Abstract

Fundo

cancros da próstata distantes são comumente hormônio refratário e apresentam aumento do crescimento não inibido pela terapia de privação de andrógeno. Compreender todos os mecanismos moleculares que contribuem para o crescimento descontrolado é importante obter estratégias de tratamento eficazes para o hormônio refratário cancros da próstata (HRPC). O receptor de hidrocarboneto de arilo (AHR) afecta um número de processos biológicos incluindo o crescimento celular e diferenciação. Vários estudos têm revelado que ligantes AhR exógenos inibir a proliferação celular, mas evidências recentes sugerem AhR pode possuir funções intrínsecas que promovem a proliferação celular na ausência de ligantes exógenos.

Métodos /Resultados

qRT-PCR e a análise western blot foi utilizada para determinar o ARNm de Ahr e a expressão da proteína em células de LNCaP sensíveis hormonais, bem como linhas celulares de cancro de hormonas refractários DU145, PC3 e da próstata PC3M. células LNCaP expressam ARNm e proteína AhR a um nível muito mais baixo do que os modelos celulares refractário a hormonas. Fraccionamento celular e imunocitoquímica revelaram a localização nuclear do AHR em linhas celulares estabelecidas refractário a hormonas, enquanto as células LNCaP são desprovidas de proteína AhR nuclear. análise de qRT-PCR utilizado para avaliar os níveis basais CYP1B1 e um ensaio de ligação ao elemento de resposta xenobiótica confirmou a actividade de transcrição ligando independente de AHR em DU145, PC3 e células PC3M. níveis basais CYP1B1 foram reduzidos pelo tratamento com inibidor AhR específico, CH223191. Um

in vitro

ensaio de crescimento revelou que CH223191 inibiu o crescimento de células DU145, PC3 e PC3M em um ambiente de andrógeno esgotado. coloração imuno-histoquímica de tecidos de cancro da próstata revelou aumento de localização nuclear de AhR no grau 2 e grau 3 tipos de câncer em comparação com o grau de bem diferenciado 1 cancros.

Conclusões

Em conjunto, estes resultados mostram que AhR é constitutivamente activo em linhas celulares de cancro da próstata avançado que a hormona do modelo de cancro da próstata refractário. ablação química de sinalização AhR pode reduzir o crescimento de células de cancro da próstata avançado, um efeito não conseguido com os inibidores do receptor de androgénio ou de crescimento em meio destituído de androgénio

citação:. ó Richmond, Ghotbaddini M, Allen C, Walker A, Zahir S, Powell JB (2014) O Hidrocarboneto de Aril receptor é constitutivamente activa em células de câncer de próstata avançado. PLoS ONE 9 (4): e95058. doi: 10.1371 /journal.pone.0095058

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 20 de dezembro de 2013; Aceito: 23 de março de 2014; Publicação: 22 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Richmond et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estes estudos foram apoiados pelo National Institutes of /Instituto Nacional de Saúde sobre Minority Saúde e Saúde disparidades /Centro de Investigação em Minority Instituições Grant # 8 G12 MD007590. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que nenhum interesse competindo existem

Introdução

nos Estados Unidos, o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comumente diagnosticado em homens ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer para os homens [1]. A American Cancer Society estima que haverá cerca de 238.590 homens diagnosticados com CaP e que 29.720 irão morrer de causas relacionadas CaP em 2013 [1]. Segundo as estatísticas nacionais de sobrevivência, a taxa de sobrevivência de cinco anos para os homens diagnosticados com câncer de próstata local ou regional é de 100%. No entanto, homens diagnosticados com metástases à distância têm uma taxa de sobrevivência de cinco anos de apenas 29% [2].

