR mostrou que a linha celular de cancro TE-8 célula escamosa esofágica tem extremamente baixos níveis endógenos da expressão CYGB (menor do que 10
-5 em relação ao beta actina (ACTB)), enquanto queratinócitos esofágicas normais NE1 expressar CYGB em aproximadamente 0,1 × ACTB. Este nível de expressão natural em células CYGB NE1 foi considerado como sendo o nível fisiológico normal, uma vez que está dentro da mesma ordem de grandeza que aquela observada em um painel de tecidos normais (dados não mostrados). CYGB expressão foi modulada nestas duas linhas de células por qualquer uma transfecção transiente do gene (células TE-8) ou knockdown de ARN utilizando interferência transiente (células NE1). Citoglobina expressão foi induzida artificialmente por cerca de 4 ou 7 ordens de grandeza em TE-8 células, e foi reduzida em cerca de cinco vezes por siRNA knockdown em células NE1 (Figura 1).
Os níveis de expressão CYGB, comparado a expressão ACTB, foram determinadas pelo tempo real de RT-PCR em paralelo uma amostra para cada ensaio cometa realizada. Estes níveis de expressão, portanto, estão directamente relacionados com os dados de ensaio cometa apresentados na Figura 3. A média geométrica de todos os experimentos é mostrado para ambas as células TE-8 células (bares laranja) e NE1 (bares rosa).
Caracterização de células
epitelial esofágico normal (TE-8), as células (NE-1) e do cancro esofágico foram ensaiados quanto a níveis de stress oxidativo, utilizando o composto redox-sensíveis 2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H2DCF -DA) na presença e ausência de butionina sulfoxamine (BSO).
os resultados indicaram que BSO foi capaz de induzir o stress oxidativo em ambas as linhas de células TE-8 e NE1, com uma resposta dependente da concentração, sendo evidente (Figura 2). Em TE-8 células, esta atingiu significância estatística em células não manipuladas (p = 0,0134) e CYGB células transfectadas (p = 0,0034), mas não em células transfectadas em falso (p = 0,092). No entanto, uma tendência similar foi observado em células transfectadas em falso. Na linha de células esofágico normal, NE1, foram obtidos resultados semelhantes: neste caso a resposta ao estresse oxidativo dependente da concentração BSO foi estatisticamente significativa em todos os três grupos de células. BSO foi capaz de induzir o estresse oxidativo nas células controle (p = 0,0032), controle negativo siRNA trataram células (p = 0,0283), e células submetidas a siRNA knockdown de CYGB (p = 0,0077). Embora uma tendência foi observada em células TE-8 em direcção a sobre-expressão de CYGB sendo associada com níveis mais baixos de ROS quando comparado com células transfectadas em falso, este não foi estatisticamente significativa. Não foi observado efeito de CYGB knockdown em células NE1. No entanto, como a nossa principal questão era olhar para o dano ao DNA ROS-associado, e não o estresse oxidativo
per se
, nós próxima realizado o teste do cometa sobre as duas linhas celulares: este tem a vantagem adicional de ser um tanto indicador mais sensível de dano oxidativo celular
O stress oxidativo foi medida em um:. TE-8 e b: as células NE1. Mediana de fluorescência DCF é a média de 5 repetições. Todos os valores foram normalizados para o nível observado nas células de controlo sem BSO. As barras de erro representam SEM + 2020:. reagente de transfecção única; + CYGB: células transfectadas com CYGB comprimento total; siRNA -vos: mexidos controle; CYGB k /d: CYGB siARN. * Resposta estatisticamente significativa dependente da concentração (p 0,05) ** resposta estatisticamente significativa dependente da concentração (p 0,01)
Relação entre dano oxidativo ao DNA e citoglobina expressão
Comet. ensaio.
