Abstract

Fundo

células-tronco cancerosas ( CSC) conduzir a sobrevivência do tumor do câncer de próstata e de metástases. No entanto, o desenvolvimento de terapias específicas contra CSCs é dificultada pela escassez destas células em tecidos da próstata. sistemas de cultura em suspensão, têm sido relatados para enriquecer CSCs em culturas primárias e linhas de células. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a este fenómeno não foram totalmente exploradas.

Metodologia /Principais Achados

Nós descrevemos um ensaio prostasphere para o enriquecimento de CD133

+ CSCs em quatro células CaP comercial linhas: 22Rv1, DU145, LNCaP e PC3. A sobre-expressão de CD133, tal como determinado por análise de citometria de fluxo, correlacionada com um aumento da clonogénicas, resistente à quimioterapia, e potencial invasivo in vitro. Este fenótipo é concordante com a da CSCs in vivo. A expressão de genes de perfis, em seguida, foi realizada utilizando o painel de referência do cancro e o sistema de nCounter NanoString Technologies. Esta análise revelou várias transcrições regulada que podem continuar a ser exploradas como marcadores de diagnóstico ou potenciais alvos terapêuticos. Além disso, a análise sugere que anotação funcional ΔNp63α modula a activação de vias de desenvolvimento responsável pelo aumento da identidade haste de células que crescem em culturas em suspensão.

Conclusões /Significado

Concluímos que a caracterização dos mecanismos genéticos envolvidos na CSC enriquecimento nos ajudará a compreender melhor as vias moleculares que estão na base CSC fisiopatologia. Esta plataforma pode ser facilmente adaptado para enriquecer e testar amostras de pacientes reais, a fim de projetar terapias específicas do paciente que visam particularmente contra CSCs

Citation:. Portillo-Lara R, Alvarez MM (2015) Enriquecimento do Cancer Stem Fenótipo em culturas esfera de linhas celulares de cancro da próstata ocorre através da ativação de Desenvolvimento vias mediadas pela transcricional regulador ΔNp63α. PLoS ONE 10 (6): e0130118. doi: 10.1371 /journal.pone.0130118

editor: Gagan funda, Universidade do Colorado Denver, United States |

Recebido: 09 de fevereiro de 2015; Aceito: 18 de maio de 2015; Publicação: 25 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Portillo-Lara, Alvarez. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: dados mais relevantes estão dentro do papel e sua Apoiando arquivo de informação (File S1), que contém todos os valores de expressão de genes de nossos experimentos. dados de expressão de genes foram submetidos ao Gene Expression Omnibus repositório de NCBI. Os dados podem ser acessados ​​no site do GEO https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/sob o número de acesso GSE67248

Financiamento:. Os autores agradecem o financiamento da Família Zambrano-Hellion ( projeto ZH-Stem), Tecnológico de Monterrey (capital semente CAT-122) e Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACyT). Os autores são gratos a (CONACyT) para o apoio económico para RPL na forma de uma Bolsa de Doutorado

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é a segunda malignidade mais comum no homem em todo o mundo, e ainda a sua etiologia ainda é em grande parte por resolver. Como é o caso de outros tecidos epiteliais, homeostase celular na próstata adulta é mantida através de células hierarquicamente organizado com diferentes potenciais proliferativas [1]. SCs somáticas localizados no ápice desta exposição hierarquia algumas características únicas, incluindo: a capacidade de se auto-renovar e diferenciar ao longo de várias linhagens de células, crescimento localizado em microambientes fisiológicos especializados (nichos), e apesar de serem normalmente de repouso, eles exibem uma notável potencial proliferativo [2]. O modelo hierárquico de células-tronco (SC) da carcinogênese sustenta que CaP origina através de alterações de fatores genéticos e epigenéticos que regulam a proliferação de SCs normais [3]. Essas vias expressos de maneira aberrante, finalmente, levar à transformação de SCs normais em células-tronco cancerosas malignas (CSCs). CSCs reter algumas das características associadas com os seus homólogos não-malignas, e pensa-se ser responsável pela iniciação do tumor, progressão e recaída, bem como a doença metastática.