Desde PCA é dependente de andrógeno, o tratamento primário envolve a terapia da privação do andrógeno (ADT) para a doença metastática [3] . A maioria dos cancros da próstata inicialmente responder aos ADT como medido por uma redução no soro ao antigénio específico da próstata (PSA). No entanto, dentro de 2 anos a maioria dos pacientes parar de responder ao tratamento e desenvolver o câncer de próstata hormônio refratário (HRPC) [4], [5]. Não há cura para o câncer hormônio refratário próstata (HRPC), que apesar de resistente ADT ainda está andrógeno dependente do receptor [6]. Diversos mecanismos têm sido implicadas na sinalização do receptor de androgénio em HRPC sustentada. Estes incluem aumentos na expressão do receptor de andrógeno, o aumento da esteroidogênese nas células tumorais, mutações pontuais que alteram a atividade do receptor de andrógeno, mudanças no equilíbrio de co-ativador /proteínas co-repressor, e mudanças na célula caminhos que crosstalk com receptor de andrógeno [5 sinalização ], [7]. Os resultados recentes sugerem que o receptor de hidrocarboneto aromático pode participar de crosstalk com o crescimento AR AR e apoio em condições de andrógenos privados. Além disso, estudos têm demonstrado que AhR tem um impacto sobre a actividade de transcrição do receptor de androgénio. Ahr e o translocador nuclear AHR (ARNT) interagem com o receptor de androgénio [8]. No entanto, apenas AhR foi capaz de aumentar a actividade de transcrição do receptor de androgénio, na ausência de um ligando exógeno [9].

Actualmente, AhR é o único membro activada por ligando conhecido da hélice básica-loop-helix ( bHLH) da família de fatores de transcrição. É activado pela ligação de uma vasta gama de toxinas ambientais incluindo poliaromático e hidrocarbonetos policíclicos (PAH) [10]. Enquanto no citosol, AhR é encontrado em um complexo que consiste em duas moléculas de HSP90, p23 co-chaperonas, AhR interagindo proteína imunofilina-like (AIP) e tirosina-cinase c-Src [11], [12], [13] , [14]. O complexo de proteína é concebido para manter a conformação inactiva e prevenir a translocação nuclear.

Após a ligação por ligandos, activado AhR transloca para o núcleo e com a proteína heterodimerizes AhR translocador nuclear (ARNT) [10], [15] . O complexo AhR nuclear interage com elementos de resposta xenobióticos (XRE) nos promotores de genes de fase I e fase II enzimas que metabolizam drogas para aumentar a transcrição [16], [17], [18]. Após a indução de genes responsivos a Ahr sinalização de Ah é imediatamente levantada pela degradação ou por ligação de uma proteína inibidora de [19], [20], [21].

AhR activação pelo ligando foi reportado para antagonizar o receptor de androgénio sinalização. Potente agonista AhR, 2,3,7,8-tetracloro-dibenzo-

p

-dioxin (TCDD), inibiu a atividade transcricional e antígeno prostático específico regulado por testosterona (PSA) expressão dependente de testosterona em uma dose-dependentes forma [22]. TCDD também inibe a proliferação de andrógeno dependente de células de câncer de próstata [23]. Co-ativação de AhR e receptor de andrógeno com TCDD e diidrotestosterona (DHT) reduziu os níveis de proteína AR [24]. Esta observação é uma contribuição para a capacidade de Ahr para promover a proteólise da AR através de montagem de um complexo de ubiquitina-ligase em que AhR actua como uma subunidade de substrato de reconhecimento para recrutar AR e pode explicar as acções antiandrogénicas de uma série de ligandos AhR [25].

Apesar dos estudos confirmando AhR regulação ligando de sinalização AR, AhR pode possuir funções intrínsecas que regulam o crescimento dos cânceres de próstata independentes do estado AR que não tenha sido totalmente estudados. Estruturalmente, AhR contém um sinal de localização nuclear e um sinal de exportação nuclear que são necessários para transportar nuclear-citoplasmática de Ahr [26]. Vários relatórios revelam sinalização AhR constitutiva dentro de vários tipos de câncer. Na ausência de ligandos exógenos, AhR sobre-expressão sobre-regulada a expressão de CYP1B1 gene alvo na fase inicial de adenocarcinoma pulmonar [27]. CYP1B1 também é expresso em células de cancro do pulmão de células não-pequenas, na ausência de um ligando exógeno. expressão CYP1B1 é acompanhada por um aumento da expressão de Ahr e a actividade constitutiva do receptor [28], [29]. Depleção da proteína AhR resultou na diminuição subsequente de expressão CYP1B1, confirmando que a expressão CYP1B1 basal é regulado por sinalização AhR constitutiva. tecidos pré-malignas e malignas mamárias são relatados para ARNm CYP1B1 constitutivamente expresso. Nestes tumores mamários humanos e roedores, AhR foi também sobre-expressa constitutivamente activa e [30].