Nas células TE-8, expressão CYGB foi artificialmente restaurado por transfecção transiente (Figura 1). lesões oxidativas do ADN foi medida pelo ensaio de cometa em células com dois níveis diferentes de expressão CYGB para além dos controlos de linha de base: artificialmente elevado sobre-expressão (cerca de 10
2 vezes relativamente à expressão ACTB) e baixa (aproximadamente fisiológica) expressão (cerca de 10
-1 vezes relativamente à expressão ACTB). No artificialmente altos níveis de expressão CYGB, foi observada uma redução significativa nas lesões oxidativas do ADN sob condições de stress oxidativo exógeno (1000 uM BSO) (p = 0,014), quando comparado com células transfectadas por simulação (Figura 3a) Houve também uma diferença significativa em lesões oxidativas do ADN entre as células com níveis de expressão baixos CYGB /fisiológicas e elevadas (p = 0,035). No entanto, não houve diferença significativa entre as células transfectadas por simulação e aqueles com níveis baixos de expressão /fisiológicas CYGB (p = 0,074); Do mesmo modo não se observou nenhuma diferença entre o controlo e células transfectadas por simulação (p = 0,455). Estes dados sugerem que CYGB exerce um efeito protector contra o dano oxidativo celular apenas com artificialmente elevado – níveis não fisiológicos de expressão. Embora, contra-intuitivamente, houve uma tendência para uma maior dano oxidativo ao DNA quando CYGB foi expresso em níveis baixos /fisiológicas, esta tendência não atingiu significância estatística. Em NE1 células, redução de expressão CYGB por 90% usando RNA de interferência não resultou em nenhuma diferença em danos oxidativos do DNA: esta apoia ainda mais o argumento de que CYGB única exerce os seus efeitos citoprotectores no artificialmente elevados (não-fisiológico) níveis de expressão (figura 3b)
DNA Strand-breaks (linha de base e oxidativo induzido por danos) foram medidos pelo ensaio cometa Fpg modificado em:. TE-8 e B: NE-1 células com diferentes níveis de expressão CYGB (como mostrado na Figura 1). Média de percentual mediana intensidade cauda de cometa é mostrado. As barras de erro representam SEM. * Significativamente diferente umas das outras (p 0,05). # Significativamente diferente do outro (p 0,05).
citoglobina e motilidade celular
Estudos anteriores demonstraram que as influências citoglobina motilidade celular e formação de colónia capacidade [29], no entanto, em o presente estudo foi detectado nenhum efeito do knockdown citoglobina sobre o crescimento de células tanto em queratinócitos esofágicas NE1 ou CCD-18Co miofibroblastos do cólon, em cada 25 ou 50 horas após o ferimento (dados não mostrados).
Discussão
trabalhos anteriores em nossas e de outros laboratórios mostrou que citoglobina tem o potencial para desintoxicar espécies reactivas de oxigénio (ROS)
in vitro
quando sobre-expresso em vários sistemas de cultura de células [20], [21], [22 ], [24]. Além disso, a regulação negativa de citoglobina por RNAi foi também recentemente mostrado para sensibilizar as células de glioma para o stress oxidativo, induzida por ambas a inibição da cadeia de transporte de electrões com antimicina A, e radiação [23] ionizante. Um apoio adicional para um papel para citoglobina na desintoxicação de ROS é a evidência bioquímica que a proteína citoglobina possui actividade de peroxidase intrínseca, bem como propriedades anti-oxidantes e não há evidências de que outros globinas incluindo neuroglobin e globina X pode também ter propriedades similares [20], [ ,,,0],26], [38], [39]. No entanto, no caso de citoglobina, ainda é incerto se este é uma verdadeira função fisiológica de citoglobina ou um artefacto de modelos experimentais utilizados. Até à data, não “reductase citoglobina” foi identificado que poderia reduzir a Fe
3+ volta para Fe
2 +, por isso não está claro como citoglobina oxidados seriam reciclados dentro das células. Há também evidências de que citoglobina tem atividade catalítica contra as espécies reativas de nitrogênio óxido nítrico, catalisando a sua conversão em nitrato de onde ascorbato e citocromo b (5) foram identificados como fontes potenciais de redução de energia [40]. Esta actividade putativo correlaciona-se bem com a observação de níveis elevados de expressão citoglobina em fibroblastos e células musculares lisas da vasculatura, em que o óxido nítrico é um bem conhecido sinalização molecular que medeia o tónus vascular [41]. No entanto, outros estudos têm questionado se dioxigenase óxido nítrico é uma atividade enzimática fisiologicamente relevante de citoglobina [42]. Além disso, há também está emergindo
in vivo
evidência de um papel protetor da citoglobina (e neuroglobin) contra o estresse oxidativo, especialmente em modelos de fibrose que envolvem reperfusão hipóxica e lesão oxidativa subsequente [10] – [15] .