CSCs também são pensados ​​para ser responsável pelo desenvolvimento de resistência a terapias convencionais [4,5]. radioterapia tradicional e agentes quimio-terapêuticos são concebidos sob a noção de que todas as células de um tumor são fenotipicamente iguais. No entanto, os CSCs dependem de mecanismos intrínsecos que os tornam relativamente mais resistentes do que as células terminalmente diferenciadas, incluindo a sua natureza lentamente proliferação, de expressão elevada de transportadores de membrana cassete de ligação a ATP (ABC), e resistência a danos no ADN e stress oxidativo [6]. Portanto, terapias específicas-CSC têm o potencial para erradicar a doença na sua origem, e de sobra não tumorigénica SCs, minimizando assim os efeitos adversos associados com tratamentos de outra forma nondiscriminating.

metodologias atuais para o isolamento e estudo da CSCs são baseados na expressão de marcadores de superfície identificadas pela primeira vez em SCs próstata normais (CD44

+ /α

2β

1

oi /CD133

+) [7]. CD133, em particular, tem sido amplamente utilizada como um biomarcador para o isolamento de células que exibem um fenótipo de haste-como numa variedade de tecidos normais e malignos [8,9]. O estudo isolado de CSCs permite a análise de mecanismos moleculares responsáveis ​​pela sobrevivência de células malignas, separadamente daquelas que ocorrem em células de tumor ou terminalmente diferenciadas em populações SC não tumorigénicas. No entanto, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas com base na CSC-direccionamento tem sido limitada devido à falta de modelos experimentais adequados.

amostras de tumores humanos primários (PTS) são considerados como a representação mais precisa do tumor in vivo . No entanto, a complexidade do contexto fisiológico muitas vezes influencia a interpretação dos resultados. Em contraste, linhas celulares de cancro humano (CCLs) são instrumentos mais dinâmico que podem ser usados ​​para dissecar os muitos processos moleculares diferentes envolvidos na carcinogénese. Embora PTS ainda são favorecidos em detrimento CCLs, o seu acesso altamente restrito faz modelos in vitro o “go-to” escolha para muitos grupos de pesquisa em todo o mundo.

Estudos recentes têm demonstrado que CCLs são semelhantes aos tumores malignos in vivo, como eles também consistir em hierarquias organizacionais com diferentes graus de diferenciação [10-12]. Citometria de fluxo de linhas de células APC estipula que, mesmo depois de ter sido propagado durante anos, eles ainda contêm números detectáveis ​​de células-tronco semelhantes, embora muitas vezes extremamente baixas porcentagens. Pfeiffer et ai. relataram que CD133

+ células no interior da conta de linha celular DU145 de cerca de 0,01% da população total, ao passo que DuCaP, LAPC-4, LNCaP, PC3, e 22Rv1 produzir nenhuma expressão CD133 detectável, quando analisados ​​por meio de células activadas por fluorescência (FACS ) [13]. Assim, embora CCLs representam uma alternativa altamente acessível e prático para PTSs, isolamento de CSCs a partir desta fonte continua a ser difícil devido ao pequeno número de células indiferenciadas contidos em linhas de células comerciais.

sistemas de cultura de suspensão estão cada vez mais sendo usado para enriquecer populações de células indiferenciadas e em PTSs CCLs. As células propagadas utilizando substratos não-aderente e meio isento de soro crescer como aglomerados tridimensionais esferóides de células (tumorspheres) que promovem a proliferação de células progenitoras de fenótipos [14,15]. Este é um fenómeno complexo no qual as células indiferenciadas raros são estimulados a participar de divisão simétrica para expandir o compartimento do SC. Embora diversas variações do ensaio tumorsphere foram relatados, os mecanismos genéticos que provocam a proliferação das células estaminais em culturas de esferóides não foram totalmente exploradas.

a expressão do gene modernos instrumentos de análise permitem o estudo de alterações de transcrição com um aumento da sensibilidade e especificidade , em comparação com as abordagens baseadas em microarray convencionais que são limitadas pelas grandes desafios tecnológicos [16]. Por exemplo, o sistema nCounter Nanostring proporciona leituras digitais de cada molécula de um ARNm alvo, utilizando quantidades mínimas de material de partida, e sem a necessidade para a síntese de ADNc [17]. Resumidamente, esse sistema faz uso de pares de sondas de captura e repórter que são adaptados a cada sequência alvo mRNA. Após hibridação, os complexos de transcrição /sonda são imobilizadas, alinhados num campo eléctrico, identificado, e enumerada a partir de etiquetas com códigos de cores que estão acoplados à sonda repórter.