Além disso, as células de hepatoma de rato não expostas a ligandos AhR exógenos mostrou conter AhR transcricionalmente activo. Além disso, um nível significativo de actividade AhR constitutiva foi relatada em células isoladas de pacientes com carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) (DiNatale2012) cabeça e. actividade de transcrição independente de ligandos Além disso, a sobre-expressão transitória de Ahr em uma linha de células nula AhR também induziu [29], [31].

O tecido da próstata analisados ​​por imuno-histoquímica revelou que a hiperplasia benigna (BPH), as células epiteliais possuem diminuiu significativamente AhR expressão quando comparada com o tecido normal. No entanto, a expressão AhR foi frequentemente aumentada em áreas tumorais mais indiferenciadas [32]. Um estudo separado também detectada expressão significativamente mais elevada de Ahr e activação em células tumorais em relação ao epitélio glandular benigno [33].

A linha de células de LNCaP, derivada a partir de uma metástase de nódulo linfático, é uma linha celular de cancro da próstata humano amplamente utilizados utilizado para demonstrar a sensibilidade de androgénio. células LNCaP expressam um receptor de androgénio mutado e o androgénio específico da próstata [34]. células LNCaP não são tumorigénicas em ratinhos nus [35], [36]. Em contraste, as linhas insensíveis andrógenos de células de câncer de próstata, DU145 e PC3 são altamente tumorigénica em ratinhos nus. Embora eles não expressam o receptor de andrógeno, eles são sensíveis aos andrógenos, mas não têm reprimido o crescimento sob andrógenos privados condições de crescimento [37], [38]. Estas linhas celulares são comumente usados ​​como

in vitro

modelos para estudos envolvendo o câncer de próstata hormônio refratário. A linha celular de cancro da próstata PC3M foi isolado a partir de ratinhos nus após a injecção de células PC3 intraspenic e é altamente metastático [39]. Embora vários estudos têm demonstrado os efeitos da ativação do ligando AhR em linhas celulares de cancro da próstata, nenhum estudo investigou o papel da sinalização AhR constitutiva sobre o crescimento celular do cancro da próstata. Temos relatado anteriormente que AhR é necessária para manter hormona sinalização independente e crescimento pelo receptor de andrógeno em células de câncer de próstata C4-2. Esta evidência mostra um papel direto para AhR no crescimento dependente do receptor de androgénio de células de câncer de próstata [29]. No presente estudo, mostramos que AhR é constitutivamente ativa em células com câncer avançado de próstata e que a ablação de AhR constitutiva sinalização para inibir o crescimento independente de andrógeno não é dependente do estado de receptor de andrógeno.

Materiais e Métodos

química e Reagentes

AhR agonista, 2,3,7,8-tetracloro-dibenzo-

p

-dioxin (TCDD) foi comprado de AccuStandard (New Haven, Connecticut). antagonista de Ahr, (CH223191) foi adquirido a partir de Sigma Aldrich. antagonista do receptor de andrógeno, Casodex (CDX) foi adquirido de Sigma Aldrich.

Cultura de Células

culturas em monocamada aderentes de linhas celulares de cancro da próstata humano LNCaP, DU145, PC3 e PC3M foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% e 100 mmol /L de cada um de penicilina e estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO2 em atmosfera húmida, e o meio foi substituído a cada três dias. As células foram divididas (01:03), quando chegaram perto de confluência. A sua resposta aos andrógenos para a actividade de crescimento e receptor de androgénio foi monitorizada intermitentemente durante o estudo.