Grande parte destes dados foram gerados em modelos experimentais, onde citoglobina é sobre-expressos, por isso, embora estes são resultados interessantes, a sua relevância fisiológica permanece obscuro. No presente estudo, nós investigamos se citoglobina expressão podia pagar proteção contra dano oxidativo ao DNA quimicamente induzida em células cultivadas esofágicas. Isto é particularmente pertinente, porque
CYGB
é regulada negativamente em ambas tylosis com cancro esofágico e cancro do esófago esporádicas [33] e, portanto, a hipótese de que a perda de expressão citoglobina iria sensibilizar estas células a danos no DNA e que isso pode estar envolvido na etiologia do cancro esofágico. Quando citoglobina foi sobre-expresso em TE-8 linhas celulares de cancro do esófago, que têm pouca ou nenhuma expressão citoglobina endógena, de acordo com estudos anteriores, observamos protecção estatisticamente significativa de dano oxidativo ao DNA induzido BSO avaliada pelo teste do cometa FPG-modificado. Esse efeito, porém, foi-concentração dependente: em níveis mais baixos de superexpressão citoglobina o efeito protetor foi perdido. Consistente com isto, knockdown de níveis fisiológicos de citoglobina em culturas de células primárias esofágicas NE1 não sensibilizar para lesões oxidativas do ADN induzida por BSO como avaliado pelo mesmo ponto de extremidade. Curiosamente, foi recentemente relatado que knockdown de expressão em células de glioma citoglobina por RNAi eleva os níveis de antimicina A induzida por peróxido de hidrogénio [23]. No presente estudo, não observamos diferença significativa nos níveis de estresse oxidativo induzido por BSO, avaliada pela oxidação de diclorofluoresceína. A razão para esta diferença não é clara, mas pode estar relacionada com a linha de célula diferente ou método para induzir o stress oxidativo.
Os nossos resultados sugerem que, embora a indução da expressão citoglobina, por exemplo, como um resultado de hipoxia ou em resposta à lesão oxidativa, tem o potencial para ser protetor, em nosso estudo isso só foi observada em níveis CYGB improvável de ser alcançado
in vivo
. Além disso, não houve evidência de uma sensibilidade aumentada a ROS seguinte knockdown por RNAi em células que expressam citoglobina em níveis fisiológicos. Portanto, um papel citoprotector contra danos no ADN induzida por oxidação não parece ser uma função do citoglobina em células esofágico e outras explicações da função citoglobina e perda de expressão neste modelo de doença são necessários.
Materiais e Métodos
cultura celular
células epiteliais normais esofágicas (NE-1, um presente do professor GSW Tsao, do Departamento de anatomia da Universidade de Hong Kong (ver [43]) foram mantidas em T
75 frascos de cultura utilizando meio isento de soro queratinócitos (Gibco) suplementado com extrato de pituitária bovina (25 ug ml
-1) e fator de crescimento epidérmico recombinante (0,15 ng ml
-1). As culturas foram rotineiramente dividir 01:03 aproximadamente a cada 3-4 dias utilizando tripsina-EDTA e inibidor de tripsina de soja (Gibco) de acordo com o protocolo recomendado para o meio livre de soro queratinócitos. a linha celular de cancro esofágico TE-8 (Um presente do professor Toshio Kudo, Cell Centro de Recursos para a Pesquisa Biomédica , Tohoku University, Japão, [44]) foi cultivada em T
75 frascos de cultura com meio RPMI suplementado com 10% de FBS e 2% de L-Glutamina. células TE-8 foram divididas conforme necessário, utilizando um protocolo de tripsina-EDTA padrão. CCD-18Co miofibroblastos do cólon (adquirido de produto ATCC NO: CRL-1459; [45]) foram cultivadas em DMEM supplememented com 10% de FBS, 1% de L-glutamina e aminoácidos não essenciais a 1% (NEAAs). Estas células foram derramados conforme necessário, utilizando um protocolo de tripsina-EDTA padrão.