Acoplamento a dinâmica de modelos in vitro com alta gene -throughput perfil de expressão pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas CSC-orientadas mais eficazes. Aqui, nós adaptamos um protocolo de cultura tumorsphere para o enriquecimento eficaz de CD133

+ CSCs em quatro linhas de células comerciais PCA: 22Rv1, DU145, LNCaP e PC3. Todas as linhas celulares foram capazes de formar esferas altamente proliferantes auto-renovação e, quando colocadas em condições isentas de soro, independente de ancoragem que temos utilizado. Nós demonstramos que as características CSC-associados (por exemplo, expressão de CD133, bem como uma maior potencial proliferativo, invasivo, e resistente à quimioterapia) foram significativamente enriquecida em todas as culturas prostasphere. Gene perfil de expressão das culturas parentais e enriquecidos com o sistema nCounter NanoString revelou várias transcrições regulada que participam no estabelecimento do fenótipo-tronco malignas. Além disso, a anotação funcional sugere que o CSC-enriquecimento observados em culturas prostasphere ocorre através da activação de vias de desenvolvimento, em parte, modulados pelo regulador transcricional ΔNp63α.

Materiais e Métodos

linhas celulares e protocolos de cultura

Todas as linhas celulares foram adquiridos diretamente da ATCC. As células foram utilizadas nos seguintes números de passagem: 22Rv1, a passagem 11; DU145, a passagem 16; LNCaP, a passagem 13; PC3, passagem 18. Por perfil de expressão gênica experimentos, as células PC3 foram cultivadas em 6 poços ultra-baixas placas de cultura de apego com EpiGRO próstata completa Kit de mídia humana (HPCM, Millipore). Para o resto das experiências, as quatro linhas celulares foram propagadas utilizando três protocolos de cultura diferentes: a) DMEM-FBS: culturas em monocamada em meio DMEM-F12 (Gibco) suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS, Invitrogen) e 100 L /100 ug /ml de penicilina-estreptomicina (Gibco); b) DMEM-PLUS: esfera não-aderentes (prostasphere, PS) culturas cultivadas em 6 bem-placas ultra-baixa cultura de fixação (Corning) com DMEM-F12 suplementado com 20 ng /hEGF ul (Gibco), 20 ng /mL bFGF (Gibco), 1x B27, sem vitamina A (Invitrogen), 1x insulina-transferrina-selênio A (Invitrogen) e 100 U /100 ug /ml de penicilina-estreptomicina; e c) HPCM-PLUS: esfera culturas em HPCM, ainda suplementadas com 20 ng /mL hEGF e 20 ng /mL bFGF. culturas de monocamada foram mantidas a um nível máximo de 80% de confluência e o meio de cultura foi substituído a cada 48 horas. Prostasphere culturas foram semeadas a uma densidade de 2×10

4 células /ml de meio de cultura e foi completamente substituído a cada 96 horas no dia 4, e 8. As culturas parentais e prostasphere foram propagadas durante 12 dias a 37 ° C em 95% de humidade relativa em CO a 5%

2 e 95% de ar. No final do protocolo de cultura, as células em crescimento em monocamada e em suspensão as culturas foram dissociadas enzimaticamente, usando 0,05% de solução de tripsina-EDTA (Gibco) e StemPro Accutase (Gibco), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante.