Extração de RNA e quantitativa qRT-PCR Análise

O ARN total foi isolado a partir de monocamadas de células cultivadas em cultura de tecidos de 100 mm pratos utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen). 2 ug do ARN total foi transcrito reverso usando o kit Superscript II (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante. O ADNc serviu como molde numa mistura reaccional de 25 ul e foi processada usando o seguinte protocolo: uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 3 min, seguido por 39 ciclos de amplificação (95 ° C durante 10 s e 55-65 ° C durante 30 s), 95 ° C durante 10 s, 65 ° C durante 5 s e 95 ° C durante 50 s. A mistura de reacção 25 uL de qPCR foi misturado com GoTaq Master Mix qPCR (Promega). Melt curva análises foram realizadas após cada corrida para garantir um único produto. a expressão do gene relativa foi determinada utilizando o método de cálculo ΔΔCq. As sequências dos iniciadores utilizados foram os seguintes: G-19: Avançado (5′-3 ‘) TCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTT Reverso (5′-30:) TGCCTGTCACTATTCCTCATGCCA reverso (5’-3 ‘) TCTGCTGGTCAGGTCCTTGTTGAT A especificidade destes conjuntos de iniciadores foram validados através da realização de experiências usando shRNAs específicos que se destinam a AHR em’ TTGAGACCAGCCTGACCAACATGA CYP1B1 Avançado (5′-3. ‘. Tran et al [29].

isolamento de proteínas e Western Blot Analysis

as amostras de proteínas foram isolados usando o kit Thermo Scientific NE-PER Extraction para as frações celulares ou tampão de lise celular comercialmente disponível (Cell Signaling ) quanto à proteína total. as amostras de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF. a imunotransferência foi realizada com o anticorpo monoclonal de 1 ug /ml de rato Ahr em 1:1000 diluição em leite a 5%. as membranas foram lavadas três vezes (15 min cada) com TBST. As membranas foram depois incubadas em 1:2500 diluição de anticorpo secundário e lava-se três vezes (15 minutos cada) com TBST, três vezes (10 minutos cada) com TBS e uma vez com ddH20 (10 min). Bandas foram visualizados com o kit de quimioluminescência aumentada (ECL), conforme especificado pelo fabricante. Várias exposições de cada conjunto de amostras foram produzidos. A concentração relativa de proteína alvo foi determinada por análise de computador e normalizada a um padrão interno (topoisomerase, β-tubulina, β-actina).

imunocitoquímica coloração e microscopia de fluorescência

Células cultivadas em vidro tampa desliza em placas de 6 poços foram lavados com PBS frio e fixadas por incubação numa solução de metanol 01:01: solução de acetona a 4 ° C durante 30 minutos e, em seguida, seco ao ar. As células foram lavadas e hidratada com soro fisiológico tamponado com Tris contendo 0,05% de Tween 20 (TBST) e transferidos para uma placa de 6 poços limpos. As células foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora numa solução de 5% de leite em TBST para bloquear a ligação não específica, seguindo-se incubação à temperatura ambiente durante 1 hora com anticorpo anti-AhR coelho policlonal purificado por afinidade a 1 ug /ml a 1:1000 diluição em solução de 4% de leite em TBST. As células foram então lavadas três vezes (15 minutos cada) com TBST. As células foram incubadas com uma diluição de isotiocianato de fluoresceína (FITC) 1:200 -conjugated anticorpos anti-coelho (laboratórios Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) em leite a 4% à temperatura ambiente durante 1 hora. As células foram então lavadas três vezes (15 minutos cada) com TBST, três vezes (10 minutos cada) com TBS e uma vez com ddH20 (10 min). As células foram então montadas em lâminas usando UltraCruz definir duro meio de montagem contendo 4’6′-diamidino-2-fenilindole (DAPI).

XRE Encadernação

4 × 10

4 células foram plaqueadas numa placa de 96 poços. células de cancro da próstata foram transfectadas com o repórter XRE, bem como com os plasmídeos repórter de controlo positivos e negativos utilizando attractene. Após 18 horas da transfecção, o meio foi mudado para meio de ensaio padrão (DMEM + FBS a 0,5% de NEAA 0,1 mM). As células foram cultivadas durante mais 24 horas sob condições normais de células. Um ensaio de luciferase duplo foi efectuada depois de 42 horas de transfecção, e a actividade do promotor valores são expressos como unidades arbitrárias (florescence AFU). As experiências foram realizadas em triplicado e o padrão de erro é indicado.