citoglobina knockdown
NE-1 ou células CCD-18Co foram repicadas em seis poços placas (para teste do cometa) ou placas de doze poços (ROS para o ensaio e o ensaio de cicatrização), e deixou-se atingir 60-70% de confluência antes da transfecção. As células foram transfectadas com 25 nM de concentração final de qualquer um siRNA controlo negativo mexidos (Ambion; AM4611) ou CYGB siRNA (Qiagen; SI03228323 ou Ambion; s41571), utilizando 15 ug ml
-1 reagente TransIT siQuest (Mirus Bio) de acordo com a as instruções do fabricante. Seguindo RNAi knockdown, as células foram incubadas durante 42 horas antes da realização de experiências (24 horas para o ensaio de cicatrização de feridas). Expressão de CYGB foi analisada por RT-PCR (ver abaixo).
A sobre-expressão de citoglobina
TE-8 células de carcinoma de células escamosas do esófago foram subcultivadas em placas de seis ou de doze poços como anteriormente. transfecção transiente de
CYGB
foi realizada com reagente de transfecção Trânsito 2020 (Mirus Bio) (2 uL ou 5 uL por poço de 12 poços ou placas de 6 poços, respectivamente), e comprimento total
CYGB
clone de ADNc num vector pCMV6-AC (Origene) (0,6 ug ou 1,5 ug de 12 poços ou placas de 6 poços, respectivamente), conforme o protocolo padrão para o reagente de transfecção. Após a transfecção, as células foram incubadas durante 42 horas antes da realização de experiências. Expressão de CYGB foi analisada por RT-PCR (ver abaixo).
extracção de ARN, a síntese da primeira cadeia de cDNA e análise por RT-PCR
Isolamento de RNA total foi realizado utilizando um RNeasy Minikit ( Qiagen) com lise directa das células da placa de cultura, e homogeneização utilizando tubos QiaShredder. A transcrição reversa foi realizada utilizando um Kit de RETROscript (Ambion) com, iniciadores oligo dT e 1 ug de ARN total, de acordo com as instruções do fabricante. Para RT-PCR de uma mistura principal foi preparado contendo TaqMan 2 × Master Mix (Applied Biosystems), sonda VIC /MGB β-actina para o controlo endógeno (Applied Biosystems 4326315E), CYGB iniciador e mistura de sondas (sentido 5′-CTC TAT GCC AAC TGC GAC GAG-3 ‘, anti-sentido 5′-AAC TGG CTG AAG TAC TGC TTG-3′ e sonda FAM-5′-TGG TCC CCA TGG TGA GGT TCT TTG furo TG-3’-preto quencher) em RNase -água grátis. Um protocolo padrão de dois passos foi utilizado para a análise em tempo real de RT-PCR (50 ° C durante 2 minutos, seguido por 50 ciclos de 95 ° C durante 15 minutos e 60 ° C durante 1 minuto). O limiar do Ciclo de valores (TC) obtidos foram utilizados para calcular o valor de quantificação em tempo real (RQ), utilizando o método ΔΔCt, com valores ACTB Ct e células não tratadas /untransfected utilizadas como os fatores de normalização.