rotulagem de imunofluorescência, separação de células, citometria de fluxo e análise

as células dissociadas foram marcado por fluorescência de acordo com as instruções do fabricante, usando dois anticorpos monoclonais: anti-humano CD133 /2 (293C3) -PE (Miltenyi Biotec) e Anti-Humana CD44-PE Cyanine5 (eBioscience). Magnética-activado separação de células (MACS) foi realizada utilizando microesferas anti-ficoeritrina (Miltenyi Biotec) e a /2 (293C3) -PE CD133 anticorpo monoclonal de acordo com as instruções do fabricante. A citometria de fluxo análise foi realizada com um fluxo FACSCanto citómetro II com um laser de 488 nm. Um mínimo de 10

4 eventos foi gravado para cada leitura. controlo anti-IgG2b de ratinho-PE isotipo (Miltenyi) e células não coradas foram usadas como controlos. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes.

nCounter NanoString expressão do gene de perfis.

O ARN total foi extraído a partir prostaspheres PC3 e purificou-se utilizando os kits RNeasy mini ou micro, dependendo da quantidade de material de partida (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade das amostras de ARN purificadas foi avaliada usando um NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro a 260/280 nm. A detecção de transcritos de ARNm foi então levada a cabo em reacções de hibridação multiplexados utilizando o Sistema de Análise nCounter NanoString. Dois conjuntos de códigos diferentes de Expressão Gênica nCounter foram usadas para a análise: o GX Cancer Kit Referência humano consiste de 230 genes relacionados com o cancro, eo feito por encomenda ITESM codeset que consiste em 14 genes relacionados com o PCA (NanoString Technologies). A aquisição de dados e normalização foi realizada utilizando o software de análise nSolver versão 2.0 (NanoString Technologies). Alterações médias dobra (rácios, n = 3) de cada gene foram calculados a partir de dados normalizados e classificados usando o Microsoft Excel. Genes com uma mudança vezes 1,5 foram seleccionados para posterior análise (Tabela 1). definições gerais para cada gene foram recuperados a partir da página web enciclopédia GeneCards (www.genecards.org) [18].

Prostasphere auto-renovação ensaio

A porcentagem de células em culturas enriquecidas capaz de gerar novos prostaspheres células foi determinada por plaqueamento a uma densidade de 1×10

3 células /ml nos meios de comunicação HPCM-PLUS. No dia 10 da cultura, as esferas ( 100 uM) foram marcados, dissociado, e sub-cultivadas sob as mesmas condições. Este processo foi repetido duas vezes a fim de obter 2

ND e 3

prostaspheres geração Rd em dias 20 e 30, respectivamente. Esfera eficiência formação (SFE) foi calculada como o número de prostaspheres gerados pelo número de células inoculadas, multiplicada por 100. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes. experimentos subsequentes foram realizados usando esferas de primeira geração única

células formadoras de colónias (CFC) ensaios

ensaios de CFC em suspensão foram realizadas utilizando concentrado metilcelulose StemXVivo. (R D Systems), combinada com DMEM-FBS sem vermelho de fenol ou mídia HPCM-PLUS. Resumidamente, 1×10

3 células foram semeadas em placas de petri de 35 mm com meio de cultura semi-sólido. Após 14 dias, as culturas foram visualizados sob um microscópio invertido e as colónias maiores do que 100 um foram marcados manualmente a partir de uma média de 5 campos aleatórios por prato. Para os ensaios de CFC aderentes, 1×10

3 células foram colocadas em pratos de cultura de tecidos de 35 mm tratados com DMEM-FBS ou HPCM-PLUS. Após 14 dias, as culturas foram fixadas com formaldeído a 3,7% em PBS (1X) e coradas com solução de coloração de violeta de cristal (Fisher Scientific). As colónias que consistem aproximadamente de mais de 50 células foram contadas. A análise das imagens foi realizada utilizando o software ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij). a eficiência de formação de colónias foram calculados como a percentagem de células plaqueadas que eram capazes de formar clones. Suspensão CFC experiências foram realizadas em duplicado e repetidas três vezes. experimentos aderente CFC foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes.