Proliferação Estudos

de crescimento de células foram ensaiadas utilizando o Promega CellTiter 96 Ensaio de Proliferação Celular. As células foram ressuspensas a uma concentração final de 1,0 x 10

5 /mL em meio RPMI. 50 ul da suspensão de células (5000 células) foi adicionada a cada poço da placa de 96 poços contendo 50 ul de meios de comunicação com o tratamento que resulta em um volume total de 100 ul correspondente. As microplacas foram incubadas a 37 ° C durante 24-72 horas numa atmosfera humidificada, 5% de CO

2 atmosfera. Por instruções do fabricante, Após a incubação, 20 ul de solução de MTS foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 4 horas. 100 ul de solução de paragem foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 1 hora. Absorvências foram lidas a 570 nm usando o leitor de microplacas multimodo Synergy H1M.

imuno coloração

lâminas de tecido foram desparafinados em xilol e reidratados em classificados para baixo-série de etanol (70, 90 e 100% ) e, finalmente, ddH20. Os antigénios foram recuperadas usando tampão Biocare antes da incubação em 0,3% H

2O

2 durante 10 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes (5 min cada) em PBS. As lâminas foram bloqueadas por incubação em soro de cabra normal a solução durante 1 hora à temperatura ambiente bloqueio. As lâminas foram incubadas com anticorpo policlonal de 1 ug /ml de anticorpo de coelho anti-AhR (1:100 diluição) durante a noite a 4 ° C. A seguir à incubação com o anticorpo primário, as lâminas foram lavadas três vezes (5 minutos cada) com PBS, antes de uma incubação de 1 hora com a cabra, o anticorpo secundário anti-coelho (1:400) diluição à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes (5 min cada) em PBS e incubadas 10 minutos com diaminobenzedine por instruções do fabricante. Mais uma vez, as lâminas foram lavadas três vezes (5 min cada) com PBS, lavadas com DDQ

2O e desidratado em série graduada-se-de etanol antes de ser limpos em xileno e montadas com meio de montagem com base xileno. Imagens de cada amostra de tecido, bem como correspondentes hematoxilina e eosina manchas foram capturadas com uma ampliação de 400x para pontuação subsequente. Anti-AhR reactividade foi marcado em uma escala de 1-3 (1 = baixa reatividade e 3 = alta reatividade) para o citoplasma e núcleo de cada amostra de tecido por dois investigadores independentes.

Análise Estatística

Cada experiência foi realizada pelo menos 3 vezes e todos os valores são expressos como média + SEM. As diferenças entre os grupos foram comparados pelo teste t ou utilizando software de análise de variância InStat (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

I.. AhR é sobre-expresso em

DU145, PC3 e próstata PC3M linhas celulares de cancro foram utilizados como modelos de células de câncer hormônio refratário próstata Linhas Celulares câncer de próstata avançado. Estes 3 linhas de células têm sido mostrados para manter taxas de crescimento num meio empobrecido androgénio [37], [38], [39]. LNCaP é um modelo celular de andrógeno sensíveis cancro da próstata, cuja taxa de crescimento é reduzida em condições de andrógenos esgotados [34]. A expressão de ARNm de AHR em linhas celulares foi quantificado por qRT-PCR. a expressão da proteína AhR de cada linha foi analisada por Western blot. linhas celulares de cancro da próstata avanço ter um aumento na expressão de ARNm e proteína de Ahr em comparação com o, LNCaP, linha celular sensível androgénio. células LNCaP expressam tanto o ARNm e proteína de Ahr. No entanto, DU145 e PC3 célula tem um aumento de 2,5 e 5 vezes na ARNm Ahr, respectivamente (Fig. 1B). Isto correlaciona-se com o aumento de 2 vezes na proteína AHR em DU145 e o aumento de mais do que 2,5 vezes em células PC3 (Fig. 1A). células PC3M tem o maior aumento em expressão AhR quando em comparação com células LNCaP. Houve um aumento de 10 vezes na ARNm PC3M e aumento de 3 vezes na proteína AhR (Fig. 1).