FPG modificado cometa ensaio
O método foi baseado no de Singh et al [46] com modificações de menor importância [47]. Após o tratamento, as células foram lavadas em PBS frio e raspadas suavemente em 1 ml de PBS fresco (células TE-8) ou (células tripsinizadas NE1). Após centrifugação (8000 rpm, 5 minutos) peletes foram re-suspensas em PBS (150 ul). Uma alíquota de células ressuspensas (30 ul) foi colocado num tubo estéril contendo agarose de baixo ponto de fusão (300 mL) e esta suspensão celular foi transferida para duas lâminas de microscópio de vidro (150 ul por lâmina), pré-revestidos com 0,5% agarose normal de ponto de fusão. lamelas de vidro foram adicionadas e as lâminas colocado num tabuleiro de metal sobre gelo durante 10 minutos. As lamelas foram removidas e as lâminas foram incubadas durante 1 h a 4 ° C em tampão de lise (NaCl 2,5, 0,1 M de Na
2EDTA, Tris base 10 mM, 1% de sódio – lauril sarcosinato de, 10% de DMSO e 1% de Triton X -100). As lâminas foram lavadas (3 × 5 minutos) com Tampão de FPG (HEPES 40 mM, 0,1 M de KCl, 0,5 mM de EDTA a 0,2 mg /ml de albumina de soro bovino, pH 8,0) e incubadas com 1 unidade de enzima FPG (Trevigen) em 50 ul de tampão de FPG a 37 ° C durante 1 hora (lâminas de controlo foram incubados apenas com tampão de FPG). As lâminas foram transferidos para um tampão de electroforese horizontal do tanque de electroforese contendo (NaOH a 300 mM e 1 mM de Na
2EDTA, pH 13,0) e ADN permitido relaxar durante 20 minutos. O ADN foi submetido a electroforese (25 V, 0,8 V cm
-1, 20 minutos) e lâminas neutralizados por lavagem (3 × 5 minutos) com tampão de neutralização (Tris 0,4 M, ajustado para pH 7,5). As lâminas foram subsequentemente coradas com Sybr ouro 50 uL (Invitrogen, 10 × solução em tampão de neutralização).
As lâminas foram examinadas em 320 × ampliação utilizando um microscópio de fluorescência (Zeiss Axiovert 10, Alemanha), equipado com um 515 -560 nm de excitação do filtro e um filtro barreira de 590 nm. Uma câmera digital USB (Merlin, Allied Vision Technologies) recebeu as imagens, que foram analisadas usando um sistema de análise de imagem por computador Comet ensaio IV pessoal (instrumentos Perceptive). Imagens de cem núcleos selecionados aleatoriamente foram analisados por slide. Medição de ADN por cento cauda (TD%) foi escolhido para avaliar a extensão dos danos no ADN como esta tem sido demonstrado que sofre muito menos de variação inter-operar do que os outros parâmetros de cometas, pois é amplamente independente da tensão de electroforese e o tempo de funcionamento [48] . valores médios de três experiências separadas foram analisados por ANOVA e post-hoc teste t de Student, conforme recomendado pelo Duez et al [49].
ROS ensaio
espécies reativas de oxigênio foram avaliadas medindo a oxidação do corante sensível redox 2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H2DCF-dA). Após a hidrólise por esterases intracelulares, o H2DCF resultante é incapaz de sair da célula e é, em seguida, oxidado por ROS para formar a molécula fluorescente DCF. O nível de fluorescência é proporcional ao grau de estresse oxidativo nas células. A fim de induzir artificialmente o estresse oxidativo, butionina-sulfoximina (BSO), o qual inibe o passo limitante da taxa na síntese de glutationa, foi adicionado às células em cultura durante 24 horas antes da experiência a 100 ou 1000 uM.
resumidamente, as seguintes tratamentos 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetato; foi adicionado (concentração final de 10 uM para células TE-8 1 uM ou 0,1 uM para células NE1) e as células incubadas a 37 ° C durante 30 minutos no escuro. As células foram descoladas por tripsinização, sedimentadas por centrifugação e ressuspensas em PBS. a intensidade de fluorescência da amostra foi analisada (canal FITC), utilizando uma citometria de fluxo FACScalibur ™ (Becton Dickinson) e o software Pro CellQuestTM (Becton Dickinson). As células sem corante fluorescente foram usadas como um controlo negativo para corrigir a autofluorescência fundo.
Cicatrização de Feridas Ensaio
NE1 células de queratinócitos esofágico e CCD-18Co miofibroblastos do cólon foram crescidas em placas de doze poços, e submetido a RNAi knockdown de CYGB como anteriormente descrito, utilizando tanto Ambion e Qiagen siRNAs para CYGB, e um controlo scrambled siARN. Cada condição foi repetido seis vezes para cada linha celular. A camada celular foi riscada em forma de cruz utilizando uma ponta de pipeta estéril a 24 horas pós-knockdown. As células foram fotografadas em 1, 25 e 50 horas após o ferimento com uma câmera digital USB. As imagens foram analisadas usando software TScratch [50], que analisou alterações no percentual de espaço aberto da Ferida (OWA).