In vitro chemoresistance ensaio

A viabilidade celular em resposta ao fármaco quimioterápico docetaxel foi avaliada usando o CellTiter 96 AQ

ueous One Solution reagente (Promega). A sensibilidade ao fármaco basal de culturas de referência foi estabelecida por plaqueamento 1×10

4 células de todas as quatro linhas celulares aderentes de CaP em cada poço de uma placa de 96 poços em 100 ul de DMEM-F12. Após 24 horas, as células foram incubadas com 100 ul de DMEM-F12 a uma concentração final de 10, 5, 2,5, 1,25 e 0,625 ug /ml de docetaxel (Sigma-Aldrich). Em seguida, e com base no comportamento de culturas de referência expostos a concentrações crescentes de docetaxel, culturas prostasphere foram ensaiadas de um modo semelhante. Resumidamente, 1×10

4 células em monocamada, bem como CD133

+ – ordenados e não ordenados prostasphere células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma concentração final de 5 e 10 ug /ml de docetaxel em meios de cultura de 100 ul. A viabilidade das células foi determinada de acordo com as instruções do fabricante. Cada tratamento foi realizado em triplicado, e o experimento foi repetido três vezes.

In vitro membrana basal invasão matriz ensaio

O potencial invasivo de referência e enriquecido linhas celulares ACP foi avaliada utilizando o ensaio Transwell . Resumidamente, as culturas de 12 dias de idade, foram dissociadas e mantidas em DMEM-F12 isento de soro (para culturas em monocamada) e DMEM-F12 isento de soro sem vermelho de fenol (para culturas prostasphere) durante 24 horas. culturas em jejum foram então semeadas em meio isento de soro de 200 ul de 6,5 milímetros Transwell insere com uma membrana de tamanho de poro de PET 8 mícrons (Corning), revestidas com 50 ul Geltrex LDEV-livre matriz reduzida membrana basal factor de crescimento (Gibco) a uma densidade de 1×10

5 células por inserção. Um volume de 650 ul de DMEM-FBS foi adicionado à câmara inferior, como um quimioatractor. As células foram incubadas a 37 ° C e deixou-se invadir através da matriz durante 24 horas. As células não-invasoras foram cuidadosamente removido da câmara superior utilizando um cotonete. células invasoras foram fixados e corados usando solução de coloração com violeta de cristal. O número de células que migraram foi calculada a partir de imagens de cinco campos aleatórios x10 adquiridos de vista com um microscópio invertido Axiovert 200. As imagens foram analisadas utilizando o software ImageJ. Os experimentos foram realizados em duplicata e repetido duas vezes.

clustering e anotação funcional Gene Ontology (GO) análise

O DAVID funcional ferramenta de anotação [19] e a ferramenta de análise super-representação de ConsensusPathDB [20 ] foram utilizados para identificar sobre-representados vias utilizando dados de genes regulados positivamente (dobre mudança 1,5) de sinalização. enriquecimento através da análise funcional

análise estatística

Os resultados para as variáveis ​​contínuas foram expressos em média ± desvio padrão (desvio padrão). múltiplas comparações de pares foram feitas utilizando uma análise de uma via da variância (ANOVA) seguido pelo teste HSD de Tukey (* P 0,05). Todas as análises foram realizadas utilizando JMP versão 9.0.

Resultados

22Rv1, DU145, LNCaP e PC3 são capazes de crescer como esferas auto-renovação que podem ser passadas em série in vitro

Tumorsphere capacidade de formação foi avaliada utilizando uma densidade de sementeira de 2×10

4 células /ml em placas de 6 poços ultra-baixas de ligação contendo 2 mL de meio HPCM-PLUS. Todas as quatro linhas celulares de CaP formado colônias esféricas de dia 4 de cultura. culturas aderentes parentais foram propagadas simultaneamente a um nível máximo confluência de 80%. Dia 12 tumorspheres e monocamadas (Fig 1A) foram dissociadas e analisados ​​para a expressão do biomarcadores associados CSC-CD133 e CD44. A expressão de CD44 foi detectada heterogeneamente em níveis elevados em células PC3 e DU145, ao passo que a ausência de expressão mínima detectável foi observada em 22Rv1 e células LNCaP (Fig S1A). Figura 1B mostra que a CD133 foi observado consistentemente em níveis extremamente baixos ( 0,5%) em todas as linhas celulares. O painel também mostra que, em contraste com culturas parentais, a percentagem de CD133