. proteínas celulares totais foram isolados a partir de células LNCaP, DU145, linhas celulares de cancro da próstata PC3 e PC3M. As proteínas foram separadas por electroforese em gel de SDS poliacrilamida e transferidas utilizando um anticorpo anti-AhR. Anti-β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Imagem J foi usado para obter medidas desitometric de 3 membranas independentes. Cada barra representa a média ± SEM (n = 3) e foram analisados ​​por teste t de Student. Diferenças estatisticamente significativas (* P 0,05) em comparação com o controle LNCaP. B. Os ARNs totais foram isolados e quantitativa de RT-PCR foi realizada para determinar a expressão de ARNm de AHR em linhas celulares de cancro da próstata. Os níveis de ARNm foram normalizados utilizando L-19, o qual serve como um controlo interno. Cada barra representa a média ± SEM (n = 3) e foram analisados ​​por teste t de Student. (*) Indica diferenças estatisticamente significativas entre os grupos.

II. Ligand independente de localização nuclear de AhR

Para determinar a localização de proteínas AhR, foram isoladas fracções celulares e realizou immunoblotting para AhR nas frações nucleares e citoplasmáticos. A análise de transferência de Western de fracções celulares revelou que a expressão AhR aumento nas linhas de células de cancro da próstata avançado é acompanhado por acumulação nuclear de Ahr sem estimulação por um ligando exógeno. Embora a proteína AhR foi detectada nas fracções citoplasmáticos de células LNCaP, não AhR foi detectada nas fracções nucleares LNCaP. Em contraste, as células de cancro da próstata avançado linhas apresentaram expressão elevada da proteína AHR em fracções nucleares (Fig. 2A). Imunocitoquímica confirmou a presença de Ahr no núcleo de células DU145, PC3 e PC3M. A ausência de qualquer sobreposição de coloração na imagem mesclada dos DAPI manchado núcleos e FITC-manchado AhR demonstrou ainda que as células LNCaP não possuem AhR nuclear (Fig. 2B).

A. fraccionamento nuclear e citoplasmática: As linhas celulares foram cultivadas em placas de 100 mm até -75% confluentes, lavou-se com PBS e fracções celulares foram isolados por frio por instruções do fabricante utilizando um kit de extração NE-PER. As fracções nucleares e citoplasmáticos foram analisados ​​por transferência de Western para a expressão da proteína AhR. O nível relativo de AhR citoplasmática foi normalizada com expressão β-tubulina e do nível relativo da energia nuclear AhR foi normalizada com expressão topoisomerase. Barras representam a média ± SEM dos valores corrigidos de três experiências independentes e (*) indica a níveis constitutivos de Ahr nucleares que são significativamente diferentes entre as linhas de células. B. Localização subcelular de AHR em linhas celulares de cancro da próstata por coloração imunocitoquímica: As células foram cultivadas sobre lamelas e fixada com metanol: acetona. Ahr foi visualizado por coloração com anticorpos de coelho policlonais anti-AhR seguido por anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com FITC. Os núcleos foram contra-coradas com corante de DAPI fluorescência. Imagens de canais FITC e DAPI-fluorescência foram fundidas. As imagens foram capturadas em uma ampla microscópio de fluorescência Olympus (ampliação 400x).

III. Constitutiva AhR transcricional Actividade

O repórter Cignal XRE foi usada para medir a actividade basal da via de sinalização AHR em linhas celulares de cancro da próstata avançado. O ensaio utilizado para testar a actividade do promotor AhR revelou que as células de cancro da próstata de avanço DU145, PC3 e PC3M, todos possuem um elevado nível de ligação a Ahr XRE, na ausência de um ligando exógeno. A linhagem celular LNCaP sensíveis andrógeno demonstrado ligação mínima XRE. células PC3 demonstrou a maior actividade do promotor, com um aumento de 10 vezes na ligação em comparação com XRE as linhas de células LNCaP. DU145 e células PC3M demonstrou um aumento de 2,5 e 8 vezes na actividade de promotor em comparação com a linha de células de LNCaP, respectivamente (Fig. 3A).