eventos + aumentaram significativamente (

p Art 0,05) em todas as culturas prostasphere de 22Rv1 (0,067% ± 0,058% para 4,267% ± 1,419%), DU145 (0,433% ± 0,252% a 2,433% ± 0,709%), LNCaP (0,033% ± 0,058% a 4,033% ± 1,966%), e PC3 (0,133% ± 0,058% a 4,467% ± 1,358%), as células . Prostaspheres alcançado rapidamente diâmetros 100 mm por 12 dias de cultivo (Fig 2A). As células 22Rv1 e DU145 formado esferas compactas e de forma redonda com bordas bem delimitadas, enquanto o LNCaP e particularmente as células PC3 formado estruturas mais irregulares constituídos por células individuais maiores. A eficiência de formação de esfera (SFE) foi avaliada para primeiro- (Dia 10), segunda (Dia 20), e terceira (Dia 30) de geração de esferas. SFE invariavelmente aumentados (

P

0,05) com cada nova geração em todas as linhas celulares (Fig 2B). Curiosamente, a observação direta de células PC3 e DU145 cultivadas em suspensão revelou ainda brotamento de prostaspheres neste ponto (Fig S1B). Esta observação sugere a formação potencial de ramificação estruturas das esferas estabelecidas.

A) O exame microscópico de monocamadas parentais (ADH) ao lado de prostasphere-enriquecido (SUS) culturas. culturas ADH em DMEM-FBS exibem morfologia epitelial característica, e estão em estreito contacto uns com os outros. culturas SUS em HPCM-PLUS exibir morfologias heterogêneos, variando de esferas apertadas, de forma redonda (22Rv1 e DU145) para estruturas maiores e mais irregulares (LNCaP e PC3). As imagens são representativas de 12 dias de idade e culturas monocamada esfera primárias. Barra de escala = 200 pm. B) citometria de fluxo e isolada de fresco parental (ADH) e prostasphere (SUS) células para a identificação de CD133

+ subpopulações. gráficos de pontos representativos de CD133 PE-rotulados

+ (293C3) células. Percentagens apresentadas correspondem à média de três experiências independentes.

A) Caracterização morfológica de prostaspheres primários cultivados em HPCM-PLUS. Todas as linhas de células CaP formado esferas perceptíveis no dia 4 de cultura. 22Rv1 e DU145 esferas consistem de células menores e mais hermeticamente embalados juntos. células LNCaP e PC3 parecer maior e mais vagamente organizado. Barra de escala = 100 pm. eficiência B) Esfera-forming (SFE) de culturas prostasphere. CaP células foram semeadas a uma densidade de 1×10

3 células /ml em placas de 6 poços ultra-baixas de fixação em HPCM-PLUS e incubou-se durante 10 dias. Os prostaspheres resultantes poderiam ser passadas em série in vitro por até três gerações (G1-G3). SFE de esferas aumentado de forma consistente em todas as linhas de células APC com cada geração. Não existe mais nenhuma amplificação foi tentado neste ponto. Três experimentos independentes foram realizadas, cada uma em triplicado. Barra de escala = 100 pm. (*

p Art 0,05)

CD133

+ prostasphere células apresentam aumento clonogenicidade em ambos os ensaios aderentes e semi-sólidos formadoras de colónias de células (CFC)

A eficiência de formação de colónias (CFE), das culturas parentais, bem como as células derivadas de prostasphere foram testadas em paralelo em semi-sólida (Fig 3A) e (Fig 3C) ensaios aderentes CFC. valores CFE para monocamada e prostasphere culturas foram semelhantes entre os ensaios, mas observou-se uma consistentemente maior número de colónias individuais em semi-sólido (Fig 3B) em comparação com as condições aderentes (Fig 3D). Todas as quatro linhas de células enriquecida com prostasphere exibida maior clonogenicidade em ambos os ensaios em comparação com os seus homólogos não-enriquecido (

p Art 0,05). células PC3 exibiu a mais alta clonogenicidade para os ensaios semi-sólidos e aderentes. valores CFE foram consistentemente mais elevada em CD133

+ células (

p Art 0,05) em comparação com células prostasphere parentais e não separado para todas as linhas de células, exceto para a linha celular LNCaP. Nós não fomos capazes de observar uma diferença estatisticamente significativa entre CD133

+ células e prostaspheres indiferenciados (

p Art 0,05) no ensaio CFC aderente. No entanto, as células

+ LNCaP CD133 parecem ser mais do que prostaspheres clonogénico não separados ao utilizar a variante de suspensão do ensaio.