. Cada linha de células de cancro da próstata foi transfectada com um plasmídeo repórter XRE, bem como com os plasmídeos repórter de controlo positivos e negativos utilizando attractene. Após a transfecção, foi realizado um ensaio de luciferase duplo. valores de actividade do promotor são expressos como unidades arbitrárias (florescence AFU). Cada barra representa a média ± SEM (n = 3) e foram analisados ​​por teste t de Student. (*) Indica diferenças estatisticamente significativas (* P 0,05). B. Análise de qRT-PCR da expressão de ARNm de CYP1B1 em células de cancro da próstata. As células foram tratadas com 50? M de inibidor AhR (CH223191) ou controlo de veículo (DMSO) durante 24 h e os ARN totais foram isolados e quantitativa de RT-PCR foi realizada para determinar a expressão de ARNm de CYP1B1 em cada linhas celulares de cancro da próstata. Os níveis de ARNm foram normalizados utilizando L-19, o qual serve como um controlo interno. Cada barra representa a média ± SEM (n = 3) e foram analisados ​​por teste t de Student. (*) Indica diferenças estatisticamente significativas (* P 0,05) em comparação com linha de células de câncer de próstata LNCaP

Os resultados acima sugerem uma AhR transcricionalmente ativa em linhas celulares de cancro da próstata avançado.. Vários relatórios confirmaram AhR elevada e CYP1B1 mas não CYP1A1 em modelos tumorigênicos [30], [40]. Estes estudos sugerem a existência de diferenças na regulação destes dois genes. CYP1A1 e CYP1B1 expressões são ambos AhR mediada mas diferenças na estrutura do promotor pode resultar em expressão diferencial. Os relatórios indicam que CYP1A1 é o controle através da activação pelo ligando de AhR e CYP1B1 é regulada por constitutiva AhR sinalização [41], [42], portanto, para confirmar a atividade transcricional da via de sinalização AhR, gene responsivo AhR, CYP1B1 foi medida por qRT- PCR na linha celular LNCaP sensíveis androgénio, bem como as linhas de células de cancro da próstata avançado, DU145, PC3and PC3M. células LNCaP expressa níveis mínimos de transcrição CYP1B1. DU145 e PC3 células demonstraram um aumento de 12 e 25 vezes em CYP1B1 quando em comparação com as células LNCaP. células PC3M demonstrou o maior aumento em vezes CYP1B1 com um aumento de quase 30 vezes em comparação com células LNCaP. A inibição da sinalização por Ahr inibidor directo, CH223191, resultou numa diminuição substancial nos níveis de CYP1B1 em linhas celulares de cancro da próstata avançado. Devido à expressão basal baixa de CYP1B1 em células LNCaP, CH223191 não teve nenhum efeito significativo sobre a expressão de ARNm de CYP1B1 (Fig. 3B).

IV. Ablação de Constitutivo AhR Sinalização Inibe andrógeno crescimento independente

Os dados acima demonstram a capacidade de antagonista AhR, CH223191, para inibir a sinalização AhR constitutiva. Para determinar o efeito de Ahr constitutiva de sinalização sobre a taxa de crescimento de células de cancro da próstata avançado, cada linha de células foi cultivada na ausência e na presença do inibidor específico Ahr, CH223191. LNCaP, DU145, células de cancro da próstata PC3 e PC3M foram cultivadas na presença de Ahr CH223191191 inibidor em concentrações que variam de 1 uM a 50 uM (Fig. 4a). A ablação de sinalização AhR foi suficiente para reduzir a taxa de crescimento de todas as linhas de células, incluindo as células LNCaP sensíveis andrógenos. Para confirmar os efeitos da CH223191191 foram AhR dependente, células DU145 foram transfectadas com um vector de controlo (SCR), e um vector que transporta shRNA específico para a proteína alvo AhR (-AhR). As células resultantes, que expressam AhR (SCR) e são desprovidos da proteína AhR (-AhR) foram tratadas com 50? M CH223191191 (Fig. 4B). As células (SCR) DU145 respondem ao tratamento CH223191191 com um declínio significativo na taxa de crescimento enquanto que as células da DU145 (-AhR) não exibiu resposta de crescimento para o antagonista AhR (Fig. 4B). inibição do receptor de andrógeno por Casodex só foi eficaz em células LNCaP. O tratamento de linhas celulares de cancro da próstata avançado (DU145, PC3 e PC3M) com CDX não teve nenhum efeito na taxa de crescimento. células LNCaP exibiu uma redução de 40% na taxa de crescimento na presença de CDX. CH223191 tratamento resultou na maior inibição do crescimento em células DU145. células DU145 também demonstrou a maior taxa de crescimento de todas as linhas de células sob condições de controle. Além disso, o co-tratamento com CH223191 e CDX resultou numa diminuição adicional na taxa de crescimento em comparação com CH223191 sozinho em todas as linhas celulares (Fig. 4C). A inibição do crescimento das linhas de células de cancro da próstata por CH223191191 permaneceu durante até 72 horas (Fig. 4D).