A) micrografias representativos de colónias de suspensão de parental (ADH) e CD133

células +. B) ensaio de células formadoras de colônia (CFC) Semi-sólida. Parental (ADH) e prostasphere (SUS) culturas foram dissociadas no dia 12 de cultura. CD133

+ células foram isoladas através de MACS, utilizando o anticorpo 293C3. 1×10

3 células de cada estado foram semeados em placas de Petri de 35 mm com StemXVivo metilcelulose concentrado misturado com DMEM-FBS ou HPCM-PLUS. Os resultados são expressos em média ± StdDev. (*

p Art 0,05). C) micrografias representativas de colônias aderentes de parental (ADH) e CD133

+ células. D) ensaio de células formadoras de colônia (CFC) aderente. As células foram processados ​​tal como descrito antes para o ensaio de CFC semi-sólido. Em seguida, 1×10

3 células foram semeadas em placas de petri de 35 mm com DMEM-FBS ou HPCM-PLUS. Os resultados são expressos em média ± StdDev. (*

p Art 0,05).

culturas Prostasphere são mais resistentes ao medicamento quimioterápico docetaxel

CSCs são hipótese de ser responsável pela resistência APC aos quimioterápicos drogas. Foi avaliado o quimiorresistência basal das células em monocamada parentais por incubação de todas as linhas celulares com concentrações crescentes de docetaxel (0,625-10 ng /ml) durante 24 horas (Figura 4A). A viabilidade celular diminuiu de forma consistente, mas as células LNCaP 22Rv1 e exibiram uma sensibilidade mais elevada para a droga. Observou-se uma resposta diferencial às 5 e 10 ug /ml de docetaxel; Portanto, nós utilizamos estas concentrações para posterior avaliação do chemoresistance de prostaspheres. Quimiorresistência a ambas as concentrações de Docetaxel aumentou significativamente (

P

0,05) do que a observada nas linhas celulares parentais em todas as culturas tumorsphere (Fig 4B). células DU145 Prostasphere-derivados, em particular, apresentou o maior viabilidade celular em ambas as concentrações: 85,58% ± 7,32% a 10 ug /ml, e de 91,35% ± 8,74% a 5 ug /ml. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as culturas classificadas-CD133 e prostasphere indiferenciados.

A) Estabelecimento de sensibilidade basal de culturas parentais ao docetaxel. 1×10

4 células a partir de culturas de 12 dias de idade monocamadas foram incubadas com 100 ul de DMEM-FBS numa concentração final de 10, 5, 2,5, 1,25 e 0,625 ug /ml de docetaxel. células 22Rv1 e LNCaP agrupam e exibem uma sensibilidade maior à droga em comparação com DU145 e células PC3. Os resultados são expressos em média ± StdDev. B) Avaliação da quimiorresistência de células parentais e prostasphere. culturas 1×10

4 de células aderentes (A) e prostasphere (s) foram incubados com 100 ul de meios HPCM-PLUS DMEM-FBS ou, numa concentração final de 5 e 10 ug /ml de docetaxel. Prostasphere células exibem um aumento significativo quimiorresistência de docetaxel. A Figura mostra a percentagem de células viáveis ​​em relação ao controlo não tratado. Os resultados são expressos em média ± StdDev (*

p Art 0,05).

CD133

+ prostasphere células apresentam um aumento potencial invasivo em comparação com culturas em monocamada parentais in vitro

CaP avançado tem uma tendência a se espalhar para os nódulos ósseos e linfáticos. Por isso, foi realizado um ensaio de invasão Transwell para determinar o potencial metastático das culturas parentais e enriquecidos. A seguir à incubação durante 48 horas, os números de células que invadiram através da inserção Transwell foram significativamente mais elevados para os prostaspheres do que para as células em monocamada parentais (

P

0,05) (Figura 5A). Em seguida, examinamos o papel da CD133

+ células na migração de células APC e, consequentemente, o estabelecimento de lesões metastáticas. O CD133

+ células em todas as linhas celulares eram significativamente mais invasiva do que os prostaspheres não triados (

P

0,05). Curiosamente, CD133

+ DU145 células apresentou o maior potencial invasivo (416,55 ± 40,161 /campo). Fig 5B mostra fotomicrografias representativas dos campos aleatórios com invadindo as células dos aderentes, prostasphere e CD133

+ células.

A) ensaio de invasão Transwell. 1×10

5

células parentais (ADH), prostasphere (SUS) e CD133 + foram semeadas em 200 ul sem soro DMEM-F12 sem vermelho de fenol em inserções Transwell revestidas com 50 ul do fator de crescimento Geltrex LDEV-free reduzida matriz de membrana basal. As células foram deixadas a invadir através da matriz durante 24 horas. Os resultados são expressos em média ± StdDev. (*

p Art 0,05). B) Imagens representativas de Transwell insere mostrando células coradas com solução de violeta cristal invasor.

Identificação de genes sobre-expressos em culturas enriquecidas com prostasphere e CD133

+ células

perfil de expressão gênica de tecidos de câncer tem o potencial para melhorar as classificações de diagnóstico e prognóstico atuais, e para revelar insights sobre a fisiopatologia CSC subjacente. Aqui, nós teve como objetivo identificar genes sobre-expressos em células PC3 prostasphere magneticamente ordenados e não ordenados, em comparação com culturas em monocamada parentais. dados de expressão de genes foi submetido ao Gene Expression Omnibus repositório de NCBI e pode ser acessado no site do GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sob o número de acesso GSE67248. A Tabela 1 lista transcrições upregulated (razão de 1,5) na CD133 + ordenados e não ordenados células prostasphere (Ver Tabela A em arquivo S1 para o conjunto completo de dados). Fig 6A mostra o agrupamento hierárquico das mudanças dobra relativos nos 244 genes analisados, ao longo dos 12 dias de cultura. Esta representação gráfica mostra como as condições de cultura induzir mudanças globais na expressão gênica através do tempo. Funcional agrupamento anotação de genes regulados positivamente com função biológica semelhante incluídas: proteínas contendo locais de glicosilação preditos e sequências de direccionamento-los para a via secretora, proteínas associadas a membranas, as proteínas que participam na adesão celular e organização estrutura da superfície celular, e proteínas com actividade de tirosina-quinase.

a) mapa de calor mostrando dobre mudanças na expressão gênica de prostaspheres no dia 4 (P2), dia 8 (P3), dia 12 (P4), e isolada CD133

– (P4_N) e CD133

+ (P4_P) fracções relativas a culturas parentais no dia 0. os valores correspondem à Log2 transformado proporções dos meios (n = 3). A figura mostra o comportamento dos 244 genes ensaiados ao longo do tempo, as células são mantidas em cultura. B) Gene Ontology (GO) a análise de transcritos regulada em CD133

+ células. GO processos biológicos enriquecidas em CD133

+ células estão todos relacionados com as vias de desenvolvimento (

p

* 0,01). A largura da borda reflecte a sobreposição relativa entre os nós (% genes compartilhados). A cor da borda codifica o número de membros compartilhados entre toda a categoria GO eo fundo definido pelo usuário (codesets). tamanho da esfera é relativa ao número de genes associados a essa categoria. C) interações moleculares do regulador transcricional ΔNp63α com genes regulados positivamente detectados em CD133

+ células.

ATM

,

TP63

,

IGFBP3

,

NOTCH1

,

BRCA2

,

IL1A Comprar e

TOP2

genes são regulados positivamente em CD133

+ células e parecem mediar a activação a jusante de vias moleculares de desenvolvimento. O tetrâmero ΔNp63α mostrado no centro da figura é conhecido para interagir fisicamente com estes genes. 1.3. Wang et al.