. As células foram cultivadas numa placa de 96 poços em 5,0 × 10

3 células por poço. As células foram tratadas com DMSO ou 1 uM, 5 uM, 10 uM, 25 ^ M ou 50 uM de CH223191. O crescimento celular foi medida utilizando CellTiter 96 Promega celular Ensaio de Proliferação por instruções do fabricante. B. A confirmação da expressão da proteína AHR em células DU145 com controlo scrambled vector (SCR) e shRNA lentivírus contra AhR (-AhR) por western blotting. 20 ug de proteína isolada a partir foi analisada por Western blotting. β-ação é utilizado como um controlo de carga. Proliferação de DU145 (SCR) e células DU145 (-AhR) foram analisados ​​usando o CellTiter 96 Ensaio de Proliferação celular na presença e na ausência de 50 uM de CH223191. C. As células foram cultivadas em meios despojado com carvão e tratados com DMSO (CON), 20 uM Casodex (CDX), 50 uM CH223191 ou uma combinação de CDX e CH223191 durante 72 horas. O crescimento celular foi medida utilizando CellTiter 96 Promega celular Ensaio de Proliferação por instruções do fabricante. Cada barra representa a média ± SEM (n = 3), * p 0,05. D. As células foram privadas de soro durante 24 horas e cultivadas em (CSS) media carvão despojado. As células em que, em seguida, tratados com DMSO (Con) ou 50 pM CH223191 durante um adicional de 24, 48 ou 72 horas. Em cada ponto de extremidade, as células foram analisadas quanto ao conteúdo de ADN, utilizando o ensaio de proliferação celular, tal como descrito nos materiais e métodos. Cada ponto de dados representa a média ± SEM (n = 3). (*) Indica uma diferença significativa em relação ao respectivo controle DMSO.

V. AhR acumulação nuclear no cancro da próstata Tissue

A expressão e localização de AhR foi avaliada em tecido de câncer de próstata por coloração imuno-histoquímica. Em consonância com o objetivo do presente estudo a mostrar que AhR é constitutivamente ativa no câncer de próstata avançado, avaliamos a expressão AhR em tecidos de câncer de próstata que variam de grau 1 para grau 3. Grau 1 tecidos são bem diferenciados e as células parecem normais. Grau 2 tecidos são moderadamente diferenciadas e as células parecer um pouco diferente do que o normal. Grau 3 tecidos são pouco diferenciado e as células parecem anormais e tendem a crescer e se espalhar de forma mais agressiva. 100% dos tecidos corados positivo para AhR citoplasmática. No entanto, apenas 14% de 1 grau tecidos foram positivos para AhR nuclear em comparação com 50% de tecidos de grau 2 e grau 3 de cancro (FIG. 5A e Tabela 1). A presença de Ahr nuclear no grau 2 e grau 3 tecidos juntamente com os dados in vitro, a partir das linhas celulares de cancro da próstata sugerem um AhR transcricionalmente activo nestes tumores de grau superior. Além disso, todos os tumores grau 1 positivos para AhR nuclear foram todos classificados como tumores Fase IV. Análise da expressão total de AhR revelou que Grau 2 e 3 tumores possuem significativamente mais AhR total em comparação com grau 1 de tecido (fig. 5B). Além disso, ~ 80% de tecidos com classificação de Gleason 7 ou superior aumentaram a reactividade anti-Ahr em comparação com apenas 47% de tecidos com classificação de Gleason 2-6 (Tabela 2).

. Grade Representante 1, Grau 2 e Grau tecidos de câncer de próstata 3: Painel superior coradas com anticorpo policlonal anti-AhR; painel inferior corados com hematoxilina e eosina. As setas mostram reactividade positiva anti-AHR em o núcleo de grau 2 e grau 3 tumores. reactividade B. total anti-AhR foi marcado no grau 1, tecidos de câncer de grau 2 e grau 3 da próstata com base em nível de intensidade, tanto citoplasma e núcleo (0-1).